Name: production of recombinant prmt proteins using the baculovirus expression vector system
Uploaded: 2021-07-17T14:00:00
Duration: 8 min 57 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Production of Recombinant PRMT Proteins using the Baculovirus Expression Vector System at JoVE.com

Die Autoren danken Dalia Barsyte-Lovejoy dafür, dass sie sich die Zeit genommen haben, wertvolles Feedback und kritische Kommentare zum Manuskript zu geben, und allen unseren SGC-Kollegen, die mit der PRMT-Proteinfamilie aus dem Baculovirus Expression Vector System gearbeitet haben.
Die SGC ist eine eingetragene Wohltätigkeitsorganisation (Nummer 1097737), die Mittel von AbbVie, Bayer AG, Boehringer Ingelheim, Genentech, Genome Canada über das Ontario Genomics Institute [OGI-196], die EU und EFPIA über das Innovative Medicines Initiative 2 Joint Undertaking [EUbOPEN-Zuschuss 875510], Janssen, Merck KGaA (auch bekannt als EMD in Kanada und den USA), Pfizer, Takeda und den Wellcome Trust [106169/ZZ14/Z] erhält.

<ol>
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Die Autoren erklären keinen Interessenkonflikt.

Einer der Vorteile von BEVS in Insektenzellen enthält die Fähigkeit der post-translationalen Modifikationsmaschinerie, komplexere Modifikationen wie Phosphorylierung, Myristoylierung und Glykosylierung zu ermöglichen. Zusammen mit der hocheffizienten Faltung von Säugetierproteinen ermöglichen diese Modifikationen hohe Mengen an modifiziertem und gefaltetem Protein, das für physiologisch relevante nachgeschaltete Experimente geeignetist 16.
Hier beschrieben wir detaillierte Protokolle des BEVS, die kritische Elemente für ein erfolgreiches Expressionsscreening mehrerer Konstrukte von PRMT-Proteinen und die großräumige PRMT-Proteinproduktion in der Baculovirus-Expressionsplattform hervorheben: 1) Die Verwendung regelmäßiger, einstellbarer und programmierbarer Mehrkanalpipetten, um die biologischen Materialien zwischen 24- und 96 -well-Zellkulturplatten und -blöcken in den Stadien der Bacmid-DNA- und Virusgenerierung zu übertragen; eine Sammlung der rekombinanten Viren, Amplifikation der Virusvolumina der rekombinanten Viren und Herstellung der Proteinexpressions-Screening-Blöcke. 2) Leistungsstarke und kostengünstige Transfektionsreagenzien zur Erzeugung rekombinanter Viren. 3) Suspensionskultur von Baculovirus-infizierten Insektenzellen (SCBIIC) für die proteinbasierte Produktion in großem Maßstab. 4) Verwendung von 2,8 L Fernbach-Schüttelkolben mit hohem Füllvolumen zur Aufrechterhaltung der Sf9-Suspensionskultur und 2,5-L-Tunair-Schüttelkolben und 5-L-Reagenzflaschen für die proteingroße Proteinproduktion.
Besondere Überlegungen und Begründungen für die Transformations- und Transfektionsschritte. Obwohl ein kommerzielles Protokoll die Verwendung von 100 μL kompetenter Zellen für eine Transformation14empfiehlt, beträgt die Umwandlungseffizienz kommerzieller DH10Bac E. coli-kompetenter Zellen so hoch wie 1 x10 8 KBE / μg DNA, so dass wir nur 4 μL verwenden. Dies reicht für jedes Transformant aus, um isolierte weiße rekombinante Kolonien für die Bacmid-DNA-Isolierung zu erhalten. Adhärente Sf9-Zellen in der 24-Well-Transfektionsplatte wurden mit einer Zelldichte von 2 x 105 /ml in 0,5 ml serumfreier Insektenmedien ausgesät. Dieses Volumen reicht aus, um eine gleichmäßige Abdeckung der Arbeitsfläche des Brunnens zu gewährleisten. Gleichzeitig verdünnt es die Transfektionsmischung nicht zu sehr, was die Transfektionseffizienz erhöht. Transfektionsreagenzien sind für die Sf9-Zellen ungiftig, und ein Medienaustausch ist nicht erforderlich. Anstelle eines Medienwechsels werden zusätzliche 1,5 ml Medien mit 10% (v / v) FBS 4-5 Stunden nach der Transfektionszeit in die Transfektionsplatte eingelegt, um das Zellwachstum zu erleichtern. Die Transfektionseffizienz beider Transfektionsreagenzien ist hoch. Dennoch treten bei X-tremeGene 9 die Anzeichen einer Infektion in den transfizierten Zellen (Abbildung 2) 10-12 h früher auf als mit dem JetPrime-Reagenz, so dass wir zwischen diesen Reagenzien wählen, abhängig vom Arbeitsplan der nächsten Schritte in den Protokollen, was eine gewisse Flexibilität im Gesamtprozess bietet.
Das Proteintestexpressionsscreening kann mit P2-Viren eingerichtet werden, wenn die Menge der anfänglichen rekombinanten Viren, die von der Transfektionsplatte gesammelt und als P1 gekennzeichnet sind, ein limitierender Faktor für das Proteinexpressionsscreening ist.
Überlegungen beim Wechsel von kleinen zu großen Kulturvolumen. Historisch gesehen glaubte man, dass ein optimales Zellwachstum einen hohen Luftraum in der Suspensionskultur der Sf9-Zellwartung und Scale-up-Produktion erfordert. Im Jahr 2014 wurde jedoch berichtet, dass ein hoher Luftraum in Kulturschiffen weniger kritisch ist als bisher angenommen17. Ein Kulturgefäß, das mit einer entsprechend an den Orbitalwurf der Schüttelplattform angepassten Schüttelgeschwindigkeit eingerichtet ist, sorgt auch in der Suspensionskultur mit hohem Füllvolumen für einen ausreichenden Sauerstofftransfer, indem kleine Luftblasen für eine längere Zeit erzeugt und aufrechterhalten werden. Mit diesem Ansatz können kommerziell erhältliche Insektenzellen mit einer höheren Schüttelgeschwindigkeit innerhalb eines normalen Bereichs der Verdopplungszeit der Zellen kultiviert werden, ohne die hohe Zelllebensfähigkeit zu beeinträchtigen.
So haben wir vor 6 Jahren begonnen, das Suspensionskulturvolumen in einem Schüttelkolben während der Zellwartung zu erhöhen und eine andere Art von Kulturgefäß für die Proteinproduktion einzuführen, während wir die Schüttelbedingungen anpassen und überwachen (Abbildung 6). Um optimale Bedingungen in diesen Kulturgefäßen zu schaffen, überwachten wir die Sf9-Zellkulturparameter wie die Zellverdopplungszeit zusammen mit der Zelllebensfähigkeit, Größe und Form, dem Aggregationszustand und der Infektabilität der Zellen.
Zum Beispiel kulturieren wir für die Sf9-Zellerhaltung in den 2,8-L-Fernbach-Schüttelkolben 2 L anstelle von 0,8 L der Sf9-Suspensionszellen, die bei 150 U / min bei 27 ° C schütteln, und die Zelllebensfähigkeit liegt die meiste Zeit bei fast 99%, mit gleichmäßig geformten gesunden Teilungszellen. Für die Scale-up-Produktion infizieren wir 4 L Zellen in 5-L-Reagenzflaschen, die mit hoher Geschwindigkeit als 145 U / min bei einer niedrigeren Temperatur von 25 ° C schütteln. Die am häufigsten verwendeten Inkubatoren mit eingebauter Schüttelplattform können 6 x 2,8 L Schüttelkolben oder 6 x 5 L Reagenzflaschen oder 10 x 2,5 L Tunair Schüttelkolben aufnehmen. So beträgt die Kapazität der einen Schüttelplattform, wenn wir Fernbach-Schüttelkolben und Reagenzflaschen auf 1/3 gegenüber dem hohen Füllvolumen der Gefäße füllen, 4,8 L gegenüber 12 L mit 2,8 L Fernbach-Schüttelkolben und 10 L gegenüber 24 L mit 5 L Reagenzflaschen(Abbildung 6). Die Wartung der Suspensionszellkultur und die Scale-up-Produktion in den Kulturgefäßen mit hohem Füllvolumen haben uns geholfen, die Einschränkungen der Produktionsmengen zu überwinden und eine groß angelegte Plattform einzuführen. Daher ist dies sehr nützlich für Labore ohne Zugang zu Bioreaktoren und / oder begrenztem Platz in den Produktionspipelines.
Dieses Protokoll könnte leicht für die Herstellung und Aufreinigung von Proteinkonstrukten mit unterschiedlichen Affinitäts-Tags angepasst werden, indem geeignete Harze verwendet und Reinigungspuffer modifizieren werden, wie in der von SGC veröffentlichten Arbeit6 für die Flag-markierten Full-Length-Proteine von PRMT4, 7, 9 und den His-tagged PRMT5-MEP50-Komplex und PRMT6 beschrieben wurde. Obwohl wir ein BEVS-Protokoll für die PRMT-Proteinfamilie beschreiben, kann der gleiche Ansatz auf jede andere Proteinfamilie angewendet werden.

