Name: production of recombinant prmt proteins using the baculovirus expression vector system
Uploaded: 2021-07-17T14:00:00
Duration: 8 min 57 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Production of Recombinant PRMT Proteins using the Baculovirus Expression Vector System at JoVE.com

המחברים מבקשים להודות לדליה Baryte-Lovejoy על שהנצלה את הזמן כדי לספק משוב יקר ערך והערות ביקורתיות על כתב היד ועל כל עמיתינו SGC שעבדו עם משפחת החלבונים PRMT לידי ביטוי ממערכת וקטור הביטוי Baculovirus.
SGC הוא ארגון צדקה רשום (מספר 1097737) שמקבל כספים מ- AbbVie, באייר AG, בוהרינג'ר אינגלהיים, ג'נטק, גנום קנדה באמצעות מכון גנומיקה באונטריו [OGI-196], האיחוד האירופי ו- EFPIA באמצעות היוזמה לתרופות חדשניות 2 התחייבות משותפת [מענק EUbOPEN 875510], ינסן, מרק KGaA (aka EMD בקנדה ובארה"ב), פייזר, טקדה וקרן Wellcome [106169/ZZ14/Z].

<ol>
	<li>Guccione, E., Richard, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+regulation,+functions+and+relevance+of+arginine+methylation.">The regulation, functions and relevance of arginine methylation.</a> Nature Reviews in Molecular Cell Biology. 20 (10), 642-657 (2019).</li><li>Thandapani, P., O'Connor, T. R., Bailey, T. L., Richard, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+the+RGG/RG+motif.">Defining the RGG/RG motif.</a> Molecular Cell. 50 (5), 613-623 (2013).</li><li>Lorton, B. M., Shechter, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+consequences+of+arginine+methylation.">Cellular consequences of arginine methylation.</a> Cell and Molecular Life Sciences. 76 (15), 2933-2956 (2019).</li><li>Bedford, M. T., Clarke, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+arginine+methylation+in+mammals:+Who,+what,+and+why.">Protein arginine methylation in mammals: Who, what, and why.</a> Molecular Cell. 33 (1), 1-13 (2008).</li><li>Frankel, A., Brown, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+kinetic+data:+What+the+numbers+tell+us+about+PRMTs.">Evaluation of kinetic data: What the numbers tell us about PRMTs.</a> Biochimica Biophysica Acta Proteins Proteomics. 1867 (3), 306-316 (2018).</li><li>Li, A. S. M., Li, F., Eram, M. S., Bolotokova, A., Dela Se&#241;a, C. C., Vedadi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+probes+for+protein+arginine+methyltransferases.">Chemical probes for protein arginine methyltransferases.</a> Methods. 175, 30-43 (2020).</li><li>Savitsky, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+production+of+human+proteins+for+crystallization:+The+SGC+experience.">High-throughput production of human proteins for crystallization: The SGC experience.</a> Journal of Structural Biology. 172, 3-13 (2010).</li><li>Gileadi, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expressing+the+human+proteome+for+affinity+proteomics:+Optimizing+expression+of+soluble+protein+domains+and+in+vivo+biotinylation.">Expressing the human proteome for affinity proteomics: Optimizing expression of soluble protein domains and in vivo biotinylation.</a> New Biotechnology. 29 (5), 515-525 (2012).</li><li>Graslund, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+production+and+purification.">Protein production and purification.</a> Nature Methods. 5, 135 (2008).</li><li>Kost, T. A., Condreay, J. P., Jarvis, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Baculovirus+as+versatile+vectors+for+protein+expression+in+insect+and+mammalian+cells.">Baculovirus as versatile vectors for protein expression in insect and mammalian cells.</a> Nature Biotechnology. 23, 567-575 (2005).</li><li>Jarvis, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Baculovirus-insect+cell+expression+systems.">Baculovirus-insect cell expression systems.</a> Methods in Enzymology. 463, 191-222 (2009).</li><li>Shrestha, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Baculovirus+expression+vector+system:+an+emerging+host+for+high-throughput+eukaryotic+protein+expression.">Baculovirus expression vector system: an emerging host for high-throughput eukaryotic protein expression.</a> Methods in Molecular Biology. 439, 269-289 (2008).</li><li>Smith, G. E., Summers, M. D., Fraser, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+human+beta+interferon+in+insect+cells+infected+with+a+baculovirus+expression+vector.">Production of human beta interferon in insect cells infected with a baculovirus expression vector.</a> Molecular Cell Biology. 3, 2156-2165 (1983).</li><li>Invitrogen Life Technologies. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Invitrogen, Bac-to-Bac Baculovirus expression system. , (2010).</li><li>Luckow, V. A., Lee, S. C., Barry, G. F., Olins, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+generation+of+infectious+recombinant+baculoviruses+by+site-specific+transposon-mediated+insertion+of+foreign+genes+into+a+baculovirus+genome+propagated+in+Escherichia+coli.">Efficient generation of infectious recombinant baculoviruses by site-specific transposon-mediated insertion of foreign genes into a baculovirus genome propagated in Escherichia coli.</a> Journal of Virology. 67, 4566-4579 (1993).</li><li>Irons, S. L., Chambers, A. C., Lissina, O., King, L. A., Possee, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+Production+Using+the+Baculovirus+Expression+System.">Protein Production Using the Baculovirus Expression System.</a> Current Protocol in Protein Sciences. 91, 1-22 (2018).</li><li>Rieffel, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insect+cell+culture+in+reagent+bottles.">Insect cell culture in reagent bottles.</a> MethodsX. 1, 155-161 (2014).</li></ol>

המחברים מצהירים שאין ניגוד עניינים.

