Name: production of recombinant prmt proteins using the baculovirus expression vector system
Uploaded: 2021-07-17T14:00:00
Duration: 8 min 57 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Production of Recombinant PRMT Proteins using the Baculovirus Expression Vector System at JoVE.com

Gli autori desiderano ringraziare Dalia Barsyte-Lovejoy per aver preso il tempo necessario per fornire preziosi feedback e commenti critici sul manoscritto e tutti i nostri colleghi SGC che hanno lavorato con la famiglia di proteine PRMT espressa dal Baculovirus Expression Vector System.
L'SGC è un ente di beneficenza registrato (numero 1097737) che riceve fondi da AbbVie, Bayer AG, Boehringer Ingelheim, Genentech, Genome Canada attraverso l'Ontario Genomics Institute [OGI-196], l'UE e l'EFPIA attraverso l'Impresa Comune Innovative Medicines Initiative 2 [sovvenzione EUbOPEN 875510], Janssen, Merck KGaA (alias EMD in Canada e negli Stati Uniti), Pfizer, Takeda e wellcome trust [106169/ZZ14/Z].

<ol>
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Gli autori non dichiarano alcun conflitto di interessi.

Uno dei vantaggi del BEVS nelle cellule di insetti si concentra sulla capacità dei macchinari di modifica post-traslazionale di consentire modifiche più complesse come fosforilazione, miristoilazione e glicosilazione. Insieme al ripiegamento altamente efficiente delle proteine dei mammiferi, queste modifiche facilitano elevate quantità di proteine modificate e piegate adatte a esperimenti a valle fisiologicamente rilevanti16.
Qui, abbiamo descritto protocolli dettagliati del BEVS che enfatizzano elementi critici per lo screening di espressioni di successo di costrutti multipli di proteine PRMT e produzione di proteine PRMT su larga scala nella piattaforma di espressione baculovirus: 1) L'uso di pipette multicanale regolari, regolabili e programmabili per trasferire i materiali biologici tra 24 e 96 - piastre e blocchi di coltura cellulare del pozzo nelle fasi della generazione di DNA bacmid e virus; una raccolta dei virus ricombinanti, l'amplificazione dei volumi virali dei virus ricombinanti e la preparazione dei blocchi di screening dell'espressione proteica. 2) Reagenti di trasfezione ad alte prestazioni ed economici per la generazione di virus ricombinanti. 3) Coltura di sospensione delle cellule di insetti infettate da baculovirus (SCBIIC) per la produzione di proteine su larga scala. 4) Utilizzo di fusti a frullato Ad alto volume 2.8 L Fernbach per mantenere la coltura di sospensione Sf9 e flaconi di frullato 2.5 L Tunair e bottiglie reagenti da 5 L per la produzione di proteine su larga scala.
Considerazioni speciali e motivazioni per le fasi di trasformazione e trasfezione. Sebbene un protocollo commerciale raccomandi l'utilizzo di 100 μL di cellule competenti per unatrasformazione 14, l'efficienza di trasformazione delle cellule commerciali competenti DH10Bac E. coli è fino a 1 x 108 cfu / μg di DNA, quindi usiamo solo 4 μL. Questo è sufficiente per ogni trasformatore per ottenere colonie ricombinanti bianche isolate per l'isolamento del DNA bacmidi. Le cellule Sf9 aderenti nella piastra di trasfezione a 24 pompenti sono state sementi ad una densità cellulare di 2 x10 5 / mL in 0,5 mL di supporti per insetti senza siero. Questo volume è sufficiente per garantire una copertura uniforme della superficie di lavoro del pozzo. Allo stesso tempo, non diluizza troppo il mix di trasfezione, il che migliora l'efficienza di trasfezione. I reagenti di trasfezione non sono tossici per le cellule Sf9 e lo scambio di media non è necessario. Invece di un cambiamento dei supporti, altri 1,5 mL di supporti contenenti 10% (v/v) FBS vengono aggiunti nella piastra di trasfezione a 4-5 ore dopo il trasfezione per facilitare la crescita cellulare. L'efficienza di trasfezione di entrambi i reagenti di trasfezione è elevata. Tuttavia, con X-tremeGene 9, i segni di infezione nelle cellule trasfette (Figura 2) appaiono 10-12 ore prima rispetto al reagente JetPrime, quindi scegliamo tra questi reagenti a seconda del programma di lavoro dei passaggi successivi nei protocolli, che fornisce una certa flessibilità nel processo complessivo.
