Name: production of recombinant prmt proteins using the baculovirus expression vector system
Uploaded: 2021-07-17T14:00:00
Duration: 8 min 57 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Production of Recombinant PRMT Proteins using the Baculovirus Expression Vector System at JoVE.com

Forfatterne ønsker å takke Dalia Barsyte-Lovejoy for å ha tatt seg tid til å gi verdifulle tilbakemeldinger og kritiske kommentarer til manuskriptet og alle våre SGC-kolleger som jobbet med PRMT-proteinfamilien uttrykt fra Baculovirus Expression Vector System.
SGC er en registrert veldedighetsorganisasjon (nummer 1097737) som mottar midler fra AbbVie, Bayer AG, Boehringer Ingelheim, Genentech, Genome Canada gjennom Ontario Genomics Institute [OGI-196], EU og EFPIA gjennom Innovative Medicines Initiative 2 Joint Foretak [EUbOPEN grant 875510], Janssen, Merck KGaA (aka EMD i Canada og USA), Pfizer, Takeda og Wellcome Trust [106169/ZZ14/Z].

<ol>
	<li>Guccione, E., Richard, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+regulation,+functions+and+relevance+of+arginine+methylation.">The regulation, functions and relevance of arginine methylation.</a> Nature Reviews in Molecular Cell Biology. 20 (10), 642-657 (2019).</li><li>Thandapani, P., O'Connor, T. R., Bailey, T. L., Richard, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+the+RGG/RG+motif.">Defining the RGG/RG motif.</a> Molecular Cell. 50 (5), 613-623 (2013).</li><li>Lorton, B. M., Shechter, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+consequences+of+arginine+methylation.">Cellular consequences of arginine methylation.</a> Cell and Molecular Life Sciences. 76 (15), 2933-2956 (2019).</li><li>Bedford, M. T., Clarke, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+arginine+methylation+in+mammals:+Who,+what,+and+why.">Protein arginine methylation in mammals: Who, what, and why.</a> Molecular Cell. 33 (1), 1-13 (2008).</li><li>Frankel, A., Brown, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+kinetic+data:+What+the+numbers+tell+us+about+PRMTs.">Evaluation of kinetic data: What the numbers tell us about PRMTs.</a> Biochimica Biophysica Acta Proteins Proteomics. 1867 (3), 306-316 (2018).</li><li>Li, A. S. M., Li, F., Eram, M. S., Bolotokova, A., Dela Se&#241;a, C. C., Vedadi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+probes+for+protein+arginine+methyltransferases.">Chemical probes for protein arginine methyltransferases.</a> Methods. 175, 30-43 (2020).</li><li>Savitsky, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+production+of+human+proteins+for+crystallization:+The+SGC+experience.">High-throughput production of human proteins for crystallization: The SGC experience.</a> Journal of Structural Biology. 172, 3-13 (2010).</li><li>Gileadi, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expressing+the+human+proteome+for+affinity+proteomics:+Optimizing+expression+of+soluble+protein+domains+and+in+vivo+biotinylation.">Expressing the human proteome for affinity proteomics: Optimizing expression of soluble protein domains and in vivo biotinylation.</a> New Biotechnology. 29 (5), 515-525 (2012).</li><li>Graslund, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+production+and+purification.">Protein production and purification.</a> Nature Methods. 5, 135 (2008).</li><li>Kost, T. A., Condreay, J. P., Jarvis, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Baculovirus+as+versatile+vectors+for+protein+expression+in+insect+and+mammalian+cells.">Baculovirus as versatile vectors for protein expression in insect and mammalian cells.</a> Nature Biotechnology. 23, 567-575 (2005).</li><li>Jarvis, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Baculovirus-insect+cell+expression+systems.">Baculovirus-insect cell expression systems.</a> Methods in Enzymology. 463, 191-222 (2009).</li><li>Shrestha, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Baculovirus+expression+vector+system:+an+emerging+host+for+high-throughput+eukaryotic+protein+expression.">Baculovirus expression vector system: an emerging host for high-throughput eukaryotic protein expression.</a> Methods in Molecular Biology. 439, 269-289 (2008).