אחד היתרונות של BEVS בתאי חרקים מתמקד ביכולת של מכונות שינוי שלאחר תרגום כדי לאפשר שינויים מורכבים יותר כגון זרחון, myristoylation, ו glycosylation. יחד עם קיפול יעיל מאוד של חלבוני יונקים, שינויים אלה להקל על כמויות גבוהות של חלבון שונה ומקופל מתאים ניסויים רלוונטיים מבחינה פיזיולוגית במורד הזרם16.
כאן, תיארנו פרוטוקולים מפורטים של ה- BEVS המדגישים אלמנטים קריטיים לסינון ביטוי מוצלח של מבנים מרובים של חלבוני PRMT וייצור חלבון PRMT בקנה מידה גדול בפלטפורמת הביטוי של Baculovirus: 1) השימוש בפיפטות רב-ערוציות רגילות, מתכווננות וניתנות לתכנות להעברת החומרים הביולוגיים בין 24 ל -96 - צלחות ותרבות תאים היטב ובלוקים בשלבים של DNA bacmid ווירוס; אוסף של וירוסים רקומביננטיים, הגברה של כמויות ויראליות של וירוסים רקומביננטיים והכנת בלוקים הקרנת ביטוי חלבון. 2) ביצועים גבוהים ריאגנטים transfection חסכוני עבור הדור של וירוסים רקומביננטיים. 3) תרבות השעיה של תאי חרקים נגועים בבקולווירוס (SCBIIC) לייצור חלבונים בקנה מידה גדול. 4) ניצול של נפח מילוי גבוה 2.8 L Fernbach לנער בקבוקים כדי לשמור על תרבות המתלים Sf9 ו 2.5 L Tunair לנער בקבוקים ו 5 בקבוקי ריאגנט L לייצור חלבון בקנה מידה גדול.
שיקולים ונימוקים מיוחדים לצעדי הטרנספורמציה וההתמרה. למרות פרוטוקול מסחרי ממליץ להשתמש 100 μL של תאים מוסמכים עבור טרנספורמציה אחת14, יעילות הטרנספורמציה של DH10Bac מסחרי E. coli תאים מוסמכים הוא גבוה ככל 1 x 108 cfu / מיקרוגרם DNA, ולכן אנו משתמשים רק 4 μL. זה מספיק עבור כל טרנספורמנט כדי להשיג מושבות רקומביננטיות לבנות מבודדות לבידוד DNA bacmid. תאי Sf9 חסידים בלוח 24-טוב transfection היו זרעים בצפיפות התא של 2 x 105 / מ"ל ב 0.5 מ"ל של מדיה חרקים ללא סרום. נפח זה מספיק כדי להבטיח כיסוי שווה של משטח העבודה של הבאר. במקביל, זה לא לדלל את תערובת transfection יותר מדי, אשר משפר את יעילות transfection. ריאגנטים של טרנז-פגז אינם רעילים לתאי Sf9, ואין צורך בחילופי מדיה. במקום שינוי מדיה, 1.5 מ"ל נוספים של מדיה המכילה 10% (v / v) FBS מתווסף ללוח transfection ב 4-5 שעות לאחר transfection זמן כדי להקל על צמיחת התא. יעילות ההשתנות של שני ריאגנטים transfection הוא גבוה. ובכל זאת, עם X-tremeGene 9, סימני ההדבקה בתאים החודרים (איור 2) מופיעים 10-12 שעות מוקדם יותר מאשר עם מגיב JetPrime, ולכן אנו בוחרים בין ריאגנטים אלה בהתאם ללוח הזמנים של העבודה של השלבים הבאים בפרוטוקולים, המספק גמישות מסוימת בתהליך הכולל.
ניתן להגדיר בדיקת חלבון עם וירוסי P2 אם כמות הנגיפים הרקומביננטיים הראשוניים, שנאספו מלוח ההעתקה ומסומנים כ- P1, היא גורם מגביל לשימוש להקרנת ביטוי החלבון.
שיקולים בעת מעבר מנפחי תרבות קטנים לגדולים. מבחינה היסטורית, האמינו כי צמיחת תאים אופטימלית דורשת מרחב אוויר גבוה בתרבות המתלים של תחזוקת תא Sf9 והפקות בקנה מידה. עם זאת, בשנת 2014 דווח כי מרחב אווירי גבוה בכלי תרבות הוא פחות קריטי ממה שחשבו קודם לכן17. ספינת תרבות שהוקמה תוך שימוש במהירות טלטול מותאמת כראוי לזריקה מסלולית של הפלטפורמה הרועדת תספק העברת חמצן מספקת גם בתרבות המתלים של נפח מילוי גבוה על ידי יצירה ותחזוקה של בועות אוויר קטנות למשך זמן רב יותר. עם גישה זו, תאי חרקים זמינים מסחרית יכולים להיות תרבית במהירות רועדת גבוהה יותר בטווח נורמלי של זמן הכפלת התאים מבלי להקריב את הכדאיות הגבוהה של התא.
כך, לפני 6 שנים, התחלנו להגדיל את נפח תרבות המתלים בבקבוק רועד במהלך תחזוקת התאים והכנסנו סוג אחר של כלי תרבות לייצור חלבונים תוך התאמה וניטור של תנאי טלטול (איור 6). כדי לקבוע תנאים אופטימליים בכלי תרבות אלה, ניטרנו את הפרמטרים של תרבות התאים Sf9 כגון זמן הכפלת תאים יחד עם הכדאיות של התא, הגודל והצורה, מצב הצבירה ויכולת ההדבקה של תאים.
לדוגמה, עבור תחזוקת תא Sf9, בבקבוקי טלטול 2.8 L Fernbach, אנו תרבות 2 L במקום 0.8 L של תאים תלויים Sf9 רועד ב 150 סל"ד ב 27 °C (69 °F) ואת הכדאיות התא רוב הזמן קרוב 99%, עם תאים מפרידים בריאים בצורה שווה. לייצור קנה מידה, אנו מדביקים 4 L של תאים בבקבוקי ריאגנט 5 L רועדים במהירות גבוהה כמו 145 סל"ד בטמפרטורה נמוכה של 25 °C (69 °F). האינקובטורים הנפוצים ביותר עם פלטפורמה מובנית לרעוד יכולים להכיל 6 בקבוקי טלטול 2.8 L או בקבוקי ריאגנט 6 x 5 L, או בקבוקי טלטול Tunair 10 x 2.5 L. כך, הקיבולת של הפלטפורמה המטלטלת האחת, אם נמלא בקבוקי טלטול של פרנבך ובקבוקי ריאגנט ל-1/3 לעומת נפח המילוי הגבוה של כלי השיט היא 4.8 ליטר לעומת 12 ל' באמצעות בקבוקי טלטול 2.8 ל' פרנבך ו-10 ל' לעומת 24 ל' בבקבוקי ריאגנט 5 ל'(איור 6). תחזוקת תרבות תאי ההשעיה וייצור בקנה מידה גדול בכלי התרבות עם נפח מילוי גבוה עזרו לנו להתגבר על מגבלות של נפחי הייצור ולאמץ פלטפורמה בקנה מידה גדול. לכן, זה מאוד שימושי עבור מעבדות ללא גישה bioreactors ו / או שטח מוגבל בצינורות הייצור.
פרוטוקול זה יכול להיות מותאם בקלות לייצור וטיהור של מבני חלבון עם תגי זיקה שונים על ידי שימוש שרפים מתאימים ושינוי מאגרי טיהור כפי שתואר במאמר שפורסם SGC6 עבור הדגל מתויג חלבונים באורך מלא של PRMT4, 7, 9, ואת שלו מתויג PRMT5-MEP50 מורכב PRMT6. למרות שאנו מתארים פרוטוקול BEVS עבור משפחת החלבונים PRMT, אותה גישה יכולה להיות מיושמת על כל משפחת חלבונים אחרת.