Lo screening dell'espressione del test proteico può essere impostato con virus P2 se la quantità dei virus ricombinanti iniziali, raccolti dalla piastra di trasfezione ed etichettati come P1, è un fattore limitante da utilizzare per lo screening dell'espressione proteica.
Considerazioni quando si sposta da volumi di cultura di piccole e grandi dimensioni. Storicamente, si credeva che una crescita ottimale delle cellule richiedesse un elevato spazio aereo nella coltura delle sospensioni della manutenzione cellulare sf9 e delle produzioni in scala. Tuttavia, nel 2014, è stato riferito che l'alto spazio aereo nelle navi da coltura è meno critico di quanto si pensassein precedenza 17. Un contenitore di coltura impostato utilizzando una velocità di scuotimento opportunamente regolata al lancio orbitale della piattaforma di scuotimento fornirà un trasferimento di ossigeno sufficiente anche nella coltura di sospensioni ad alto volume di riempimento creando e mantenendo piccole bolle d'aria per un tempo più lungo. Con questo approccio, le cellule di insetti disponibili in commercio possono essere coltivate a una velocità di scuotimento più elevata entro un intervallo normale del tempo di raddoppio delle cellule senza sacrificare l'elevata vitalità cellulare.
Così, 6 anni fa, abbiamo iniziato ad aumentare il volume della coltura delle sospensioni in un pallone tremante durante il mantenimento delle cellule e abbiamo introdotto un diverso tipo di recipiente di coltura per la produzione di proteine regolando e monitorando le condizioni discuotimento (Figura 6). Per stabilire condizioni ottimali in questi vasi di coltura, abbiamo monitorato i parametri di coltura cellulare Sf9 come il tempo di raddoppio delle cellule insieme alla vitalità, alle dimensioni e alla forma delle cellule, allo stato di aggregazione e all'infettibilità delle cellule.
Ad esempio, per la manutenzione delle cellule Sf9, nei flaconi a scossa di Fernbach da 2,8 L, coltiamo 2 L invece di 0,8 L delle cellule di sospensione Sf9 che tremano a 150 giri/min a 27 °C e la vitalità cellulare la maggior parte delle volte è vicina al 99%, con cellule divisorie sane di forma uniforme. Per la produzione in scala, infettiamo 4 L di celle in bottiglie di reagente da 5 L che tremano ad alta velocità come 145 giri/min ad una temperatura ridotta di 25 °C. Gli incubatori più comunemente utilizzati con una piattaforma di scuotimento integrata possono contenere flaconi di scuotimento da 6 x 2,8 L o bottiglie di reagente da 6 x 5 L o flaconi di frullato Tunair da 10 x 2,5 L. Pertanto, la capacità dell'unica piattaforma di scuotimento, se riempiamo le fiasche di scuotimento Fernbach e le bottiglie di reagente a 1/3 rispetto al volume ad alto riempimento dei vasi è di 4,8 L contro 12 L usando flaconi di frullato Fernbach da 2,8 L e 10 L contro 24 L usando bottiglie di reagente da 5 L(Figura 6). La manutenzione della coltura delle celle a sospensione e la produzione in scala mobile nei vasi da coltura ad alto volume di riempimento ci hanno aiutato a superare i limiti dei volumi di produzione e ad adottare una piattaforma su larga scala. Pertanto, questo è molto utile per i laboratori senza accesso ai bioreattori e / o spazio limitato nelle pipeline di produzione.
Questo protocollo potrebbe essere prontamente adattato per la produzione e la purificazione di costrutti proteici con diversi tag di affinità utilizzando resine appropriate e modificando i tamponi di purificazione come descritto nel documento pubblicato dall'SGC6 per le proteine a figura intera contrassegnate con bandiera di PRMT4, 7, 9 e il complesso PRMT5-MEP50 e PRMT6 contrassegnato con isto. Sebbene descriviamo un protocollo BEVS per la famiglia di proteine PRMT, lo stesso approccio può essere applicato a qualsiasi altra famiglia proteica.