Protein Argininmethyltransferasen (PRMTs) methylat arginin Rückstände in einer Monomethyl- oder symmetrischen/asymmetrischen Dimethyl-Weise. Die sich wiederholenden RG/RGG/GRG-Sequenzen werden von den meisten PRMTs sehr bevorzugt und kommen in einer Vielzahl von Proteinen1,2vor. Argininmethylierte Proteine wie Histone oder Transkriptionsfaktoren und Spleißfaktoren regulieren Transkription, Spleißen und Chromatinstruktur3,4. Das zunehmende Wissen über die vielfältige Regulation der Substrat- und Cofaktorverwertung, des Umsatzes und der Kinetik von PRMTs sowie die Erzeugung selektiver Inhibitoren haben mechanistisches Licht auf diese Enzyme und ihre Komplexe geworfen5,6. Allerdings werden nicht alle PRMT-Familienmitglieder im gleichen Umfang untersucht; Beispielsweise wurde PRMT9 erst kürzlich als Mitglied der PRMT-Familie1entdeckt. Struktur- und Enzymfunktionsstudien für diese Proteine erfordern ausreichende, oft Milligramm, Mengen an rekombinantem Protein, um verfügbar zu sein.
Das prokaryotische Expressionssystem Escherichia coli (E. coli) ist in der Regel die erste Wahl für das Expressionsscreening unter Verwendung mehrerer Konstrukte für ein bestimmtes Protein7,8,9. Die E. coli-basierteExpression führt jedoch nicht immer zu ausreichenden Mengen an PRMT-Proteinen in ihren aktiven Formen, wie wir insbesondere für PRMT5 und PRMT7 festgestellt haben (siehe unten). So wurden PRMTs, die sich nicht in E. coli exprimierten oder von der eukaryotischen Expressionsmaschinerie produziert werden mussten, in Vektoren subkloniert, die für das Expressionsscreening im alternativen Baculovirus-Expressionsvektorsystem (BEVS) geeignet waren. Während E. coli-exprimierte Proben von PRMT1, PRMT3 und PRMT8 ausgiebig für In-vitro-Assays und Kristallographie verwendet wurden, erfordern andere PRMTs wie PRMT5, das einen MEP50-Bindungspartner seiner dualen Methyltransferase-Domäne erfordert, und PRMTs wie PRMT7 und 9 die Expression von Insektenzellen, um ausreichende Mengen an aktivem Protein zu erhalten. Insgesamt haben die standardisierten Mitteldurchsatz-Methyltransferase-Assays für PRMT4, 5, 6, 7 und 9 den BEVS in Insektenzellen6verwendet. Das Baculovirus Expression Vector System (BEVS) ist eine vielseitige Plattform zur Herstellung rekombinanter Proteine, die die eukaryotische Expressionsmaschinerie erfordern, die post translationale Modifikationen ermöglicht, die für biochemische, biophysikalische und strukturelle Studien unerlässlich sind10,11,12. Mehrere BEVS sind seit der ersten berichteten Verwendung von Baculoviren im Jahr 1983 zur Proteinexpression kommerziell verfügbar geworden13. Die meisten dieser Protokolle verwenden unterschiedliche Strategien für die Übertragung des Expressionsplasmids in Insektenzellen. Dazu gehören Bac-to-Bac, flashBAC, BaculoGOLD Bright, BacVector-3000, BacMagic, BacPAK usw. Unser Protokoll basiert auf dem am häufigsten verwendeten System in BEVS, dem Bac-to-Bac-System14, das entwickelt wurde, um das Gen / cDNA, das für das interessierende Protein (POI, hier die PRMTs) kodiert, in das Baculovirus-Genom zu übertragen, das in einem spezialisierten Stamm von E. coli über eine ortsspezifische Transposition15aufrechterhalten wird.
Kurz gesagt, der Plasmidtransfervektor, der das interessierende Gen enthält, wurde in DH10Bac E. coli-kompetente Zellen umgewandelt, um rekombinante virale Bacmid-DNA zu erzeugen. Adhärente Sf9-Zellen wurden dann mit Bacmid-DNA transfiziert. Vier bis fünf Tage nach der Transfektion wurden die ersten rekombinanten Baculoviren, die in das Zellkulturmedium sezerniert wurden, wiederhergestellt und als P1-Virus markiert. Die P1-Baculovirus-Bestände wurden dann für die Virusamplifikation (d. h. die Erzeugung von P2-Baculovirus-Beständen) und das Proteinexpressionsscreening verwendet. Basierend auf den Expressionsscreening-Ergebnissen wurden P2-Viren für das beste Expressionskonstrukt des Proteins identifiziert und verwendet, um Suspensionskulturen von Baculovirus-infizierten Insektenzellen (SCBIIS) für die groß angelegte Proteinproduktion zu erzeugen. Hier beschreiben wir unsere detaillierten Protokolle und beschreiben die Gründe für unsere Reagenz- und Kulturgefäßentscheidungen, um unsere Strategie zu unterstützen, eine zeiteffizientere, kostengünstigere und skalierbarere Methodik zu entwickeln, um ausreichende Mengen an gewünschten rekombinanten Proteinen zu erhalten.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2.8L Nalgene&#160; Fernbach Culture Flask, Polycarbonate,</td>
			<td>Nalgene</td>
			<td>29171-854</td>
			<td>For large scale maintenance of suspension culture of Sf9 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-Well Blocks RB</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>19583</td>
			<td>For incubation of&#160; 4ml of suspension&#160; Sf9 cells&#160; for protein&#160; expression screening</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-20 Criterion TGX Gel 26W 15 ul</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>5671095</td>
			<td>For SDS-PAGe analysis of the purified proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50ml Reagent Reservoir</td>
			<td>Celltreat Scientific Products</td>
			<td>229290</td>
			<td>&#160;Reservoir used for diluted transfection reagent&#160; and Sf9 cells suspension</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well cap mat, for use with square well, 2 mL</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>381080</td>
			<td>Used to cover 96 well block</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well PCR plate</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30129300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto agar</td>
			<td>BD</td>
			<td>214010</td>
			<td>For LB-agar selection paltes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Airpore Tape Sheets</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>19571</td>
			<td>To cover 24 well blocks for protein expression screening</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Allega X-15R Centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>392932</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic Antimycotic (100x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15240112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacmid DNA</td>
			<td>in-house</td>
			<td>non-catalog item</td>
			<td>Bacmid DNA for baculovirus production</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bluo-Gal, 1g</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15519028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beckman JLA 8.1000</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Plates, 24-Well, with lid, flat bottom, sterile</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30722116</td>
			<td>Tissue&#160; culture treated plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Resuspension Solution 0.5&#160;L</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>LSKCRS500</td>
			<td>For Bacmid DNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell&#160;Lysis Solution 0.5&#160;L</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>LSKCLS500</td>
			<td>For Bacmid DNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CELLSTAR&#160; Tissue Culture Plates, 96 well</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>655180</td>
			<td>For transfection mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ClipTip 1250, filter reload, sterile</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>94420818</td>