חלבון ארגינין מתילטרנספראז (PRMTs) שאריות מתילאט ארגינין בצורה מונומטיל או סימטרי / אסימטרי דימתיל. רצפי RG/RGG/GRG החוזרים ונשנים מועדפים מאוד על ידי רוב ה- PRMTs ונמצאים במגוון רחב של חלבונים1,2. ארגינין חלבונים מתילציה כגון היסטון או גורמי שעתוק וגורמי שחבור לווסת שעתוק, שחבור, מבנה כרומטין3,4. ידע גובר של רגולציה מגוונת של מצע וניצול קופקטור, מחזור, קינטיקה של PRMTs, כמו גם הדור של מעכבים סלקטיביים, שפכו אור מכני על אנזימים אלה ואת המורכבים שלהם5,6. עם זאת, לא כל בני משפחת PRMT נחקרים באותה מידה; לדוגמה, PRMT9 התגלה רק לאחרונה כחבר במשפחת PRMT1. מחקרי מבנה ותפקוד אנזים עבור חלבונים אלה דורשים מספיק, לעתים קרובות מיליגרם, כמויות של חלבון רקומביננטי כדי להיות זמין.
מערכת הביטוי פרוקריוטית Escherichia coli (E. coli) היא בדרך כלל הבחירה הראשונה להקרנת ביטוי תוך שימוש במספר מבנים עבור חלבון נתון7,8,9. עם זאת, ביטוי מבוסס E. coliלא תמיד לגרום בכמויות מספיקות של חלבוני PRMT בצורות הפעילות שלהם, כפי שציינו במיוחד עבור PRMT5 ו PRMT7 (ראה להלן). לפיכך, PRMTs שלא הצליחו לבטא ב- E. coli או היה צורך להיות מיוצר על ידי מכונות ביטוי eukaryotic היו subcloned לתוך וקטורים המתאימים הקרנת הביטוי במערכת וקטור ביטוי baculovirus חלופי (BEVS). בעוד E. coli הביע דגימות של PRMT1, PRMT3 ו PRMT8 נוצלו בהרחבה עבור במבחנה assays ו קריסטלוגרפיה, PRMTs אחרים כגון PRMT5, אשר דורש MEP50 שותף מחייב של תחום מתיל טרנספראז כפול שלה, ו PRMTs כגון PRMT7 ו 9, מחייב ביטוי תא חרקים כדי להשיג כמות מספקת של חלבון פעיל. בסך הכל, מבחני המתיל-טרנספראז הסטנדרטיים בעלי התפוקה הבינונית עבור PRMT4, 5, 6, 7 ו-9 ניצלו את ה- BEVS בתאי חרקים6. מערכת וקטור הביטוי baculovirus (BEVS) היא פלטפורמה רב-תכליתית לייצור חלבונים רקומביננטיים הדורשים את מכונות הביטוי האירו-קריוטי המאפשרות שינויים פוסט-תרגומיים החיוניים למחקרים ביוכימיים, ביופיזיים ומבניים10,11,12. מספר BEVSs הפכו זמינים מסחרית מאז השימוש המדווח הראשון של baculoviruses בשנת 1983 עבור ביטוי חלבון13. רוב הפרוטוקולים הללו משתמשים באסטרטגיות שונות להעברת הביטוי פלסמיד לתאי חרקים. אלה כוללים Bac-to-Bac, flashBAC, BaculoGOLD בהיר, BacVector-3000, BacMagic, BacPAK, וכו '. הפרוטוקול שלנו מבוסס על המערכת הנפוצה ביותר ב- BEVS, מערכת Bac-to-Bac14, אשר נועד להעביר את הגן / cDNA קידוד החלבון של עניין (POI, כאן PRMTs) לתוך הגנום baculovirus נשמר בזן מיוחד של E. coli באמצעות טרנספוזיציה ספציפית לאתר15.
בקצרה, וקטור העברת פלסמיד המכיל את הגן של עניין הפך DH10Bac E. coli תאים מוסמכים כדי ליצור DNA bacmid ויראלי רקומביננטי. תאי Sf9 חסידים היו אז מודבקים עם DNA bacmid. ארבעה עד חמישה ימים לאחר transfection, baculoviruses רקומביננטי הראשונית מופרש לתוך המדיום תרבות התא נמצאו ו מתויגים כנגיף P1. מניות P1 baculovirus שימשו אז להגברת וירוסים (כלומר, דור של מניות P2 baculovirus) והקרנת ביטוי חלבון. בהתבסס על תוצאות סינון הביטוי, וירוסי P2 עבור מבנה הביטוי הטוב ביותר של החלבון זוהו ושימשו ליצירת תרביות השעיה של תאי חרקים נגועים בבולווירוס (SCBIIS) לייצור חלבונים בקנה מידה גדול. כאן, אנו מתארים את הפרוטוקולים המפורטים שלנו ומתארים את הרציונל מאחורי הבחירות שלנו לריג'נט וכלי תרבות כדי לתמוך באסטרטגיה שלנו לפתח מתודולוגיה יעילה יותר, חסכונית ומדרגית יותר כדי להשיג כמויות מספיקות של חלבונים רקומביננטיים רצויים.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2.8L Nalgene&#160; Fernbach Culture Flask, Polycarbonate,</td>
			<td>Nalgene</td>
			<td>29171-854</td>
			<td>For large scale maintenance of suspension culture of Sf9 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-Well Blocks RB</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>19583</td>
			<td>For incubation of&#160; 4ml of suspension&#160; Sf9 cells&#160; for protein&#160; expression screening</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-20 Criterion TGX Gel 26W 15 ul</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>5671095</td>
			<td>For SDS-PAGe analysis of the purified proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50ml Reagent Reservoir</td>
			<td>Celltreat Scientific Products</td>
			<td>229290</td>
			<td>&#160;Reservoir used for diluted transfection reagent&#160; and Sf9 cells suspension</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well cap mat, for use with square well, 2 mL</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>381080</td>
			<td>Used to cover 96 well block</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well PCR plate</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30129300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto agar</td>
			<td>BD</td>
			<td>214010</td>
			<td>For LB-agar selection paltes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Airpore Tape Sheets</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>19571</td>
			<td>To cover 24 well blocks for protein expression screening</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Allega X-15R Centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>392932</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic Antimycotic (100x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15240112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacmid DNA</td>
			<td>in-house</td>
			<td>non-catalog item</td>
			<td>Bacmid DNA for baculovirus production</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bluo-Gal, 1g</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15519028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beckman JLA 8.1000</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Plates, 24-Well, with lid, flat bottom, sterile</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30722116</td>
			<td>Tissue&#160; culture treated plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Resuspension Solution 0.5&#160;L</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>LSKCRS500</td>
			<td>For Bacmid DNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell&#160;Lysis Solution 0.5&#160;L</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>LSKCLS500</td>
			<td>For Bacmid DNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CELLSTAR&#160; Tissue Culture Plates, 96 well</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>655180</td>
			<td>For transfection mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ClipTip 1250, filter reload, sterile</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>94420818</td>
			<td>Tips for&#160; programmable and adjustable multichannel pipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP Mix (25 mM each)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>R1121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E1-ClipTip&#160; Electronic Adjustable Tip Spacing Multichannel Equalizer Pipette, 15 to 1250 &#956;L</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>4672090BT</td>
			<td>Programmable and adjustable multichannel pipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E4&#160; XLS adjustable spacer 6-channel pipette, 20-300 &#956;L</td>
			<td>Ranin</td>
			<td>LTS EA6-300XLS</td>