</li><li>Smith, G. E., Summers, M. D., Fraser, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+human+beta+interferon+in+insect+cells+infected+with+a+baculovirus+expression+vector.">Production of human beta interferon in insect cells infected with a baculovirus expression vector.</a> Molecular Cell Biology. 3, 2156-2165 (1983).</li><li>Invitrogen Life Technologies. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Invitrogen, Bac-to-Bac Baculovirus expression system. , (2010).</li><li>Luckow, V. A., Lee, S. C., Barry, G. F., Olins, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+generation+of+infectious+recombinant+baculoviruses+by+site-specific+transposon-mediated+insertion+of+foreign+genes+into+a+baculovirus+genome+propagated+in+Escherichia+coli.">Efficient generation of infectious recombinant baculoviruses by site-specific transposon-mediated insertion of foreign genes into a baculovirus genome propagated in Escherichia coli.</a> Journal of Virology. 67, 4566-4579 (1993).</li><li>Irons, S. L., Chambers, A. C., Lissina, O., King, L. A., Possee, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+Production+Using+the+Baculovirus+Expression+System.">Protein Production Using the Baculovirus Expression System.</a> Current Protocol in Protein Sciences. 91, 1-22 (2018).</li><li>Rieffel, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insect+cell+culture+in+reagent+bottles.">Insect cell culture in reagent bottles.</a> MethodsX. 1, 155-161 (2014).</li></ol>

Forfatterne erklærer ingen interessekonflikt.

En av fordelene med BEVS i insektceller sentrerer seg om evnen til postoversettelsesmodifikasjonsmaskineriet for å muliggjøre mer komplekse modifikasjoner som fosforylering, myristoylering og glykosylering. Sammen med den svært effektive foldingen av pattedyrproteiner, letter disse modifikasjonene høye mengder modifisert og brettet protein egnet for fysiologisk relevante nedstrømseksperimenter16.
Her beskrev vi detaljerte protokoller fra BEVS med vekt på kritiske elementer for vellykket uttrykksscreening av flere konstruksjoner av PRMT-proteiner og storskala PRMT-proteinproduksjon i Baculovirusuttrykksplattformen: 1) Bruk av vanlige, justerbare og programmerbare flerkanalspipetter for å overføre de biologiske materialene mellom 24- og 96 - brønncellekulturplater og blokker på stadier av bacmid DNA og virusgenerering; en samling av rekombinante virus, forsterkning av virusvolumer av rekombinante virus og fremstilling av proteinuttrykksscreeningsblokkene. 2) Høy ytelse og kostnadseffektive transfeksjonsreagenser for generering av rekombinante virus. 3) Suspensjon kultur av baculovirus-infiserte insektceller (SCBIIC) for storskala proteinproduksjon. 4) Utnyttelse av høyt fyllvolum 2,8 L Fernbach risteflasker for å opprettholde Sf9 suspensjon kultur og 2,5 L Tunair shake kolber og 5 L reagensflasker for storskala protein produksjon.
Spesielle hensyn og begrunnelse for transformasjons- og transfeksjonstrinnene. Selv om en kommersiell protokoll anbefaler å bruke 100 μL kompetente celler for en transformasjon14, er transformasjonseffektiviteten til kommersielle DH10Bac E. coli kompetente celler så høyt som 1 x 108 cfu / μg DNA, så vi bruker bare 4 μL. Dette er nok for hver transformant å oppnå isolerte hvite rekombinante kolonier for bacmid DNA-isolasjon. Adherent Sf9-celler i 24-brønns transfeksjonsplaten ble sådd med en celletetthet på 2 x 105 / ml i 0,5 ml serumfrie insektmedier. Dette volumet er nok til å sikre jevn dekning av brønnens arbeidsflate. Samtidig fortynner det ikke transfeksjonsblandingen for mye, noe som forbedrer transfeksjonseffektiviteten. Transfeksjonsreagenser er ikke giftige for Sf9-cellene, og medieutveksling er ikke nødvendig. I stedet for en medieendring legges ytterligere 1,5 ml medier som inneholder 10% (v / v) FBS til transfeksjonsplaten etter 4-5 timer etter transfeksjonstid for å lette celleveksten. Transfeksjonseffektiviteten til begge transfeksjonsreagensene er høy. Likevel, med X-tremeGene 9, vises tegn på infeksjon i de transfekterte cellene (figur 2) 10-12 timer tidligere enn med JetPrime-reagenset, så vi velger mellom disse reagensene avhengig av arbeidsplanen for de neste trinnene i protokollene, noe som gir litt fleksibilitet i den generelle prosessen.