			<td>Tips for&#160; programmable and adjustable multichannel pipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP Mix (25 mM each)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>R1121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E1-ClipTip&#160; Electronic Adjustable Tip Spacing Multichannel Equalizer Pipette, 15 to 1250 &#956;L</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>4672090BT</td>
			<td>Programmable and adjustable multichannel pipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E4&#160; XLS adjustable spacer 6-channel pipette, 20-300 &#956;L</td>
			<td>Ranin</td>
			<td>LTS EA6-300XLS</td>
			<td>Ranin adjustable multichannel pipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter microplate, 96-well, polypropylene, with 25 &#181;m ultra high molecular weight polyethylene membrane</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>201005-100</td>
			<td>For protein purification in expression screening</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Full-Baffle Flask Kit Tunair, 2.5L</td>
			<td>IBI Scientific</td>
			<td>SS-6003C</td>
			<td>For large scale protein production in suspension culture of SF9 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin 10x10ml</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>15750078</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat Inactivated Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Wisent Biocenter</td>
			<td>080-450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>I-Max Insect Media W/ L-Glutamine, 1 L</td>
			<td>Wisent Biocenter</td>
			<td>301-045-LL</td>
			<td>Serum free insect cells growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>InstantBlue, Ultrafast Protein Stain</td>
			<td>Expedeon Protein Solutions</td>
			<td>ISB1L-1L</td>
			<td>For protein gel (SDS-PAGE) staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iptg, Ultra Pure, Dioxane Free, Min 99.5%</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>IPT001.100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JetPRIME Transfection Reagent&#160; Provided with&#160; jetPRIME buffer</td>
			<td>POLYPLUS TRANSFECTION Inc</td>
			<td>114-01</td>
			<td>For Sf9 cells transfection to generate baculovirus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin Monosulfate</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>KAN201.100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lb Broth (Lennox), Powder Microbial Gro&#38;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L3022-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterblock 96 deep well 2.4mL</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>780285-FD</td>
			<td>Used in the transformation and expression screening procedures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Max Efficiency DH10Bac Competent Cells , 0.5ml</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>10361012</td>
			<td>Competent cells for bacmid DNA generation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mLINE 12-Channel Pipette, adjustable 30 - 300 uL</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>Sartorius 725240</td>
			<td>12 channel pipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neutralization Solution, 0.5&#160;L</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>LSKNS0500</td>
			<td>For bacmid DNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>New Brunswick&#160; Innova 44R, 120V, orbit 2.5 cm (1 in)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>M1282-0004</td>
			<td>Shaker incubator for incubaion of suspension of Sf9 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA Agarose</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>30250</td>
			<td>For protein purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>LS15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PYREX&#160; Delong Shaker Erlenmeyer Flask with Baffles, Corning&#160; 500ml</td>
			<td>Pyrex</td>
			<td>4444-500</td>
			<td>For&#160; suspension culture of Sf9 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PYREX Delong Shaker Erlenmeyer Flask with Baffles, Corning&#160; 125ml</td>
			<td>Pyrex</td>
			<td>4444-125</td>
			<td>For suspension culture of Sf9 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PYREX Delong Shaker Erlenmeyer Flask with Baffles, Corning&#160; 250ml</td>
			<td>Pyrex</td>
			<td>4444-250</td>
			<td>For suspension culture of Sf9 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RedSafe&#160;Nucleic&#160;Acid&#160;Staining&#160;Solution</td>
			<td>Froggabio</td>
			<td>21141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase A, 0.9&#160;mL</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>LSKPMRN30</td>
			<td>For suspension buffer for bacmid DNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roll &#38; Grow Spherical Glass Plating Beads</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>115000550</td>
			<td>For&#160; spread&#160; of bacterial&#160; cells across the surface of an agar plate.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RT-LTS-A-300&#956;L-768/8 (tips)</td>
			<td>Ranin</td>
			<td>30389253</td>
			<td>Tips for ranin multichannel pipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S.O.C. Medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15544034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serum, Cell Culture, Fetal Bovine Serum (Fbs), Hyclone, Characterized Canadian</td>
			<td>cytivalifesciences</td>
			<td>SH3039602</td>
			<td>Addition to the serum free medim for&#160; the transfected cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sf9 cells</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>12659017</td>
			<td>Insect cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sfx-Insect Cell Culture Media</td>
			<td>Cytiva (Formerly GE Healthcare Life Sciences)</td>
			<td>SH3027802</td>
			<td>Serum free insect cells growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tape Pad</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>19570</td>
			<td>Tape Pad</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taq DNA Polymerase with ThermoPol Buffer - 2,000 units</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0267L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetracycline Hcl</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>TET701.10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue 0.4% Solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15250061</td>
			<td>For&#160; assessment of cell viability</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VITLAB&#160; Reagent Bottles, PP with Screw Caps, PP, BrandTech, 5L</td>
			<td>VITLAB</td>
			<td>V100889</td>
			<td>For large scale protein production in suspension culture of Sf9 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR&#160; Digital Mini Incubator</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10055-006</td>
			<td>Incubator for adherent Sf9 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR&#160; Incubating Microplate Shaker</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97043-606</td>
			<td>Incubator for suspension culture of Sf9 cells in 24 well blocks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Petri Dishes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>CA73370-037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-tremeGene 9 DNA&#160; Transfection Reagent&#160; 1.0 M</td>
			<td>Roche</td>
			<td>6365787001</td>
			<td>For Sf9 cells transfection to generate recombinant baculovirus</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