Proteina arginina metiltransferasi (PRMTs) metilati residui di arginina in modo monometile o simmetrico/asimmetrico dimetile. Le sequenze ripetitive RG/RGG/GRG sono altamente preferite dalla maggior parte dei PRMT e si trovano in un'ampia varietà di proteine1,2. Le proteine metilate dell'arginina come istoni o fattori di trascrizione e fattori di giunzione regolano la trascrizione, la giunzione e la struttura della cromatina3,4. La crescente conoscenza della diversa regolazione dell'utilizzo del substrato e del cofattore, del turnover e della cinetica dei PRMT, nonché della generazione di inibitori selettivi, ha fatto luce meccanicistica su questi enzimi e sui lorocomplessi 5,6. Tuttavia, non tutti i membri della famiglia PRMT sono studiati nella stessa misura; Ad esempio, PRMT9 è stato scoperto solo di recente come membro della famiglia PRMT1. Gli studi di struttura e funzione enzimatica per queste proteine richiedono quantità sufficienti, spesso milligrammi, di proteine ricombinanti per essere disponibili.
Il sistema di espressione procariotica Escherichia coli (E. coli)è di solito la prima scelta per lo screening dell'espressione utilizzando più costrutti per una data proteina7,8,9. Tuttavia, l'espressione basata su E. colinon sempre si traducono in quantità sufficienti di proteine PRMT nelle loro forme attive, come abbiamo notato in particolare per PRMT5 e PRMT7 (vedi sotto). Pertanto, i PRMT che non si esprimevano in E. coli o che dovevano essere prodotti dai meccanismi di espressione eucariotica sono stati sottoclorati in vettori appropriati per lo screening dell'espressione nel sistema vettoriale di espressione baculovirus alternativo (BEVS). Mentre I campioni espressi da E. coli di PRMT1, PRMT3 e PRMT8 sono stati ampiamente utilizzati per saggi in vitro e cristallografia, altri PRMT come PRMT5, che richiede il partner vincolante MEP50 del suo doppio dominio metiltransferasi, e PRMT come PRMT7 e 9, richiedono l'espressione delle cellule di insetti per ottenere quantità sufficienti di proteine attive. Nel complesso, i test standardizzati di media throughput metiltransferasi per PRMT4, 5, 6, 7 e 9 hanno utilizzato il BEVS nelle cellule degli insetti6. Il baculovirus expression vector system (BEVS) è una piattaforma versatile per produrre proteine ricombinanti che richiedono il meccanismo di espressione eucariotica che consente modifiche post-traslazionali essenziali per gli studi biochimici, biofisici e strutturali10,11,12. Diversi BEVS sono diventati disponibili in commercio dal primo uso segnalato di baculovirus nel 1983 per l'espressione proteica13. La maggior parte di questi protocolli utilizza diverse strategie per il trasferimento dell'espressione plasmide in cellule di insetti. Questi includono Bac-to-Bac, flashBAC, BaculoGOLD Bright, BacVector-3000, BacMagic, BacPAK, ecc. Il nostro protocollo si basa sul sistema più comunemente utilizzato in BEVS, il sistema Bac-to-Bac14, che è progettato per trasferire il gene / cDNA che codifica la proteina di interesse (POI, qui i PRMT) nel genoma del baculovirus mantenuto in un ceppo specializzato di E. coli tramite trasposizionesite-specific 15.
In breve, il vettore di trasferimento plasmide contenente il gene di interesse è stato trasformato in cellule competenti DH10Bac E. coli per generare DNA bacmidi virale ricombinante. Le cellule Sf9 aderenti sono state poi trasfette con DNA bacmid. Da quattro a cinque giorni dopo la trasfezione, i baculovirus ricombinanti iniziali secreti nel terreno di coltura cellulare sono stati recuperati ed etichettati come virus P1. Le scorte di baculovirus P1 sono state quindi utilizzate per l'amplificazione del virus (cioè la generazione di stock di baculovirus P2) e lo screening dell'espressione proteica. Sulla base dei risultati dello screening dell'espressione, i virus P2 per il miglior costrutto di espressione della proteina sono stati identificati e utilizzati per generare colture di sospensione di cellule di insetti infettate da baculovirus (SCBIIS) per la produzione di proteine su larga scala. Qui descriviamo i nostri protocolli dettagliati e descriviamo la logica alla base delle nostre scelte di recipienti reagenti e di coltura per supportare la nostra strategia di sviluppo di una metodologia più efficiente in termini di tempo, economica e scalabile per ottenere quantità sufficienti di proteine ricombinanti desiderate.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2.8L Nalgene&#160; Fernbach Culture Flask, Polycarbonate,</td>
			<td>Nalgene</td>
			<td>29171-854</td>
			<td>For large scale maintenance of suspension culture of Sf9 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-Well Blocks RB</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>19583</td>
			<td>For incubation of&#160; 4ml of suspension&#160; Sf9 cells&#160; for protein&#160; expression screening</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-20 Criterion TGX Gel 26W 15 ul</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>5671095</td>
			<td>For SDS-PAGe analysis of the purified proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50ml Reagent Reservoir</td>
			<td>Celltreat Scientific Products</td>
			<td>229290</td>
			<td>&#160;Reservoir used for diluted transfection reagent&#160; and Sf9 cells suspension</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well cap mat, for use with square well, 2 mL</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>381080</td>
			<td>Used to cover 96 well block</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well PCR plate</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30129300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto agar</td>
			<td>BD</td>
			<td>214010</td>
			<td>For LB-agar selection paltes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Airpore Tape Sheets</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>19571</td>
			<td>To cover 24 well blocks for protein expression screening</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Allega X-15R Centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>392932</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic Antimycotic (100x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15240112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacmid DNA</td>
			<td>in-house</td>
			<td>non-catalog item</td>
			<td>Bacmid DNA for baculovirus production</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bluo-Gal, 1g</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15519028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beckman JLA 8.1000</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Plates, 24-Well, with lid, flat bottom, sterile</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30722116</td>
			<td>Tissue&#160; culture treated plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Resuspension Solution 0.5&#160;L</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>LSKCRS500</td>
			<td>For Bacmid DNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell&#160;Lysis Solution 0.5&#160;L</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>LSKCLS500</td>
			<td>For Bacmid DNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CELLSTAR&#160; Tissue Culture Plates, 96 well</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>655180</td>
			<td>For transfection mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ClipTip 1250, filter reload, sterile</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>94420818</td>