Screening av proteintestuttrykk kan settes opp med P2-virus hvis mengden av de første rekombinante virusene, samlet inn fra transfeksjonsplaten og merket som P1, er en begrensende faktor å bruke til proteinuttrykksscreening.
Hensyn ved flytting fra små til store kulturvolumer. Historisk ble det antatt at optimal cellevekst krever et høyt luftrom i suspensjonskulturen for Sf9-cellevedlikehold og oppskaleringsproduksjoner. I 2014 ble det imidlertid rapportert at høyt luftrom i kulturfartøy er mindre kritisk enn tidligere antatt17. Et kulturfartøy satt opp ved hjelp av riktig justert ristehastighet til risteplattformens banekast vil gi tilstrekkelig oksygenoverføring selv i høyfyllvolumfjæringskulturen ved å skape og opprettholde små luftbobler i lengre tid. Med denne tilnærmingen kan kommersielt tilgjengelige insektceller dyrkes med høyere ristehastighet innenfor et normalt område av cellenes doblingstid uten å ofre høy celle levedyktighet.
For 6 år siden begynte vi derfor å øke fjæringskulturvolumet i en ristende kolbe under cellevedlikehold og introduserte en annen type kulturfartøy for proteinproduksjon mens vi justerte og overvåket risteforholdene (Figur 6). For å etablere optimale forhold i disse kulturfartøyene overvåket vi Sf9-cellekulturparametrene som celledoblingstid sammen med celle levedyktighet, størrelse og form, aggregeringstilstand og infektivitet av celler.
For eksempel, for Sf9 cellevedlikehold, i 2,8 L Fernbach riste kolber, kulturer vi 2 L i stedet for 0,8 L av Sf9-suspensjonscellene som rister ved 150 rpm ved 27 ° C og celle levedyktighet mesteparten av tiden er nær 99%, med jevnt formede sunne skilleceller. For oppskaleringsproduksjon infiserer vi 4 L celler i 5 L reagensflasker som rister i høy hastighet som 145 o/min ved en senket temperatur på 25 °C. De mest brukte inkubatorene med en innebygd risteplattform kan holde 6 x 2,8 L risteflasker eller 6 x 5 L reagensflasker, eller 10 x 2,5 L Tunair shakeflasker. Dermed er kapasiteten til den ene risteplattformen, hvis vi fyller Fernbach risteflasker og reagensflasker til 1/3 versus det høyefyllingsvolumet på fartøyene, 4,8 L versus 12 L ved hjelp av 2,8 L Fernbach risteflasker og 10 L versus 24 L ved hjelp av 5 L reagensflasker (Figur 6). Vedlikehold av suspensjonscellekultur og oppskalering av produksjonen i kulturfartøyene med høyt fyllingsvolum har hjulpet oss med å overvinne begrensninger i produksjonsvolumene og ta i bruk en storskala plattform. Dermed er dette svært nyttig for laboratorier uten tilgang til bioreaktorer og / eller begrenset plass i produksjonsrørledningene.
Denne protokollen kan enkelt tilpasses for produksjon og rensing av proteinkonstruksjoner med forskjellige affinitetskoder ved å bruke passende harpikser og modifisere rensebuffere som beskrevet i SGC-publisert papir6 for flaggmerkede proteiner i full lengde av PRMT4, 7, 9 og det His-tagged PRMT5-MEP50-komplekset og PRMT6. Selv om vi beskriver en BEVS-protokoll for PRMT-familien av proteiner, kan den samme tilnærmingen brukes på enhver annen proteinfamilie.