production of recombinant prmt proteins using the baculovirus expression vector system

Protein-Arginin-Methyltransferasen (PRMTs) Methylat-Arginin-Rückstände auf einer Vielzahl von Proteinen, die in zahlreichen zellulären Prozessen eine Rolle spielen. PRMTs können entweder Mono- oder Dimethylat-Arginin-Guanidino-Gruppen symmetrisch oder asymmetrisch anmuten. Die Enzymologie dieser Proteine ist ein komplexes und intensiv untersuchtes Gebiet, das Milligrammmengen an hochwertigem rekombinantem Protein benötigt. Das Baculovirus Expression Vector System (BEVS), das Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus (AcMNPV) und Spodoptera frugiperda 9 (Sf9) Insektenzellen verwendet, wurde für das Expressionsscreening und die Produktion vieler PRMTs, einschließlich PRMT 1, 2 und 4 bis 9, verwendet. Um gleichzeitig nach der Expression mehrerer Konstrukte dieser Proteine zu suchen, einschließlich Domänen und abgeschnittenen Fragmenten sowie der Proteine in voller Länge, haben wir skalierbare Methoden mit einstellbaren und programmierbaren Mehrkanalpipetten in Kombination mit 24- und 96-Well-Platten und -Blöcken angewendet. Insgesamt ermöglichten diese Methodenanpassungen eine groß angelegte Erzeugung von Bacmid-DNA, rekombinanten Viren und Proteinexpressionsscreening. Die Verwendung von Kulturgefäßen mit einem hohen Füllvolumen an Sf9-Zellsuspension trug dazu bei, Platzbeschränkungen in der Produktionspipeline für die Großproteinproduktion in Einzelchargen zu überwinden. Hier beschreiben wir detaillierte Protokolle zur effizienten und kostengünstigen Expression funktioneller PRMTs für biochemische, biophysikalische und strukturelle Studien.