			<td>Ranin adjustable multichannel pipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter microplate, 96-well, polypropylene, with 25 &#181;m ultra high molecular weight polyethylene membrane</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>201005-100</td>
			<td>For protein purification in expression screening</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Full-Baffle Flask Kit Tunair, 2.5L</td>
			<td>IBI Scientific</td>
			<td>SS-6003C</td>
			<td>For large scale protein production in suspension culture of SF9 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin 10x10ml</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>15750078</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat Inactivated Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Wisent Biocenter</td>
			<td>080-450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>I-Max Insect Media W/ L-Glutamine, 1 L</td>
			<td>Wisent Biocenter</td>
			<td>301-045-LL</td>
			<td>Serum free insect cells growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>InstantBlue, Ultrafast Protein Stain</td>
			<td>Expedeon Protein Solutions</td>
			<td>ISB1L-1L</td>
			<td>For protein gel (SDS-PAGE) staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iptg, Ultra Pure, Dioxane Free, Min 99.5%</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>IPT001.100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JetPRIME Transfection Reagent&#160; Provided with&#160; jetPRIME buffer</td>
			<td>POLYPLUS TRANSFECTION Inc</td>
			<td>114-01</td>
			<td>For Sf9 cells transfection to generate baculovirus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin Monosulfate</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>KAN201.100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lb Broth (Lennox), Powder Microbial Gro&#38;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L3022-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterblock 96 deep well 2.4mL</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>780285-FD</td>
			<td>Used in the transformation and expression screening procedures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Max Efficiency DH10Bac Competent Cells , 0.5ml</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>10361012</td>
			<td>Competent cells for bacmid DNA generation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mLINE 12-Channel Pipette, adjustable 30 - 300 uL</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>Sartorius 725240</td>
			<td>12 channel pipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neutralization Solution, 0.5&#160;L</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>LSKNS0500</td>
			<td>For bacmid DNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>New Brunswick&#160; Innova 44R, 120V, orbit 2.5 cm (1 in)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>M1282-0004</td>
			<td>Shaker incubator for incubaion of suspension of Sf9 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA Agarose</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>30250</td>
			<td>For protein purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>LS15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PYREX&#160; Delong Shaker Erlenmeyer Flask with Baffles, Corning&#160; 500ml</td>
			<td>Pyrex</td>
			<td>4444-500</td>
			<td>For&#160; suspension culture of Sf9 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PYREX Delong Shaker Erlenmeyer Flask with Baffles, Corning&#160; 125ml</td>
			<td>Pyrex</td>
			<td>4444-125</td>
			<td>For suspension culture of Sf9 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PYREX Delong Shaker Erlenmeyer Flask with Baffles, Corning&#160; 250ml</td>
			<td>Pyrex</td>
			<td>4444-250</td>
			<td>For suspension culture of Sf9 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RedSafe&#160;Nucleic&#160;Acid&#160;Staining&#160;Solution</td>
			<td>Froggabio</td>
			<td>21141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase A, 0.9&#160;mL</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>LSKPMRN30</td>
			<td>For suspension buffer for bacmid DNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roll &#38; Grow Spherical Glass Plating Beads</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>115000550</td>
			<td>For&#160; spread&#160; of bacterial&#160; cells across the surface of an agar plate.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RT-LTS-A-300&#956;L-768/8 (tips)</td>
			<td>Ranin</td>
			<td>30389253</td>
			<td>Tips for ranin multichannel pipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S.O.C. Medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15544034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serum, Cell Culture, Fetal Bovine Serum (Fbs), Hyclone, Characterized Canadian</td>
			<td>cytivalifesciences</td>
			<td>SH3039602</td>
			<td>Addition to the serum free medim for&#160; the transfected cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sf9 cells</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>12659017</td>
			<td>Insect cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sfx-Insect Cell Culture Media</td>
			<td>Cytiva (Formerly GE Healthcare Life Sciences)</td>
			<td>SH3027802</td>
			<td>Serum free insect cells growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tape Pad</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>19570</td>
			<td>Tape Pad</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taq DNA Polymerase with ThermoPol Buffer - 2,000 units</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0267L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetracycline Hcl</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>TET701.10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue 0.4% Solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15250061</td>
			<td>For&#160; assessment of cell viability</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VITLAB&#160; Reagent Bottles, PP with Screw Caps, PP, BrandTech, 5L</td>
			<td>VITLAB</td>
			<td>V100889</td>
			<td>For large scale protein production in suspension culture of Sf9 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR&#160; Digital Mini Incubator</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10055-006</td>
			<td>Incubator for adherent Sf9 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR&#160; Incubating Microplate Shaker</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97043-606</td>
			<td>Incubator for suspension culture of Sf9 cells in 24 well blocks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Petri Dishes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>CA73370-037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-tremeGene 9 DNA&#160; Transfection Reagent&#160; 1.0 M</td>
			<td>Roche</td>
			<td>6365787001</td>
			<td>For Sf9 cells transfection to generate recombinant baculovirus</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