Protein arginin metyltransferaser (PRMTs) metylat argininrester på en monometyl- eller symmetrisk/asymmetrisk dimetylmote. De repeterende RG / RGG / GRG-sekvensene er svært foretrukket av de fleste PRMTs og finnes i et bredt utvalg av proteiner1,2. Arginin metylerte proteiner som histoner eller transkripsjonsfaktorer og skjøtefaktorer regulerer transkripsjon, skjøting og kromatinstruktur3,4. Økende kunnskap om mangfoldig regulering av substrat- og kofaktorutnyttelse, omsetning og kinetikk av PRMTs, samt generering av selektive inhibitorer, har kastet mekanistisk lys over disse enzymene og deres komplekser5,6. Imidlertid studeres ikke alle PRMT-familiemedlemmer i samme grad; PRMT9 ble for eksempel bare nylig oppdaget å være medlem av PRMT-familien1. Struktur- og enzymfunksjonsstudier for disse proteinene krever tilstrekkelig, ofte milligram, mengder rekombinant protein for å være tilgjengelig.
Escherichia coli (E. coli) prokaryotisk uttrykkssystem er vanligvis førstevalget for expression screening ved hjelp av flere konstruksjoner for et gitt protein7,8,9. E. coli-basertuttrykk resulterer imidlertid ikke alltid i tilstrekkelige mengder PRMT-proteiner i deres aktive former, som vi spesielt har nevnt for PRMT5 og PRMT7 (se nedenfor). Dermed ble PRMTs som ikke klarte å uttrykke seg i E. coli eller måtte produseres av eukaryotic expression machinery subcloned i vektorer som passer for uttrykket screening i det alternative baculovirus expression vector system (BEVS). Mens E. coli uttrykte prøver av PRMT1, PRMT3 og PRMT8 har blitt brukt mye for in vitro-analyser og krystallografi, har andre PRMT-er som PRMT5, som krever MEP50 bindende partner for sitt doble metyltransferasedomene, og PRMTs som PRMT7 og 9, nødvendiggjøre insektcelleuttrykk for å oppnå tilstrekkelige mengder aktivt protein. Totalt sett har standardisert medium-gjennomstrømning metyltransferaseanalyser for PRMT4, 5, 6, 7 og 9 brukt BEVS i insektceller6. Baculovirus expression vector system (BEVS) er en allsidig plattform for å produsere rekombinante proteiner som krever eukaryotisk uttrykk maskineri som muliggjør post-translasjonelle modifikasjoner avgjørende for biokjemiske, biofysiske og strukturelle studier10,11,12. Flere BEVSs har blitt kommersielt tilgjengelige siden den første rapporterte bruken av baculovirus i 1983 for proteinuttrykk13. De fleste av disse protokollene bruker forskjellige strategier for overføring av uttrykket plasmid til insektceller. Disse inkluderer Bac-to-Bac, flashBAC, BaculoGOLD Bright, BacVector-3000, BacMagic, BacPAK, etc. Vår protokoll er basert på det mest brukte systemet i BEVS, Bac-to-Bac-systemet14, som er designet for å overføre genet / cDNA-kodingen av proteinet av interesse (POI, her PRMTs) til baculovirusgenomet opprettholdt i en spesialisert stamme av E. coli via stedsspesifikk transposisjon15.