Eine Übersicht über das BEVS-Protokoll finden Sie in Abbildung 1. Mehrere Expressionskonstrukte von PRMTs, einschließlich Domänen in voller Länge und abgeschnittener Fragmente, wurden am Structural Genomics Consortium (SGC, Toronto) nach internen Strategien generiert, um die Erfolgsrate für die Identifizierung löslicher und stabiler Proteine mit einem relativ hohen Expressionsniveau zu erhöhen7,9. Interessierte Leser werden ermutigt, die Definitionen und die Methodik des SGC für die Gestaltung eines "Fragments" als Segment der Gensequenz, das in einen Expressionsklon integriert ist, "Domäne" als PFAM-annotierte Strukturdomäne und "Konstrukt" als das in einem Expressionsvektor geklonte Fragment zu überprüfen, die alle in einer früheren Veröffentlichung ausführlich beschrieben wurden7. Expressionskonstrukte von PRMTs, die in diesem Protokoll vorgestellt werden, sind für die Produktion der polyhistidin-markierten Proteine, die in den pFBOH-MHL-Vektor geklont werden, der ein Derivat des pFastBac1-Vektors ist. In Abbildung 4zeigen wir die SDS-PAGE-Analyse der his-markierten löslichen Konstrukte von PRMT1, 2, 4-9, die aus Pellets gereinigt wurden, die nach 4 ml Produktion in Sf9-Zellen gesammelt wurden (Schritt 3.1.4). Full-Length (FL) PRMT1 und PRMT9 werden in diesem Gel nicht präsentiert, da FL PRMT1 aus E. colihergestellt wurde und FL PRMT9 aus BEVS durch Flag-Tag6gereinigt wurde. Die abgeschnittenen Konstrukte von PRMT1, FL PRMT4 und allen PRMT8-Konstrukten zeigen eine relativ hohe Ausbeute, aber Proteinelfuate enthalten Fraktionen von co-gereinigten Verunreinigungen. Diese Konstrukte erfordern eine weitere Optimierung der Reinigungsprotokolle. Daher sind zusätzliche Ansätze erforderlich, um die Reinheit dieser Proteine aus Scale-up-Produktionen zu verbessern, wie z.B. eine Verringerung der Menge an Nickelperlen im Stadium der Inkubation mit einem geklärten Lysat; eine Erhöhung der Imidazolkonzentrationen in den Waschpuffern; Spaltung des His-Tags mit TEV-Protease, gefolgt von der Anwendung auf einem Ni-affinen Harz; und zusätzliche Reinigungsschritte wie Größenausschluss und Ionenaustauschchromatographie. Die Konstrukte von PRMT2 zeigen im Vergleich zu anderen Proteinen und PRMT2-Proteinen in voller Länge, begleitet von einem starken Schadstoffband, eine signifikant geringere Ausbeute. Die Scale-up-Produktion und zwei Reinigungsschritte wie IMAC und Größenausschluss bestätigten ein niedriges Expressionsniveau für dieses Konstrukt zusammen mit dem anhaltenden Vorhandensein des co-reinigenden Schadstoffs für das FL-Protein. Für den PRMT5-Komplex wurden reine Proteine gewonnen, die mit seinem obligaten Bindungspartner MEP50 hergestellt und gereinigt wurden. Das abgeschnittene Konstrukt von PRMT9 hat im Vergleich zu anderen PRMTs ein fast zwei- oder dreifach niedrigeres Expressionsniveau von fast 1,5 mg / L. Dennoch wurden die rekombinanten Virusbestände dieses Konstrukts für die Scale-up-Produktion verwendet, beugende Kristalle wurden erhalten und die Struktur wurde für dieses Protein zusammen mit PRMT4, 6 und 7 gelöst (Abbildung 5).
Für die Scale-up-Produktionen wurden die entsprechenden P2-Viren verwendet, um die Suspensionskultur von Sf9-Insektenzellen zu infizieren. Dieser Schritt erzeugt 50/100/200 ml Baculovirus-infizierte Zellen, die infizierte Zellen und P3-Viren im Überstand enthalten. Für die großtechnische Proteinproduktion wurden 2 L Sf9-Zellen in jeweils 2,8 L Fernbach-Schüttelkolben bei 150 U/min, 27 °C kultiviert(Abbildung 6). Am Tag der Produktion wurden 2 l Sf9-Zellen (Zelllebensfähigkeit > 97%) in 2,5 L Tunair Schüttelkolben oder 4 L in 5 L Reagenzflaschen wurden auf eine Zelldichte von 4 x 106/mlverdünnt. Diese Zellen wurden direkt mit 10-12 ml/L Suspensionskultur von Baculovirus-infizierten Insektenzellen infiziert und bei einer niedrigeren Temperatur von 25 °C bei 145 U/min inkubiert. Die direkte Infektion der Produktionscharge mit einer Suspensionskultur von Baculovirus-infizierten Insektenzellen reduzierte die mühsamen und zeitaufwändigen Schritte bei der Virusvolumenamplifikation signifikant, ohne die zusätzliche Handhabung der infizierten Zellen, und vermied eine Verringerung des Titer- und Virusabbaus. SF9-Zellkulturpflege und Scale-up-Produktion wurden in den Kulturgefäßen mit einem hohen Füllvolumen durchgeführt, um eine groß angelegte Proteinproduktion in der einen Charge zu übernehmen (Abbildung 6).
PRMT 4, 5 (im Komplex mit MEP50), 6, 7 und 9 Proteinen in voller Länge, die aus der Baculovirus-vermittelten Produktionsplattform hergestellt wurden, wurden für die kinetische Charakterisierung und das Inhibitor-Compound-Screening am SGC6verwendet. Kristallstrukturen wurden gelöst und in der Protein Data Bank (PDB) für die vollständigen oder abgeschnittenen Formen der Proteine PRMT 4, 6, 7 und 9 mit verschiedenen chemischen Sonden und Inhibitoren abgelagert. Expressionsplasmide für diese PRMTs wurden im Addgene-Plasmid-Repository deponiert (Addgene ist ein Vertriebspartner des SGC, https://www.addgene.org/) und stehen der Forschungsgemeinschaft zur Verfügung (Abbildung 5).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62510/62510fig01.jpg"> Abbildung 1: Schematische Übersicht der Schritte des Baculovirus-Expressionsprozesses <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62510/62510fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62510/62510fig02.jpg"> Abbildung 2: Baculovirus-infizierte und nicht infizierte Sf9-Zellen. Anzeichen einer Infektion sind strukturelle Veränderungen in den Insektenzellen, wie eine 25-50% ige Zunahme des Zelldurchmessers, vergrößerte Zellkerne, gleichmäßig abgerundete Form, Verlust der Proliferation und Adhärenz an der Oberfläche der Kulturschale sowie eine Abnahme der Zelllebensfähigkeit. Weißer Maßstab Balken 200 μm. Die hier dargestellten Anzeichen einer Infektion sind für die transfizierten Zellen, die beide Transfektionsreagenzien, JetPrime und X-tremeGene 9, verwenden, gleich. Das gezeigte Beispiel ist für das JetPrime-Transfektionsreagenz. (A) Nicht infizierte Sf9-Zellen als Kontrolle. B)Mit dem Baculovirus infizierte Sf9-Zellen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62510/62510fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62510/62510fig03.jpg"> Abbildung 3: Bindeplattenanordnung zur schnellen Aufreinigung von Testexpressionsproteinen. Bitte beachten Sie den Text für Details, Schritte 3.2.1-2 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62510/62510fig03large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62510/62510fig04.jpg"> Abbildung 4: Ergebnisse des Proteinexpressions-Screenings. Proteinexpressionsscreening-Ergebnisse der Baculovirus-vermittelten Proteinproduktion in 4 ml Sf9-Suspensionskultur, die mit entsprechenden P1-rekombinanten Viren für verschiedene PRMTs und den PRMT5-MEP50-Komplex infiziert ist. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62510/62510fig04large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62510/62510fig05.jpg"> Abbildung 5: Zusammenfassung der Expressionskonstrukte für PRMT4, 6, 7 und 9, die für Kristallstrukturstudien am Structural Genomics Consortium, Toronto (SGC) verwendet werden. Die Kristallstrukturen wurden gelöst und in der Protein Data Bank (PDB) für die volle Länge oder abgeschnittene Formen der Proteine PRMT 4, 6, 7 und 9 mit verschiedenen chemischen Sonden und Inhibitoren abgelagert. Expressionsplasmide für diese PRMTs wurden im Addgene-Plasmid-Repository deponiert und stehen der Forschungsgemeinschaft zur Verfügung (Addgene ist ein Vertriebspartner des SGC, https://www.addgene.org/). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62510/62510fig05large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62510/62510fig06.jpg"> Abbildung 6: Sf9 Insektenzellerhaltung und Proteinproduktion in den verschiedenen Kulturgefäßen: (A) 2,8 L Fernbachkolben für Zellerhaltung und Proteinproduktion. Durch den Einsatz des 72%igen Füllvolumens erhöht sich die Durchsatzrate um das 2,5-fache in einer Schüttelplattform. (B) Tunair-Schüttelkolben (nur 9 von 10 Kolben sind in diesem Bild dargestellt) und Reagenzflaschen mit einem Füllvolumen von 80 % erhöhen die Produktionskapazität der Schüttelplattform drastisch. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62510/62510fig06large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>