			<td>Tips for&#160; programmable and adjustable multichannel pipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP Mix (25 mM each)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>R1121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E1-ClipTip&#160; Electronic Adjustable Tip Spacing Multichannel Equalizer Pipette, 15 to 1250 &#956;L</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>4672090BT</td>
			<td>Programmable and adjustable multichannel pipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E4&#160; XLS adjustable spacer 6-channel pipette, 20-300 &#956;L</td>
			<td>Ranin</td>
			<td>LTS EA6-300XLS</td>
			<td>Ranin adjustable multichannel pipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter microplate, 96-well, polypropylene, with 25 &#181;m ultra high molecular weight polyethylene membrane</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>201005-100</td>
			<td>For protein purification in expression screening</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Full-Baffle Flask Kit Tunair, 2.5L</td>
			<td>IBI Scientific</td>
			<td>SS-6003C</td>
			<td>For large scale protein production in suspension culture of SF9 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin 10x10ml</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>15750078</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat Inactivated Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Wisent Biocenter</td>
			<td>080-450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>I-Max Insect Media W/ L-Glutamine, 1 L</td>
			<td>Wisent Biocenter</td>
			<td>301-045-LL</td>
			<td>Serum free insect cells growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>InstantBlue, Ultrafast Protein Stain</td>
			<td>Expedeon Protein Solutions</td>
			<td>ISB1L-1L</td>
			<td>For protein gel (SDS-PAGE) staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iptg, Ultra Pure, Dioxane Free, Min 99.5%</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>IPT001.100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JetPRIME Transfection Reagent&#160; Provided with&#160; jetPRIME buffer</td>
			<td>POLYPLUS TRANSFECTION Inc</td>
			<td>114-01</td>
			<td>For Sf9 cells transfection to generate baculovirus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin Monosulfate</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>KAN201.100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lb Broth (Lennox), Powder Microbial Gro&#38;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L3022-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterblock 96 deep well 2.4mL</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>780285-FD</td>
			<td>Used in the transformation and expression screening procedures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Max Efficiency DH10Bac Competent Cells , 0.5ml</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>10361012</td>
			<td>Competent cells for bacmid DNA generation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mLINE 12-Channel Pipette, adjustable 30 - 300 uL</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>Sartorius 725240</td>
			<td>12 channel pipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neutralization Solution, 0.5&#160;L</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>LSKNS0500</td>
			<td>For bacmid DNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>New Brunswick&#160; Innova 44R, 120V, orbit 2.5 cm (1 in)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>M1282-0004</td>
			<td>Shaker incubator for incubaion of suspension of Sf9 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA Agarose</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>30250</td>
			<td>For protein purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>LS15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PYREX&#160; Delong Shaker Erlenmeyer Flask with Baffles, Corning&#160; 500ml</td>
			<td>Pyrex</td>
			<td>4444-500</td>
			<td>For&#160; suspension culture of Sf9 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PYREX Delong Shaker Erlenmeyer Flask with Baffles, Corning&#160; 125ml</td>
			<td>Pyrex</td>
			<td>4444-125</td>
			<td>For suspension culture of Sf9 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PYREX Delong Shaker Erlenmeyer Flask with Baffles, Corning&#160; 250ml</td>
			<td>Pyrex</td>
			<td>4444-250</td>
			<td>For suspension culture of Sf9 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RedSafe&#160;Nucleic&#160;Acid&#160;Staining&#160;Solution</td>
			<td>Froggabio</td>
			<td>21141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase A, 0.9&#160;mL</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>LSKPMRN30</td>
			<td>For suspension buffer for bacmid DNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roll &#38; Grow Spherical Glass Plating Beads</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>115000550</td>
			<td>For&#160; spread&#160; of bacterial&#160; cells across the surface of an agar plate.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RT-LTS-A-300&#956;L-768/8 (tips)</td>
			<td>Ranin</td>
			<td>30389253</td>
			<td>Tips for ranin multichannel pipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S.O.C. Medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15544034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serum, Cell Culture, Fetal Bovine Serum (Fbs), Hyclone, Characterized Canadian</td>
			<td>cytivalifesciences</td>
			<td>SH3039602</td>
			<td>Addition to the serum free medim for&#160; the transfected cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sf9 cells</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>12659017</td>
			<td>Insect cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sfx-Insect Cell Culture Media</td>
			<td>Cytiva (Formerly GE Healthcare Life Sciences)</td>
			<td>SH3027802</td>
			<td>Serum free insect cells growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tape Pad</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>19570</td>
			<td>Tape Pad</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taq DNA Polymerase with ThermoPol Buffer - 2,000 units</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0267L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetracycline Hcl</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>TET701.10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue 0.4% Solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15250061</td>
			<td>For&#160; assessment of cell viability</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VITLAB&#160; Reagent Bottles, PP with Screw Caps, PP, BrandTech, 5L</td>
			<td>VITLAB</td>
			<td>V100889</td>
			<td>For large scale protein production in suspension culture of Sf9 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR&#160; Digital Mini Incubator</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10055-006</td>
			<td>Incubator for adherent Sf9 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR&#160; Incubating Microplate Shaker</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97043-606</td>
			<td>Incubator for suspension culture of Sf9 cells in 24 well blocks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Petri Dishes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>CA73370-037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-tremeGene 9 DNA&#160; Transfection Reagent&#160; 1.0 M</td>
			<td>Roche</td>
			<td>6365787001</td>
			<td>For Sf9 cells transfection to generate recombinant baculovirus</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