production of recombinant prmt proteins using the baculovirus expression vector system

חלבון ארגינין מתילטרנספראז (PRMTs) שאריות מתילאט ארגינין על מגוון רחב של חלבונים הממלאים תפקידים בתהליכים תאיים רבים. PRMTs יכולים או מונו או דימתילאט קבוצות ארגינין guanidino סימטרית או א-סימטרית. האנזימולוגיה של חלבונים אלה היא אזור מורכב ונחקר מאוד הדורש כמויות מיליגרם של חלבון רקומביננטי באיכות גבוהה. מערכת וקטור הביטוי baculovirus (BEVS) העסקת אוטוגרפיה californica נוקליאופוליהדרווירוס מרובים (AcMNPV) ו Spodoptera frugiperda 9 (Sf9) תאים חרקים שימש עבור ביטוי הקרנה וייצור של PRMTs רבים, כולל PRMT 1, 2, ו 4 עד 9. כדי להקרין בו זמנית את הביטוי של מבנים מרובים של חלבונים אלה, כולל תחומים ושברים חתוכים, כמו גם חלבונים באורך מלא, יישמנו שיטות מדרגיות תוך שימוש פיפטות רב ערוצי מתכוונן לתכנות, בשילוב עם 24- ו 96-באר צלחות בלוקים. בסך הכל, התאמות שיטה אלה אפשרו יצירה בקנה מידה גדול של DNA bacmid, וירוסים רקומביננטיים, הקרנת ביטוי חלבון. שימוש בכלי תרבות עם נפח מילוי גבוה של השעיית תאי Sf9 עזר להתגבר על מגבלות שטח בצנרת הייצור לייצור חלבון בקנה מידה גדול אצווה אחת. כאן, אנו מתארים פרוטוקולים מפורטים לביטוי יעיל וחסכוני של PRMTs פונקציונליים למחקרים ביוכימיים, ביופיזיים ומבניים.