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Production of Recombinant PRMT Proteins using the Baculovirus Expression Vector System

Das Baculovirus Expression Vector System (BEVS) ist eine robuste Plattform für das Expressionsscreening und die Produktion von Protein-Arginin-Methyltransferasen (PRMTs), die für biochemische, biophysikalische und strukturelle Studien verwendet werden sollen. Für die meisten PRMTs und andere Proteine von Interesse, die eine eukaryotische Expressionsplattform benötigen, können Milligrammmengen an Material produziert werden.

Herstellung rekombinanter PRMT-Proteine unter Verwendung des Baculovirus Expression Vector System

Protein arginine methyltransferases (PRMTs) methylate arginine residues on a wide variety of proteins that play roles in numerous cellular processes. ...

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist das Expressionsscreening eines multiplen Konstrukts von Protein-Arginin-Methyltransferasen in der Großproduktion, um die Milligrammmenge des Proteins für biochemische, biophysikalische und strukturelle Studien im mediumgestützten, kosteneffizienten Modus in der Abdeckung der Expressionsplattform S, Baculovirus-Expressionsvektorsystem zu erhalten. Dr.Alma Seitova wird die folgenden Schritte vorstellen. Verdünnen Sie die exponentiell wachsenden SF9-Zellen auf die endgültige Zelldichte von 0,4 Millionen Promille in den serumfreien Insektenmedien und gießen Sie sie in das sterile Reagenzreservoir.Verwenden Sie eine programmierbare Mehrkanalpipette, um 0,5 mils der verdünnten SF9-Zellen in jede Vertiefung der 24-Well-Platte zu säen. Dieses Volumen reicht aus, um eine gleichmäßige Abdeckung der Arbeitsfläche des Brunnens zu gewährleisten. Gleichzeitig verdünnt es die Transfektionsmischung nicht zu sehr, was eine Transfektionseffizienz ermöglicht.Kennzeichnen Sie eine Vertiefung der Platte nur als Zelle und verwenden Sie sie als Kontrolle für den Vergleich der transfizierten und nicht transfizierten Zelle, um mögliche Anzeichen einer Infektion zu beurteilen. Inkubieren Sie die Platten bei 27 Grad, bis etwa eine Stunde benötigt wird, damit sich die Zellen an den Zellkulturplatten anheften. Gut gemischtes Transfektionsreagenz in das unergänzliche Insektenmedium und ein steriles Reagenzreservoir verdünnen und 10 Sekunden lang vorsichtig mischen.Übertragen Sie mit einer 12-Kanal-Pipette 102 Mikroliter des verdünnten Transaktionsreagenz in eine sterile 96 MicroWell-Platte. 10 Mikroliter 0,2 Mikrogramm pro Mikroliter rekombinanter Bacmid-DNA in die entsprechende Vertiefung der 96-Well-MicroWell-Platte geben und durch sanftes Schütteln mischen und die Platte von den Seiten klopfen. Inkubieren Sie die Transfektionsmischung für 15 bis 20 Minuten für eine komplexe Formation.Mit einer einstellbaren Sechskanalpipette, die für den Transfer zwischen einer 96- und einer 24-Well-Platte ausgelegt ist, überlagern Sie die Transfektionsmischung tropfenweise auf die Zellen in entsprechenden Vertiefungen der Transfektionsplatten und inkubieren Sie sie vier Stunden lang bei 27 Grad. Um eine gleichmäßige Verteilung der Transfektionsmischung über die Monoschicht der Zellen zu gewährleisten, schaukeln Sie die Platten während der Inkubationszeit mehrmals sanft hin und her. Vier bis fünf Stunden nach der Transfektionszeit 1,5 Mil serumfreie Insektenmedien hinzufügen.Ergänzen Sie es mit 10% final hitzeinaktiviertem fetalem Rinderserum und 1% Antibiotikum und Antimykotika. Inkubieren Sie die Zellen in einem 27-Grad-Inkubator für 72 bis 96 Stunden. Schaufeln Sie die Transfektionsplatten nach Möglichkeit einmal täglich vorsichtig.Suchen Sie nach Anzeichen einer Infektion, die in transfizierten Zellen 72 bis 96 Stunden nach der Transfektion zeigen. Vier bis fünf Tage nach der Transfektion sollten Anzeichen einer Infektion in den transfizierten Zellen im Vergleich zu den Kontrollzellen unter einem invertierten Mikroskop erkennbar sein, und die anfänglichen rekombinanten Baculoviren, die in das Zellkulturmedium sezerniert werden, sollten bereit sein, sich zu sammeln. Verwenden Sie einen programmierbaren elektronischen Mehrkanal, um gleichzeitig die Sammlung von P1-Viren, die Infektion von frisch gesäten SF9-Zellen bei der Infektion von Suspensionszellen in ihren 24 Brunnenblöcken mit 150 Mikrolitern der