Kort sagt ble den plasmidoverføringsvektoren som inneholder genet av interesse forvandlet til DH10Bac E. coli kompetente celler for å generere rekombinant viral bacmid DNA. Adherent Sf9 celler ble deretter transfektert med bacmid DNA. Fire til fem dager etter transfeksjon ble de første rekombinante baculovirusene utskilt i cellekulturmediet gjenopprettet og merket som P1-viruset. P1-bakulovirusbestandene ble deretter brukt til virusforsterkning (dvs. generering av P2-bakulovirusbestander) og proteinuttrykksscreening. Basert på resultatene fra uttrykksscreening ble P2-virus for den beste uttrykkskonstruksjonen av proteinet identifisert og brukt til å generere suspensjonskulturer av baculovirusinfiserte insektceller (SCBIIS) for den store proteinproduksjonen. Her beskriver vi våre detaljerte protokoller og beskriver begrunnelsen bak våre reagens- og kulturfartøyvalg for å støtte vår strategi om å utvikle en mer tidseffektiv, kostnadseffektiv og skalerbar metodikk for å oppnå tilstrekkelige mengder ønskede rekombinante proteiner.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2.8L Nalgene&#160; Fernbach Culture Flask, Polycarbonate,</td>
			<td>Nalgene</td>
			<td>29171-854</td>
			<td>For large scale maintenance of suspension culture of Sf9 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-Well Blocks RB</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>19583</td>
			<td>For incubation of&#160; 4ml of suspension&#160; Sf9 cells&#160; for protein&#160; expression screening</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-20 Criterion TGX Gel 26W 15 ul</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>5671095</td>
			<td>For SDS-PAGe analysis of the purified proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50ml Reagent Reservoir</td>
			<td>Celltreat Scientific Products</td>
			<td>229290</td>
			<td>&#160;Reservoir used for diluted transfection reagent&#160; and Sf9 cells suspension</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well cap mat, for use with square well, 2 mL</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>381080</td>
			<td>Used to cover 96 well block</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well PCR plate</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30129300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto agar</td>
			<td>BD</td>
			<td>214010</td>
			<td>For LB-agar selection paltes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Airpore Tape Sheets</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>19571</td>
			<td>To cover 24 well blocks for protein expression screening</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Allega X-15R Centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>392932</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic Antimycotic (100x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15240112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacmid DNA</td>
			<td>in-house</td>
			<td>non-catalog item</td>
			<td>Bacmid DNA for baculovirus production</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bluo-Gal, 1g</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15519028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beckman JLA 8.1000</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Plates, 24-Well, with lid, flat bottom, sterile</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30722116</td>
			<td>Tissue&#160; culture treated plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Resuspension Solution 0.5&#160;L</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>LSKCRS500</td>
			<td>For Bacmid DNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell&#160;Lysis Solution 0.5&#160;L</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>LSKCLS500</td>
			<td>For Bacmid DNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CELLSTAR&#160; Tissue Culture Plates, 96 well</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>655180</td>
			<td>For transfection mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ClipTip 1250, filter reload, sterile</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>94420818</td>
			<td>Tips for&#160; programmable and adjustable multichannel pipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP Mix (25 mM each)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>R1121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E1-ClipTip&#160; Electronic Adjustable Tip Spacing Multichannel Equalizer Pipette, 15 to 1250 &#956;L</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>4672090BT</td>
			<td>Programmable and adjustable multichannel pipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E4&#160; XLS adjustable spacer 6-channel pipette, 20-300 &#956;L</td>
			<td>Ranin</td>
			<td>LTS EA6-300XLS</td>
			<td>Ranin adjustable multichannel pipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter microplate, 96-well, polypropylene, with 25 &#181;m ultra high molecular weight polyethylene membrane</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>201005-100</td>
			<td>For protein purification in expression screening</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Full-Baffle Flask Kit Tunair, 2.5L</td>
			<td>IBI Scientific</td>
			<td>SS-6003C</td>
			<td>For large scale protein production in suspension culture of SF9 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin 10x10ml</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>15750078</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat Inactivated Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Wisent Biocenter</td>
			<td>080-450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>I-Max Insect Media W/ L-Glutamine, 1 L</td>
			<td>Wisent Biocenter</td>
			<td>301-045-LL</td>
			<td>Serum free insect cells growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>InstantBlue, Ultrafast Protein Stain</td>
			<td>Expedeon Protein Solutions</td>
			<td>ISB1L-1L</td>
			<td>For protein gel (SDS-PAGE) staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iptg, Ultra Pure, Dioxane Free, Min 99.5%</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>IPT001.100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JetPRIME Transfection Reagent&#160; Provided with&#160; jetPRIME buffer</td>
			<td>POLYPLUS TRANSFECTION Inc</td>
			<td>114-01</td>
			<td>For Sf9 cells transfection to generate baculovirus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin Monosulfate</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>KAN201.100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lb Broth (Lennox), Powder Microbial Gro&#38;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L3022-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterblock 96 deep well 2.4mL</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>780285-FD</td>