מבט כולל על פרוטוקול BEVS מתואר באיור 1. מבנים ביטוי מרובים של PRMTs, כולל אורך מלא, תחומים, שברים קטועים, נוצרו בקונסורציום גנומיקה מבנית (SGC, טורונטו) על פי אסטרטגיות בתוך הבית בניסיון להגדיל את שיעור ההצלחה לזיהוי חלבונים מסיסים ויציבים עם רמת ביטוי גבוהה יחסית7,9. הקוראים המעוניינים מוזמנים לסקור את ההגדרות והמתודולוגיה של SGC של עיצוב "קטע" כמקטע של רצף הגנים המשולב בשיבוט ביטוי, "תחום" כתחום מבני מבואר PFAM, ו "לבנות" כמו שבר משובט וקטור ביטוי, כולם תוארו בפירוט בפרסום מוקדםיותר 7. מבני ביטוי של PRMTs המוצגים בפרוטוקול זה הם לייצור של חלבונים מתויגים פוליהיסטידין משובטים לתוך וקטור pFBOH-MHL, שהוא נגזרת של וקטור pFastBac1. באיור 4, אנו מציגים ניתוח SDS-PAGE של המבנים המסיסים שלו מתויגים של PRMT1, 2, 4-9 מטוהרים מכדורים שנאספו לאחר 4 מ"ל של ייצור בתאי Sf9 (שלב 3.1.4). אורך מלא (FL) PRMT1 ו PRMT9 אינם מוצגים בג'ל זה, מאז FL PRMT1 הופק E. coli, ו FL PRMT9 המיוצר BEVS כבר מטוהר על ידי דגל תג6. המבנים הקצוצים של PRMT1, FL PRMT4, וכל מבני PRMT8 מראים תפוקה גבוהה יחסית, אך אלוטים של חלבונים מכילים שברים של מזהמים מטוהרים במשותף. מבנים אלה דורשים אופטימיזציה נוספת של פרוטוקולי הטיהור. לכן נדרשות גישות נוספות כדי לשפר את טוהר החלבונים הללו מייצורים בקנה מידה גדול, כגון הפחתה בכמות חרוזי הניקל בשלב הדגירה עם ליזאט מובהק; עלייה של ריכוזי imidazole במאגרי לשטוף; מחשוף של התג שלו עם פרוטאז TEV, ואחריו יישום על שרף ני-זיקה; וכן, שלבי טיהור נוספים כגון אי-הכללת גודל וכרומטוגרפיה של חילופי יון. המבנים של PRMT2 מראים תפוקה נמוכה משמעותית בהשוואה לחלבונים אחרים וחלבון PRMT2 באורך מלא המלווה ברצועת מזהמים חזקה. ייצור בקנה מידה ושני שלבים של טיהורים כגון IMAC והדרת גודל אישרו רמת ביטוי נמוכה עבור מבנה זה יחד עם נוכחות מתמשכת של מזהם טיהור משותף עבור חלבון FL. חלבונים טהורים הושגו עבור קומפלקס PRMT5 המיוצר ומטוהר עם השותף המחייב שלו, MEP50. המבנה הקצוב של PRMT9 כולל רמת ביטוי נמוכה כמעט פי שניים או שלושה, קרוב ל-1.5 מ"ג/ליטר, בהשוואה ל- PRMTs אחרים. עם זאת, המלאי הוויראלי הרקומביננטי של מבנה זה שימש לייצור בקנה מידה גדול, גבישים מפענחים הושגו, והמבנה נפתר עבור חלבון זה יחד עם PRMT4, 6 ו - 7 (איור 5).
עבור הפקות קנה המידה, וירוסי P2 המקביל שימשו כדי להדביק את תרבות ההשעיה של תאי חרק Sf9. שלב זה יוצר 50/100/200 מ"ל של תאים נגועים baculovirus המכיל תאים נגועים וירוסים P3 ב supernatant. לייצור חלבונים בקנה מידה גדול, 2 L של תאי Sf9 היו תרבית בכל אחד 2.8 L Fernbach לנער בקבוקונים ב 150 סל"ד, 27 °C(איור 6). ביום הייצור, 2 L של תאי Sf9 (הכדאיות של התא > 97%) בבקבוקי טלטול 2.5 L Tunair או 4 L בבקבוקי ריאגנט 5 L היו מדוללים לצפיפות תאים של 4 x 106/ mL. תאים אלה היו נגועים ישירות עם 10-12 mL / L של תרבות ההשעיה של תאי חרקים נגועים baculovirus ודגר בטמפרטורה נמוכה של 25 °C (69 °F), ב 145 סל"ד. זיהום של אצוות הייצור ישירות עם תרבות ההשעיה של תאי חרקים נגועים baculovirus הפחית באופן משמעותי צעדים מייגעים וגוזלים זמן בהגברת נפח הנגיף, למעט טיפול נוסף של התאים הנגועים, ונמנע הפחתה titer ו וירוס השפלה. תחזוקת תרבות התאים SF9 וייצור בקנה מידה נעשה בכלי התרבות עם נפח מילוי גבוה לאמץ ייצור חלבון בקנה מידה גדול באצווה אחת (איור 6).
PRMT באורך מלא 4, 5 (במתחם עם MEP50), 6, 7, ו 9 חלבונים המיוצרים פלטפורמת הייצור בתיווך Baculovirus שימשו לאפיון קינטי הקרנה תרכובת מעכבת ב SGC6. מבני קריסטל נפתרו והופקדו בבנק נתוני החלבון (PDB) עבור הצורות באורך מלא או קטועות של החלבונים PRMT 4, 6, 7 ו- 9 עם בדיקות ומעכבים כימיים שונים. פלסמידים של ביטוי עבור PRMTs אלה הופקדו במאגר פלסמיד Addgene (Addgene הוא שותף הפצה של SGC, https://www.addgene.org/) והם זמינים לקהילת המחקר (איור 5).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62510/62510fig01.jpg"> איור 1: סקירה סכמטית של השלבים של תהליך הביטוי baculovirus <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62510/62510fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62510/62510fig02.jpg"> איור 2: תאי Sf9 נגועים ולא נגועים. סימני זיהום הם שינויים מבניים בתאי החרקים, כגון עלייה של 25-50% בקוטר התא, גרעיני תאים מוגדלים, צורה מעוגלה אחידה, אובדן התפשטות והקפדה על משטח צלחת התרבות, כמו גם ירידה בכדאיות התא. סרגל בקנה מידה לבן 200 מיקרומטר. סימני הזיהום המוצגים כאן זהים עבור התאים החודרים באמצעות ריאגנטים של טרנס-פקטיטור, JetPrime ו- X-tremeGene 9. הדוגמה המסוימת המוצגת היא עבור מגיב transfection JetPrime. (A) תאי Sf9 לא מודבקים כפקד. (B)תאי Sf9 נגועים בבקולווירוס. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62510/62510fig02large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62510/62510fig03.jpg"> איור 3: הרכבת לוח כריכה לטיהור מהיר של חלבוני ביטוי הבדיקה. אנא עיין בטקסט לקבלת פרטים, שלבים 3.2.1-2 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62510/62510fig03large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62510/62510fig04.jpg"> איור 4: תוצאות הקרנת ביטוי חלבון. תוצאות הקרנת ביטוי חלבון של ייצור החלבון בתיווך baculovirus ב 4 מ"ל של תרבות ההשעיה Sf9 נגוע וירוסים רקומביננטיים P1 המקביל עבור PRMTs שונים קומפלקס PRMT5-MEP50. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62510/62510fig04large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62510/62510fig05.jpg"> איור 5: סיכום מבני ביטוי עבור PRMT4, 6, 7 ו- 9 המשמשים למחקרי מבנה גביש בקונסורציום הגנומיקה המבנית, טורונטו (SGC). מבני הגביש נפתרו והופקדו בבנק נתוני החלבון (PDB) עבור צורות אורך מלא או קטוע של חלבונים PRMT 4, 6, 7, ו 9 עם בדיקות כימיות שונות ומעכבים. פלסמידים ביטוי עבור PRMTs אלה הופקדו למאגר פלסמיד Addgene והם זמינים לקהילת המחקר (Addgene הוא שותף הפצה של SGC, https://www.addgene.org/). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62510/62510fig05large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62510/62510fig06.jpg"> איור 6: תחזוקת תאי חרקים Sf9 וייצור חלבונים בכלי התרבות השונים: (A) בקבוק 2.8 L פרנבך לתחזוקת תאים וייצור חלבונים. השימוש בנפח מילוי של 72% מגדיל את קצב התפוקה פי 2.5 בפלטפורמה רועדת אחת. (B)בקבוקי טלטול Tunair (רק 9 בקבוקונים מתוך 10 מוצגים בתמונה זו) ובקבוקי ריאגנט עם נפח מילוי של 80% מגדילים באופן דרסטי את כושר הייצור של הפלטפורמה הרועדת. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62510/62510fig06large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Production of Recombinant PRMT Proteins using the Baculovirus Expression Vector System at JoVE.com

Production of Recombinant PRMT Proteins using the Baculovirus Expression Vector System

מערכת וקטור הביטוי של baculovirus (BEVS) היא פלטפורמה איתנה להקרנת ביטוי וייצור של חלבון ארגינין מתילטרנספראזים (PRMTs) שישמשו למחקרים ביוכימיים, ביופיזיים ומבניים. כמויות מיליגרם של חומר יכול להיות מיוצר עבור רוב PRMTs וחלבונים אחרים של עניין הדורש פלטפורמת ביטוי eukaryotic.

ייצור חלבוני PRMT רקומביננטיים באמצעות מערכת וקטור הביטוי של Baculovirus

Protein arginine methyltransferases (PRMTs) methylate arginine residues on a wide variety of proteins that play roles in numerous cellular processes. ...