production of recombinant prmt proteins using the baculovirus expression vector system

Protein arginina metiltransferasi (PRMTs) metilati arginina residui su un'ampia varietà di proteine che svolgono un ruolo in numerosi processi cellulari. I PRMT possono essere mono- o dimetilati gruppi arginina guanidino simmetricamente o asimmetricamente. La queste proteine è un'area complessa e intensamente studiata che richiede quantità di milligrammo di proteine ricombinanti di alta qualità. Il sistema di vettori di espressione del baculovirus (BEVS) che utilizza il nucleopolidrovirus multiplo autographa californica (AcMNPV) e le cellule di insetti Spodoptera frugiperda 9 (Sf9) è stato utilizzato per lo screening dell'espressione e la produzione di molti PRMT, tra cui PRMT 1, 2 e da 4 a 9. Per schermare contemporaneamente l'espressione di più costrutti di queste proteine, inclusi domini e frammenti troncati, nonché le proteine a lunghezza intera, abbiamo applicato metodi scalabili utilizzando pipette multicanale regolabili e programmabili, combinate con piastre e blocchi a 24 e 96 pozzi. Nel complesso, queste regolazioni del metodo hanno permesso una generazione su larga scala di DNA bacmid, virus ricombinanti e screening dell'espressione proteica. L'utilizzo di vasi di coltura con un volume elevato di sospensioni cellulari Sf9 ha contribuito a superare i limiti di spazio nella pipeline di produzione per la produzione di proteine su larga scala mono lotti. Qui descriviamo protocolli dettagliati per l'espressione efficiente ed economica di PRMT funzionali per studi biochimici, biofisici e strutturali.