			<td>Used in the transformation and expression screening procedures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Max Efficiency DH10Bac Competent Cells , 0.5ml</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>10361012</td>
			<td>Competent cells for bacmid DNA generation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mLINE 12-Channel Pipette, adjustable 30 - 300 uL</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>Sartorius 725240</td>
			<td>12 channel pipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neutralization Solution, 0.5&#160;L</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>LSKNS0500</td>
			<td>For bacmid DNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>New Brunswick&#160; Innova 44R, 120V, orbit 2.5 cm (1 in)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>M1282-0004</td>
			<td>Shaker incubator for incubaion of suspension of Sf9 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA Agarose</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>30250</td>
			<td>For protein purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>LS15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PYREX&#160; Delong Shaker Erlenmeyer Flask with Baffles, Corning&#160; 500ml</td>
			<td>Pyrex</td>
			<td>4444-500</td>
			<td>For&#160; suspension culture of Sf9 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PYREX Delong Shaker Erlenmeyer Flask with Baffles, Corning&#160; 125ml</td>
			<td>Pyrex</td>
			<td>4444-125</td>
			<td>For suspension culture of Sf9 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PYREX Delong Shaker Erlenmeyer Flask with Baffles, Corning&#160; 250ml</td>
			<td>Pyrex</td>
			<td>4444-250</td>
			<td>For suspension culture of Sf9 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RedSafe&#160;Nucleic&#160;Acid&#160;Staining&#160;Solution</td>
			<td>Froggabio</td>
			<td>21141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase A, 0.9&#160;mL</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>LSKPMRN30</td>
			<td>For suspension buffer for bacmid DNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roll &#38; Grow Spherical Glass Plating Beads</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>115000550</td>
			<td>For&#160; spread&#160; of bacterial&#160; cells across the surface of an agar plate.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RT-LTS-A-300&#956;L-768/8 (tips)</td>
			<td>Ranin</td>
			<td>30389253</td>
			<td>Tips for ranin multichannel pipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S.O.C. Medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15544034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serum, Cell Culture, Fetal Bovine Serum (Fbs), Hyclone, Characterized Canadian</td>
			<td>cytivalifesciences</td>
			<td>SH3039602</td>
			<td>Addition to the serum free medim for&#160; the transfected cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sf9 cells</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>12659017</td>
			<td>Insect cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sfx-Insect Cell Culture Media</td>
			<td>Cytiva (Formerly GE Healthcare Life Sciences)</td>
			<td>SH3027802</td>
			<td>Serum free insect cells growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tape Pad</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>19570</td>
			<td>Tape Pad</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taq DNA Polymerase with ThermoPol Buffer - 2,000 units</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0267L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetracycline Hcl</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>TET701.10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue 0.4% Solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15250061</td>
			<td>For&#160; assessment of cell viability</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VITLAB&#160; Reagent Bottles, PP with Screw Caps, PP, BrandTech, 5L</td>
			<td>VITLAB</td>
			<td>V100889</td>
			<td>For large scale protein production in suspension culture of Sf9 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR&#160; Digital Mini Incubator</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10055-006</td>
			<td>Incubator for adherent Sf9 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR&#160; Incubating Microplate Shaker</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97043-606</td>
			<td>Incubator for suspension culture of Sf9 cells in 24 well blocks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Petri Dishes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>CA73370-037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-tremeGene 9 DNA&#160; Transfection Reagent&#160; 1.0 M</td>
			<td>Roche</td>
			<td>6365787001</td>
			<td>For Sf9 cells transfection to generate recombinant baculovirus</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

production of recombinant prmt proteins using the baculovirus expression vector system

Protein arginin metyltransferaser (PRMTs) metylat argininrester på et bredt utvalg av proteiner som spiller roller i mange cellulære prosesser. PRMTs kan enten mono- eller dimetylat arginin guanidino grupper symmetrisk eller asymmetrisk. Enzymologien til disse proteinene er et komplekst og intenst undersøkt område som krever milligram mengder rekombinant protein av høy kvalitet. Baculovirus expression vector system (BEVS) som bruker Autographa californica flere nucleopolyhedrovirus (AcMNPV) og Spodoptera frugiperda 9 (Sf9) insektceller har blitt brukt til expression screening og produksjon av mange PRMTs, inkludert PRMT 1, 2 og 4 til 9. For samtidig å screene for uttrykk for flere konstruksjoner av disse proteinene, inkludert domener og avkortede fragmenter samt proteiner i full lengde, har vi brukt skalerbare metoder ved hjelp av justerbare og programmerbare flerkanals pipetter, kombinert med 24- og 96-brønnsplater og blokker. Samlet sett gjorde disse metodejusteringene det mulig med en storskala generasjon bacmid-DNA, rekombinante virus og screening av proteinuttrykk. Bruk av kulturfartøy med et høyt fyllvolum av Sf9 cellefjæring bidro til å overvinne plassbegrensninger i produksjonsrørledningen for enkelt batch storskala proteinproduksjon. Her beskriver vi detaljerte protokoller for effektivt og kostnadseffektivt uttrykk for funksjonelle PRMTer for biokjemiske, biofysiske og strukturelle studier.