המטרה הכוללת של פרוטוקול זה היא הקרנת ביטוי של מבנה מרובה של חלבון ארגינין מתילטרנספראזים בייצור בקנה מידה גדול כדי להשיג את כמות מיליגרם של החלבון למחקרים ביוכימיים, ביופיזיים, ומבניים במצב נתמך בינוני, חסכוני בכיסוי פלטפורמת הביטוי S, מערכת וקטור ביטוי baculovirus. ד"ר עלמה סיטובה תציג את הצעדים הבאים. לדלל את תאי SF9 הגדלים באופן אקספוננציאלי לצפיפות התאים הסופית של 0.4 מיליון למיליון במדיית החרקים ללא סרום, ולשפוך לתוך מאגר ריאגנט סטרילי.השתמש פיפטה רב ערוצי לתכנות כדי לזרוע 0.5 mils של תאי SF9 מדולל לכל באר של צלחת 24-well. נפח זה מספיק כדי להבטיח כיסוי שווה של משטח העבודה של הבאר. עם זאת, היא אינה מדללת את תמהיל ההעתקה יותר מדי, דבר המאפשר יעילות טרנס-פליטה.תווית באר אחת של הלוח כתא בלבד, ולהשתמש בו כפקד להשוואה של התא transfected ולא נגוע כדי להעריך סימנים פוטנציאליים של זיהום. דגירה את הצלחות ב 27 מעלות עד הצורך, כשעה, כדי לאפשר לתאים לצרף את צלחות תרבות התא. מדללים מגיב טרנס-פקציה מעורב היטב במדיום החרקים הלא מפואר ובמאגר ריאגנט סטרילי, ומערבבים בעדינות במשך 10 שניות.באמצעות פיפטה 12 ערוצים, להעביר 102 microliters של ריאגנט עסקה מדולל לתוך צלחת סטרילית 96 MicroWell. מעבירים 10 מיקרוליטרים של 0.2 מיקרוגרם למיקרוליטר של דנ"א bacmid רקומביננטי לבאר המתאימה של צלחת MicroWell 96-well ומערבבים על ידי טלטול עדין, הקשה על הצלחת מהצדדים. דגירה תערובת transfection במשך 15 עד 20 דקות עבור היווצרות מורכבת.באמצעות פיפטה מתכווננת בת שישה ערוצים המיועדת להעברה בין צלחת של 96 ל-24 באר, כיסוי תערובת ההעתקה על התאים מבחינת טיפה בבארות מקבילות של לוחות ההמרה, והדגירה במשך ארבע שעות ב-27 מעלות. כדי להבטיח התפלגות שווה של תערובת transfection על המונולייר של התאים, בעדינות לנענע את הצלחות הלוך ושוב מספר פעמים במהלך זמן הדגירה. ארבע עד חמש שעות לאחר זמן transfection, להוסיף 1.5 מיל של מדיה חרקים ללא סרום.להשלים אותו עם 10%הסופי של סרום שור עוברי מומת חום ו 1% אנטיביוטי ו antimycotic. דגירה תאים באינקובטור 27 מעלות במשך 72 עד 96 שעות. בעדינות לנענע את צלחות transfection פעם ביום כאשר הדבר אפשרי.חפש סימנים של זיהום ניכר בתאים נגועים ב 72 עד 96 שעות לאחר ההדבקה. ארבעה עד חמישה ימים לאחר transfection, סימנים של זיהום צריך להיות ניכר בתאים transfected בהשוואה לתאי הבקרה תחת מיקרוסקופ הפוך, ואת baculoviruses רקומביננטי הראשוני מופרש לתוך המדיום תרבות התא צריך להיות מוכן לאסוף. השתמש multichannel אלקטרוני לתכנות כדי לאפשר בו זמנית את האוסף של וירוסי P1, זיהום של תאי SF9 זרע טרי בזיהום של תאים תלויים שלהם 24 בלוקים היטב עם 150 microliters של וירוסי P1.ספין למטה שאר המניות הקולקטיביות P1 ויראלי במשך 15 דקות, לכסות את 24 בלוקים היטב עם תרבות ההשעיה של תאי SF9 נגועים עם גיליון AirPore. דגירה בלוק 24 גם ב 27 מעלות עם רועד ב 245 RPMs במשך 72 עד 96 שעות. ארבעה ימים לפני זמן הייצור המתוכנן, התפצלו תאי SF9 הגדלים באופן אקספוננציאלי, בצפיפות תאים סופית של 2 מיליון למיליון לתוך חוט טלטול זכוכית ארלנמייר עם מבלבלים במדיית חרקים ללא סרום המכילה 1% אנטיביוטיקה סופית ואנטימיקוטית.שלב זה ייצור תרבות השעיה של תאי חרקים נגועים ווירוסי P2 ב supernatant לזיהום של תאים חדשים באצוות הייצור. הוסף את הנגיפים P2 המתאימים דגירה תאים נגועים בטמפרטורה נמוכה יותר של 25 מעלות כדי להאט את צמיחת התא, רועד ב 165 RPMs על שייקר מסלולית עם שבץ של אינץ 'אחד. ארבעה ימים לפני זמן הייצור המתוכנן, זרע שני ליטרים של תאי SF9 הגדלים באופן אקספוננציאלי במדיה ללא סרום חרקים לצפיפות התא של 1 מיליון למיליון, בבקבוקון טלטול 2.8 ליטר פרנבך.לנער את הבקבוק ב 27 מעלות עם רעידות ב 150 RPMs. מדען המחקר אשלי האצ'ינסון ידגים את הפרוטוקול הבא. לפצל ארבעה ליטרים של תאי SF9 הגדלים באופן אקספוננציאלי ומדיה ללא סרום חרקים לצפיפות התא הסופית של 4 מיליון למיליון לבקבוקי ריאגנט גדולים של חמישה ליטרים.הוסף 10 עד 12 מיל של תרבות ההשעיה של תאי חרקים נגועים baculovirus. דגירה את התרבות הנגועה של תאי SF9 בשייקר רועד 145 סל"ד בטמפרטורה נמוכה יותר של 25 מעלות צלזיוס במשך 72 עד 96 שעות. כמויות מיליגרם של מספר חלבונים רקומביננטיים ממשפחת PRMT מבטאים את הייצור המיידי של הבקולווירוס בתאי SF9 משמשים למחקרי הדרכה ביוכימיים ביוכימיים, כפי שניתן לראות באיור חמש.ב SGC, מבני גביש נפתרו ב מופקד לתוך מאגר נתוני החלבון עבור צורות אורך מלא או קטוע של החלבונים PRMT4, 6, 7, ו 9 עם בדיקה כימית שונים מעכבים. פלסמידים ביטוי עבור PRMTs אלה הופקדו כדי להוסיף איסוף גנים על ידי SGC והם זמינים לקהילת המחקר. בסרטון זה, הדגשנו אלמנטים מרכזיים להקרנת משלחת מוצלחת של המבנה המרובים שלהם של החלבון ארגינין מתילטרנספראזים בייצור בקנה מידה גדול במערכת הביטוי baculovirus.השימוש בפיפטות הרב-ערוציות הניתנות לכוונון ולתיכנות באופן קבוע, הפך את כל התהליך שלהן למהיר ויעיל יותר. שימוש בעל ביצועים גבוהים ופחות רעיל בתאים עבור התאים, מגיב transfection עבור הדור של וירוסים רקומביננטי הוביל חסכוני יותר פרוטוקול transfection טיפול בתא זה. זיהום של אצווה בקנה מידה גדול לייצור חלבון עם תרבות ההשעיה של baculovirus נגוע בשישה תאים הפחית באופן משמעותי את העבודה זמן רב צעד הגברה המתנע חיוני.הוא למשל, צנטריפוגה זה עם תרבות מיוחדת של תאים נגועים. זה כמובן לא כולל את הטיפול הנוסף של התאים הנגועים ב להימנע ההדוק שלהם השפלה וירוס. תרבות ההשעיה תרבות תחזוקת תאים בקנה מידה זה את הייצור בכלי התרבות היה נפח שדה גבוה לעזור לנו להתגבר על המגבלה של נפח הייצור ולאמץ פלטפורמה בקנה מידה גדול.זה מאוד שימושי עבור מעבדות ללא גישה bioreactors או שטח מוגבל בצינור הייצור. למרות שהפרוטוקול שלנו תואר עבור החלבונים של משפחת החלבון ארגינין מתיל טרנספראזס, אותה גישה יכולה להיות מיושמת על כל משפחת חלבונים אחרים הדורשים פלטפורמת ביטוי כדי להשיג כמות מספקת של החלבון שלהם למחקרי הדרכה ביוכימיים.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Recombinant Protein Expression, Crystallization, and Biophysical Studies of a Bacillus-conserved Nucleotide Pyrophosphorylase, BcMazG