Una panoramica del protocollo BEVS è descritta nella figura 1. Più costrutti di espressione di PRMT, tra cui lunghezza intera, domini e frammenti troncati, sono stati generati presso il Structural Genomics Consortium (SGC, Toronto) secondo strategie internamente con il tentativo di aumentare il tasso di successo per identificare proteine solubili e stabili con un livello di espressionerelativamente alto 7,9. I lettori interessati sono incoraggiati a rivedere le definizioni e la metodologia dell'SGC di progettare un "frammento" come segmento della sequenza genica incorporata in un clone dell'espressione, "dominio" come dominio strutturale annotato da PFAM e "costrutto" come il frammento clonato in un vettore di espressione, tutti descritti in dettaglio in una precedente pubblicazione7. I costrutti di espressione dei PRMT presentati in questo protocollo sono per la produzione delle proteine con tag poliistidina clonate nel vettore pFBOH-MHL, che è una derivata del vettore pFastBac1. Nella figura 4,presentiamo l'analisi SDS-PAGE dei costrutti solubili con tag His di PRMT1, 2, 4-9 purificati da pellet raccolti dopo 4 mL di produzione in celle Sf9 (fase 3.1.4). PRMT1 e PRMT9 a lunghezza intera (FL) non sono presentati in questo gel, poiché FL PRMT1 è stato prodotto da E. colie FL PRMT9 prodotto da BEVS è stato purificato da Flag-tag6. I costrutti troncati di PRMT1, FL PRMT4 e tutti i costrutti PRMT8 mostrano una resa relativamente elevata, ma gli eluati proteici contengono frazioni di contaminanti co-purificati. Questi costrutti richiedono un'ulteriore ottimizzazione dei protocolli di purificazione. Sono quindi necessari ulteriori approcci per migliorare la purezza di queste proteine da produzioni scale-up, come una riduzione della quantità di perline di nichel nella fase dell'incubazione con un lisato chiarificato; un aumento delle concentrazioni di imidazolo nei tamponi di lavaggio; scissione della His-tag con proteasi TEV, seguita da applicazione su una resina ni-affinità; e, ulteriori passaggi di purificazione come l'esclusione delle dimensioni e la cromatografia a scambio ionico. I costrutti di PRMT2 mostrano una resa significativamente inferiore rispetto ad altre proteine e proteine PRMT2 a figura intera accompagnate da una forte banda di contaminanti. La produzione scale-up e due fasi di purificazione come IMAC e l'esclusione delle dimensioni hanno confermato un basso livello di espressione per questo costrutto insieme alla presenza persistente del contaminante co-purificante per la proteina FL. Proteine pure sono state ottenute per il complesso PRMT5 prodotto e purificato con il suo partner legante obbligato, MEP50. Il costrutto troncato di PRMT9 ha un livello di espressione inferiore di quasi due o tre volte, vicino a 1,5 mg/L, rispetto ad altri PRMT. Tuttavia, le scorte virali ricombinanti di questo costrutto sono state utilizzate per la produzione in scala, sono stati ottenuti cristalli diffrazione e la struttura è stata risolta per questa proteina insieme a PRMT4, 6 e 7(Figura 5).
Per le produzioni scale-up, i corrispondenti virus P2 sono stati utilizzati per infettare la coltura di sospensione delle cellule di insetti Sf9. Questo passaggio genera 50/100/200 mL di cellule infettate da baculovirus contenenti cellule infette e virus P3 nel supernatante. Per la produzione di proteine su larga scala, 2 L di cellule Sf9 sono state coltivate in ciascuno dei flaconi di frullato Fernbach da 2,8 L a 150 giri/min, 27 °C(figura 6). Il giorno della produzione, 2 L di cellule Sf9 (vitalità cellulare > 97%) in flaconi di frullato 2.5 L Tunair o 4 L in bottiglie di reagente da 5 L sono stati diluiti ad una densità cellulare di 4 x 106/ml. Queste cellule sono state infettate direttamente con 10-12 mL/L di coltura di sospensione di cellule di insetti infettate da baculovirus e incubate a una temperatura abbassata di 25 °C, a 145 giri/min. L'infezione del lotto di produzione direttamente con una coltura di sospensione di cellule di insetti infettate da baculovirus ha ridotto significativamente le fasi laboriose e dispendiose in termini di tempo nell'amplificazione del volume del virus, escludendo la gestione extra delle cellule infette, ed ha evitato la riduzione della degradazione del formicolio e del virus. La manutenzione della coltura cellulare SF9 e la produzione in scala sono state fatte nei recipienti di coltura ad alto volume di riempimento per adottare una produzione proteica su larga scala in un unico lotto(figura 6).
Prmt 4, 5 (in complesso con MEP50), 6, 7 e 9 proteine prodotte dalla piattaforma di produzione mediata da Baculovirus sono state utilizzate per la caratterizzazione cinetica e lo screening del composto inibitore presso l'SGC6. Le strutture cristalline sono state risolte e depositate nella Protein Data Bank (PDB) per le forme a tutta lunghezza o troncate delle proteine PRMT 4, 6, 7 e 9 con varie sonde chimiche e inibitori. I plasmidi di espressione per questi PRMT sono stati depositati nel repository plasmide Addgene (Addgene è un partner di distribuzione dell'SGC, https://www.addgene.org/) e sono disponibili per la comunità di ricerca(Figura 5).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62510/62510fig01.jpg"> Figura 1: Panoramica schematica dei passaggi del processo di espressione del baculovirus Fare clic qui per visualizzare una versione più ampia di questa <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62510/62510fig01large.jpg" target="_blank">figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62510/62510fig02.jpg"> Figura 2: Baculovirus Cellule Sf9 infette e non infette. I segni di infezione sono cambiamenti strutturali nelle cellule degli insetti, come un aumento del 25-50% del diametro della cellula, nuclei cellulari ingrossati, forma uniformemente arrotondata, perdita di proliferazione e aderenza alla superficie del piatto di coltura, nonché una diminuzione della vitalità cellulare. Barra in scala bianca 200 μm. I segni di infezione presentati qui sono gli stessi per le cellule trasfette utilizzando sia reagenti di trasfezione, JetPrime e X-tremeGene 9. L'esempio specifico mostrato è per il reagente di trasfezione JetPrime. (A) Celle Sf9 non infette come controllo. (B) Cellule Sf9 infettate da Baculovirus. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62510/62510fig02large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62510/62510fig03.jpg"> Figura 3: Assemblaggio di piastre leganti per una rapida purificazione delle proteine di espressione di prova. Si prega di vedere il testo per i dettagli, passaggi 3.2.1-2 Fare <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62510/62510fig03large.jpg" target="_blank">clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62510/62510fig04.jpg"> Figura 4 :Risultati dello screening dell'espressione proteica. Risultati dello screening dell'espressione proteica della produzione di proteine mediate da baculovirus in 4 mL di coltura di sospensione Sf9 infettati da corrispondenti virus ricombinanti P1 per diversi PRMT e il complesso PRMT5-MEP50. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62510/62510fig04large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62510/62510fig05.jpg"> Figura 5: Riepilogo dei costrutti di espressione per PRMT4, 6, 7 e 9 utilizzati per gli studi sulla struttura cristallina presso il Structural Genomics Consortium di Toronto (SGC). Le strutture cristalline sono state risolte e depositate nella Protein Data Bank (PDB) per l'intera lunghezza o forme troncate di proteine PRMT 4, 6, 7 e 9 con varie sonde chimiche e inibitori. I plasmidi di espressione per questi PRMT sono stati depositati nel repository plasmide Addgene e sono disponibili per la comunità di ricerca (Addgene è un partner di distribuzione dell'SGC, https://www.addgene.org/). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62510/62510fig05large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62510/62510fig06.jpg"> Figura 6: Mantenimento delle cellule di insetti Sf9 e produzione di proteine nei diversi recipienti di coltura: (A) 2.8 L Fernbach flask per il mantenimento delle cellule e la produzione di proteine. L'uso del 72% fill-volume aumenta la velocità di produzione di 2,5 volte in una piattaforma di scuotimento. (B)Le fiasche di frullato Tunair (in questa immagine sono presentati solo 9 mastri su 10) e le bottiglie di reagente con un volume di riempimento dell'80% aumentano drasticamente la capacità produttiva della piattaforma di scuotimento. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62510/62510fig06large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