P1-Viren zu ermöglichen.Spinnen Sie den Rest der kollektiven P1-Virusbestände für 15 Minuten herunter, bedecken Sie die 24 Bohrlöcher mit Suspensionskultur der infizierten SF9-Zellen mit einem AirPore-Blatt. Inkubieren Sie den 24-Well-Block bei 27 Grad mit Schütteln bei 245 U / min für 72 bis 96 Stunden. Vier Tage vor der geplanten Produktionszeit wurden exponentiell wachsende SF9-Zellen mit einer endgültigen Zelldichte von 2 Millionen Promille in Erlenmeyerglas-Schüttelseide mit Schallwänden in serumfreien Insektenmedien mit 1% endgültigem Antibiotikum und Antimykotika aufgeteilt.Dieser Schritt erzeugt eine Suspensionskultur von infizierten Insektenzellen und P2-Viren im Überstand für die Infektion neuer Zellen in der Produktionscharge. Fügen Sie die entsprechenden P2-Viren hinzu und inkubieren Sie infizierte Zellen bei der niedrigeren Temperatur von 25 Grad, um das Zellwachstum zu verlangsamen, und schütteln Sie bei 165 U / min auf einem Orbitalschüttler mit einem Ein-Zoll-Schlag. Vier Tage vor der geplanten Produktionszeit säen zwei Liter exponentiell wachsende SF9-Zellen in insektenserumfreien Medien auf die Zelldichte von 1 Million Promille, in den 2,8-Liter-Fernbach-Schüttelkolben.Schütteln Sie den Kolben bei 27 Grad mit schütteln bei 150 U / min. Forscher Ashley Hutchinson wird das folgende Protokoll demonstrieren. Vier Liter exponentiell wachsende SF9-Zellen und insektenserumfreie Medien bis zur endgültigen Zelldichte von 4 Millionen promille in die großen Fünf-Liter-Reagenzflaschen aufteilen.Fügen Sie 10 bis 12 mils der Suspensionskultur der mit dem Baculovirus infizierten Insektenzellen hinzu. Inkubieren Sie die infizierte Kultur der SF9-Zellen in einem Shaker, der 72 bis 96 Stunden lang 145 U / min bei einer niedrigeren Temperatur von 25 Grad Celsius ausschüttet. Milligrammmengen mehrerer rekombinanter Proteine aus der PRMT-Familie exprimieren in der Baculovirus-Sofortproduktion in SF9-Zellen werden für biochemische biophysikalische Lehrstudien verwendet, wie in Abbildung fünf zu sehen ist.Am SGC wurden Kristallstrukturen gelöst, die in der Proteindatenbank für die volle Länge oder abgeschnittene Formen der Proteine PRMT4, 6, 7 und 9 mit verschiedenen chemischen Sonden und Inhibitoren abgelagert wurden. Expressionsplasmide für diese PRMTs wurden hinterlegt, um die Gensammlung durch SGC hinzuzufügen und stehen der Forschungsgemeinschaft zur Verfügung. In diesem Video haben wir Schlüsselelemente für ein erfolgreiches Expeditionsscreening ihres multiplen Konstrukts des Proteins Argininmethyltransferasen in der großtechnischen Produktion im Baculovirus-Expressionssystem hervorgehoben.Die Verwendung der regulären einstellbaren und programmierbaren Mehrkanalpipetten machte ihren gesamten Prozess schneller als effizient. Die Verwendung von hochleistungsfähigen und weniger zelltoxischen für die Zellen, Transfektionsreagenz zur Erzeugung rekombinanter Viren führte zu einem kostengünstigeren und zellhandhabungsvolleren Transfektionsprotokoll. Die Infektion der groß angelegten Charge zur Proteinproduktion mit einer Suspensionskultur des Baculovirus, die in sechs Zellen infiziert ist, reduzierte die Arbeit in einem zeitaufwändigen Schritt bei der Vitalstarteramplifikation signifikant.Ist zum Beispiel das Zentrifugieren mit spezieller Kultur infizierter Zellen. Das ist natürlich ausgeschlossen, die zusätzliche Handhabung der infizierten Zellen in ihrem engeren Virusabbau zu vermeiden. Die Aufrechterhaltung von Suspensionskulturkulturzellen in dieser Scale-up-Produktion im Kulturgefäß war ein hohes Feldvolumen, das uns half, die Begrenzung des Produktionsvolumens zu überwinden und eine große Plattform einzuführen.Dies ist sehr nützlich für Labore ohne Zugang zu den Bioreaktoren oder begrenzten Platz in der Produktionspipeline. Obwohl unser Protokoll für die Proteine der Protein-Arginin-Methyltransferasen-Familie beschrieben wurde, kann der gleiche Ansatz auf jede andere Proteinfamilie angewendet werden, die eine Expressionsplattform benötigt, um eine ausreichende Menge ihres Proteins für biochemische biophysikalische Lehrstudien zu erhalten.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Recombinant Protein Expression, Crystallization, and Biophysical Studies of a Bacillus-conserved Nucleotide Pyrophosphorylase, BcMazG