Recombinant Protein Expression, Crystallization, and Biophysical Studies of a Bacillus-conserved Nucleotide Pyrophosphorylase, BcMazG

ביטוי חלבון רקומביננטי, התגבשות, מחקרים ביופיסיקליים של א<em&gt; Bacillus</em&gt; -שמר Nucleotide Pyrophosphorylase, BcMazG

To overcome safety restrictions and regulations when studying genes and proteins from true pathogens, their homologues can be studied. Bacillus anthracis ...

Transient Expression in Nicotiana Benthamiana Leaves for Triterpene Production at a Preparative Scale

Transient Expression in Nicotiana Benthamiana Leaves for Triterpene Production at a Preparative Scale

ארעי ביטוי טבק Benthamiana משאיר לייצור טריטרפן בקנה מידה מפוח

The triterpenes are one of the largest and most structurally diverse families of plant natural products. Many triterpene derivatives have been shown to ...

Modifying Baculovirus Expression Vectors to Produce Secreted Plant Proteins in Insect Cells

שינוי Baculovirus וקטורים ביטוי לייצר מופרש צמח חלבונים בתאי חרקים

It has been a challenge for scientists to express recombinant secretory eukaryotic proteins for structural and biochemical studies. The ...

Large-scale Production of Recombinant RNAs on a Circular Scaffold Using a Viroid-derived System in Escherichia coli

Large-scale Production of Recombinant RNAs on a Circular Scaffold Using a Viroid-derived System in Escherichia coli

ייצור בקנה מידה גדול של RNAs רקומביננטי על גרדום מעגלית באמצעות מערכת נגזר וירואיד ב- Escherichia coli

With increasing interest in RNA biology and the use of RNA molecules in sophisticated biotechnological applications, the methods to produce large amounts ...

Use of Recombinant Fusion Proteins in a Fluorescent Protease Assay Platform and Their In-gel Renaturation

השימוש פיוז'ן רקומביננטי חלבונים פלטפורמה Assay פרוטאז פלורסנט, Renaturation שלהם בג'ל

Proteases are intensively studied enzymes due to their essential roles in several biological pathways of living organisms and in pathogenesis; therefore, ...

Localization of SUMO-modified Proteins Using Fluorescent Sumo-trapping Proteins

לוקליזציה של חלבונים ששונו באמצעות סומו פלורסנט-השמנה חלבונים

Here we are presenting a novel method to study the sumoylation of proteins and their sub-cellular localization in mammalian cells and nematode oocytes. ...

Expression, Purification, Crystallization, and Enzyme Assays of Fumarylacetoacetate Hydrolase Domain-Containing Proteins

ביטוי, טיהור, התגבשות ואנזים אנזימים המכילים חלבונים בתחום הידרוקלז

Fumarylacetoacetate hydrolase (FAH) domain-containing proteins (FAHD) are identified members of the FAH superfamily in eukaryotes. Enzymes of this ...

Characterization of Membrane Transporters by Heterologous Expression in E. coli and Production of Membrane Vesicles

Characterization of Membrane Transporters by Heterologous Expression in E. coli and Production of Membrane Vesicles

אפיון מובילי הממברנה על ידי ביטוי הטרוולוגי ב -E. coli וייצור ממברנה ושלפוחיות

Several methods have been developed to functionally characterize novel membrane transporters. Polyamines are ubiquitous in all organisms, but polyamine ...

Transverse Sectioning of Mature Rice (Oryza sativa L.) Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Transverse Sectioning of Mature Rice Oryza sativa L. Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

חתך רוחבי של אורז בוגר (Oryza sativa L.) גרעינים לסריקת הדמיית מיקרוסקופיה אלקטרונית באמצעות טיפים פיפטה כתמיכה ללא תנועה

Starch granules (SGs) exhibit different morphologies depending on the plant species, especially in the endosperm of the Poaceae family. Endosperm ...

Cell-Free Production of Proteoliposomes for Functional Analysis and Antibody Development Targeting Membrane Proteins

ייצור ללא תאים של פרוטאוליפוזומים לניתוח פונקציונלי ופיתוח נוגדנים המכוונים לחלבוני ממברנה

Membrane proteins play essential roles in a variety of cellular processes and perform vital functions. Membrane proteins are medically important in drug ...