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Production of Recombinant PRMT Proteins using the Baculovirus Expression Vector System

Il baculovirus expression vector system (BEVS) è una solida piattaforma per lo screening dell'espressione e la produzione di proteina arginina metiltransferasi (PRMT) da utilizzare per studi biochimici, biofisici e strutturali. Quantità di milligrammo di materiale possono essere prodotte per la maggior parte dei PRMT e di altre proteine di interesse che richiedono una piattaforma di espressione eucariotica.

Produzione di proteine PRMT ricombinanti utilizzando il baculovirus Expression Vector System

Protein arginine methyltransferases (PRMTs) methylate arginine residues on a wide variety of proteins that play roles in numerous cellular processes. ...

L'obiettivo generale di questo protocollo è lo screening di espressione di costrutto multiplo di proteina arginina metiltransferasi in produzione su larga scala per ottenere la quantità milligrammo della proteina per studi biochimici, biofisici e strutturali nel mezzo supportato, modalità economica nella copertura della piattaforma di espressione S, sistema vettoriale di espressione baculovirus. La Dott.ssa Alma Seitova presenterà i seguenti passaggi. Diluire le cellule SF9 in crescita esponenziale alla densità cellulare finale di 0,4 milioni per milione nel mezzo di insetti privo di siero e versare nel serbatoio del reagente sterile.Utilizzare una pipetta multicanale programmabile per seminare 0,5 mils delle celle SF9 diluite in ogni pozzo della piastra a 24 potte. Questo volume è sufficiente per garantire una copertura uniforme della superficie di lavoro del pozzo. Allo stesso tempo, non diluizza troppo il mix di trasfezione, il che consente l'efficienza di trasfezione.Etichettare un pozzo della piastra solo come cella e utilizzarlo come controllo per il confronto della cellula trasfettata e non trasfettata per valutare i potenziali segni di infezione. Incubare le piastre a 27 gradi fino a quando necessario, circa un'ora, per lasciare che le cellule si attaccano alle piastre di coltura cellulare. Diluire il reagente di trasfezione ben miscelato nel mezzo insetto non soffantato e in un serbatoio di reagente sterile e mescolare delicatamente per 10 secondi.Utilizzando una pipetta a 12 canali, trasferire 102 microlitri del reagente di transazione diluito in una piastra sterile da 96 MicroWell. Trasferire 10 microlitri da 0,2 microgrammi per microlitro di DNA bacmide ricombinante nel pozzo corrispondente della piastra MicroWell da 96 pozzi e mescolare scuotendo delicatamente, toccando la piastra dai lati. Incubare la miscela di trasfezione per 15-20 minuti per una formazione complessa.Utilizzando una pipetta regolabile a sei canali progettata per il trasferimento tra una piastra da 96 e 24 poggia, sovrapporre la miscela di trasfezione alle celle per quanto riguarda la caduta nei pozzi corrispondenti delle piastre di trasfezione e incubare per quattro ore a 27 gradi. Per garantire una distribuzione uniforme della miscela di trasfezione sul monostrato delle cellule, scuotere delicatamente le piastre avanti e indietro più volte durante il tempo di incubazione. Da quattro a cinque ore dopo il tempo di trasfezione, aggiungi 1,5 milioni di supporti per insetti senza siero.Completarlo con il 10% finale di siero bovino fetale inattivato dal calore e l'1% antibiotico e antimicotico. Incubare le cellule in un incubatore di 27 gradi per 72-96 ore. Scuotere delicatamente le piastre di trasfezione una volta al giorno quando possibile.Cercare i segni di infezione evidenti nelle cellule trasfette a 72-96 ore dopo il tempo di trasfezione. Da quattro a cinque giorni dopo la trasfezione, i segni di infezione dovrebbero essere evidenti nelle cellule trasfette rispetto alle cellule di controllo al microscopio invertito e i baculovirus ricombinanti iniziali secreti nel mezzo di coltura cellulare dovrebbero essere pronti per essere raccolti. Utilizzare un multicanale elettronico programmabile per consentire contemporaneamente la raccolta di virus P1, l'infezione di cellule SF9 appena sementi nell'infezione delle cellule sospese nei loro 24 blocchi di pozzo con 150 microlitri dei virus P1.Spin down il resto delle scorte virali collettive P1 per 15 minuti, coprire i 24 blocchi di pozzo con coltura di sospensione delle cellule SF9 infette con un foglio AirPore. Incubare il blocco di 24 pozzi a 27 gradi con tremori a 245 RPM per 72-96 ore. Quattro giorni prima del tempo