Recombinant Protein Expression, Crystallization, and Biophysical Studies of a Bacillus-conserved Nucleotide Pyrophosphorylase, BcMazG

Rekombinante Protein Expression, Kristallisation und biophysikalische Studien von a<em&gt; Bacillus</em&gt; -konservierte Nucleotid-Pyrophosphorylase, BcMazG

To overcome safety restrictions and regulations when studying genes and proteins from true pathogens, their homologues can be studied. Bacillus anthracis ...

Forschung

Biochemie

Transient Expression in Nicotiana Benthamiana Leaves for Triterpene Production at a Preparative Scale

Transient Expression in Nicotiana Benthamiana Leaves for Triterpene Production at a Preparative Scale

Transiente Expression in Nicotiana Benthamiana Blätter für Triterpene Produktion im präparativen Maßstab

The triterpenes are one of the largest and most structurally diverse families of plant natural products. Many triterpene derivatives have been shown to ...

Modifying Baculovirus Expression Vectors to Produce Secreted Plant Proteins in Insect Cells

Pflanzliche Proteine in Insektenzellen abgesondert ändern Baculovirus Expressionsvektoren herstellen

It has been a challenge for scientists to express recombinant secretory eukaryotic proteins for structural and biochemical studies. The ...

Large-scale Production of Recombinant RNAs on a Circular Scaffold Using a Viroid-derived System in Escherichia coli

Large-scale Production of Recombinant RNAs on a Circular Scaffold Using a Viroid-derived System in Escherichia coli

Großtechnische Produktion von rekombinanten RNAs auf einem kreisförmigen Gerüst mit einem Viroid-abgeleitete System bei Escherichia coli

With increasing interest in RNA biology and the use of RNA molecules in sophisticated biotechnological applications, the methods to produce large amounts ...

Use of Recombinant Fusion Proteins in a Fluorescent Protease Assay Platform and Their In-gel Renaturation

Einsatz von rekombinanten Fusionsproteinen in eine fluoreszierende Protease-Assay-Plattform und ihre In-Gel-Renaturierung

Proteases are intensively studied enzymes due to their essential roles in several biological pathways of living organisms and in pathogenesis; therefore, ...

Localization of SUMO-modified Proteins Using Fluorescent Sumo-trapping Proteins

Lokalisierung von SUMO-modifizierten Proteinen mit fluoreszierenden Sumo-Fallen Proteinen

Here we are presenting a novel method to study the sumoylation of proteins and their sub-cellular localization in mammalian cells and nematode oocytes. ...

Expression, Purification, Crystallization, and Enzyme Assays of Fumarylacetoacetate Hydrolase Domain-Containing Proteins

Expression, Reinigung, Kristallisation und Enzym-Assays von Fumarylacetoacetat-Hydrolase-Domänen-haltigen Proteinen

Fumarylacetoacetate hydrolase (FAH) domain-containing proteins (FAHD) are identified members of the FAH superfamily in eukaryotes. Enzymes of this ...

Characterization of Membrane Transporters by Heterologous Expression in E. coli and Production of Membrane Vesicles

Characterization of Membrane Transporters by Heterologous Expression in E. coli and Production of Membrane Vesicles

Charakterisierung von Membrantransportern durch heterologen Ausdruck in E. coli und Herstellung von Membranvesikeln

Several methods have been developed to functionally characterize novel membrane transporters. Polyamines are ubiquitous in all organisms, but polyamine ...

Transverse Sectioning of Mature Rice (Oryza sativa L.) Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Transverse Sectioning of Mature Rice Oryza sativa L. Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Querschnitt von reifem Reis (Oryza sativa L.) Kerne für die Rasterelektronenmikroskopie-Bildgebung mit Pipettenspitzen als Immobilisierungsunterstützung

Starch granules (SGs) exhibit different morphologies depending on the plant species, especially in the endosperm of the Poaceae family. Endosperm ...

Cell-Free Production of Proteoliposomes for Functional Analysis and Antibody Development Targeting Membrane Proteins

Zellfreie Produktion von Proteoliposomen für die funktionelle Analyse und Antikörperentwicklung gegen Membranproteine

Membrane proteins play essential roles in a variety of cellular processes and perform vital functions. Membrane proteins are medically important in drug ...