di produzione programmato, dividere le cellule SF9 in crescita esponenziale, a una densità cellulare finale di 2 milioni per milione in filo interdentale di frullato di vetro Erlenmeyer con deflettori in mezzi di insetti senza siero contenenti 1% di antibiotico finale e antimicotico.Questo passaggio genererà una coltura di sospensione di cellule di insetti infette e virus P2 nel supernatante per l'infezione di nuove cellule nel lotto di produzione. Aggiungere i corrispondenti virus P2 e incubare le cellule infette alla temperatura inferiore di 25 gradi per rallentare la crescita cellulare, tremando a 165 RPM su uno shaker orbitale con un colpo di un pollice. Quattro giorni prima del tempo di produzione programmato, semina due litri di cellule SF9 in crescita esponenziale in mezzi senza siero di insetti alla densità cellulare di 1 milione per mil, nel pallone shake Fernbach da 2,8 litri.Scuotere il pallone a 27 gradi con trema a 150 RPM. La ricercatrice Ashley Hutchinson dimostrerà il seguente protocollo. Dividi quattro litri di cellule SF9 in crescita esponenziale e mezzi senza siero di insetti fino alla densità cellulare finale di 4 milioni per milione nelle grandi bottiglie di reagente da cinque litri.Aggiungere da 10 a 12 mils della coltura di sospensione delle cellule di insetti infettate da baculovirus. Incubare la coltura infetta delle cellule SF9 in uno shaker che scuote 145 giri/min a una temperatura inferiore di 25 gradi Celsius per 72-96 ore. Quantità milligrammi di diverse proteine ricombinanti della famiglia PRMT esprimono nel baculovirus la produzione immediata nelle cellule SF9 sono utilizzate per studi clinici biochimici biofisici, come si può vedere nella figura cinque.All'SGC, le strutture cristalline sono state risolte depositate nella banca dati proteica per l'intera lunghezza o le forme troncate delle proteine PRMT4, 6, 7 e 9 con varie sonde chimiche e inibitori. I plasmidi di espressione per questi PRMT sono stati depositati per aggiungere la raccolta genica da SGC e sono disponibili per la comunità di ricerca. In questo video, abbiamo sottolineato gli elementi chiave per lo screening di spedizione di successo del loro costrutto multiplo della proteina arginina metiltransferasi nella produzione su larga scala nel sistema di espressione del baculovirus.L'uso delle normali pipette multicanale regolabili e programmabili, ha reso il loro intero processo più rapido che efficiente. L'uso di sostanze tossiche per le cellule ad alte prestazioni e meno cellulari, il reagente di trasfezione per la generazione di virus ricombinanti ha portato a un rapporto costi-efficaci e a questo protocollo di trasfezione per la gestione cellulare. L'infezione del lotto su larga scala per la produzione di proteine con coltura di sospensione del baculovirus infettato in sei cellule ha ridotto significativamente le fatiche in un passo dispendioso in termini di tempo nell'amplificazione vitale dell'avviamento.È ad esempio, centrifugando questo con una coltura speciale di cellule infette. Questo è ovviamente escluso la gestione extra delle cellule infette in evitare nel loro più stretto nella degradazione del virus. La manutenzione delle celle di coltura delle sospensioni in questa produzione di scale up nel contenitore di coltura è stata un volume di campo elevato che ci ha aiutato a superare la limitazione del volume di produzione e ad adottare una piattaforma su larga scala.Questo è molto utile per i laboratori senza accesso ai bioreattori o spazio limitato nella pipeline di produzione. Sebbene il nostro protocollo sia stato descritto per le proteine della famiglia delle proteine arginina metiltransferasi, lo stesso approccio può essere applicato a qualsiasi altra famiglia di proteine che richiede una piattaforma di espressione per ottenere una quantità sufficiente della loro proteina per studi didattici biochimici biofisici.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Recombinant Protein Expression, Crystallization, and Biophysical Studies of a Bacillus-conserved Nucleotide Pyrophosphorylase, BcMazG

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Espressione proteica ricombinante, cristallizzazione e studi biofisici di a<em&gt; Bacillus</em&gt; -conservato nucleotide pirofosforilasi, BcMazG

To overcome safety restrictions and regulations when studying genes and proteins from true pathogens, their homologues can be studied. Bacillus anthracis ...

Ricerca

Biochimica

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