En oversikt over BEVS-protokollen er beskrevet i figur 1. Flere uttrykkskonstruksjoner av PRMT-er, inkludert full lengde, domener og avkortede fragmenter, ble generert ved Structural Genomics Consortium (SGC, Toronto) i henhold til interne strategier med et forsøk på å øke suksessraten for å identifisere løselige og stabile proteiner med et relativt høyt uttrykksnivå7,9. Interesserte lesere oppfordres til å gjennomgå SGCs definisjoner og metodikk for å designe et "fragment" som segmentet av gensekvensen innlemmet i en uttrykksklone, "domene" som et PFAM-kommentert strukturelt domene, og "konstruere" som fragmentet klonet i en uttrykksvektor, som alle er beskrevet i detalj i en tidligere publikasjon7. Uttrykkskonstruksjoner av PRMTs presentert i denne protokollen er for produksjon av polyhistidin-taggede proteiner klonet inn i pFBOH-MHL-vektoren, som er et derivat av pFastBac1-vektoren. I figur 4presenterer vi SDS-PAGE-analyse av de hismerkede løselige konstruksjonene til PRMT1, 2, 4-9 renset fra pellets samlet etter 4 ml produksjon i Sf9-celler (trinn 3.1.4). Full lengde (FL) PRMT1 og PRMT9 er ikke presentert i denne gelen, siden FL PRMT1 er produsert fra E. coli, og FL PRMT9 produsert fra BEVS har blitt renset av Flag-tag6. De avkortede konstruksjonene til PRMT1, FL PRMT4 og alle PRMT8-konstruksjonene viser et relativt høyt utbytte, men protein eluates inneholder brøkdeler av korensede forurensninger. Disse konstruksjonene krever ytterligere optimalisering av renseprotokollene. Ytterligere tilnærminger er derfor nødvendig for å forbedre renheten til disse proteinene fra oppskaleringsproduksjoner, for eksempel en reduksjon i mengden nikkelperler på inkubasjonens stadium med en avklart lysat; en økning av imidazolkonsentrasjonene i vaskebufferne; spalting av His-tag med TEV-protease, etterfulgt av anvendelse på en Ni-affinitetharpiks; og ytterligere rensetrinn som størrelsesekskludering og ionutvekslingskromatografi. Konstruksjonene av PRMT2 viser betydelig lavere utbytte sammenlignet med andre proteiner og PRMT2-protein i full lengde ledsaget av et sterkt forurensningsbånd. Oppskaleringsproduksjon og to trinn med rensing som IMAC og størrelsesekskludering bekreftet et lavt uttrykksnivå for denne konstruksjonen sammen med vedvarende tilstedeværelse av korensende forurensning for FL-proteinet. Rene proteiner er oppnådd for PRMT5-komplekset produsert og renset med sin obligatoriske bindende partner, MEP50. Den avkortede konstruksjonen til PRMT9 har nesten to eller tre ganger lavere uttrykksnivå, nær 1,5 mg/l, sammenlignet med andre PRMT-er. Likevel har de rekombinante virusbestandene i denne konstruksjonen blitt brukt til oppskaleringsproduksjon, diffracting krystaller ble oppnådd, og strukturen ble løst for dette proteinet sammen med PRMT4, 6 og 7 (Figur 5).
For oppskaleringsproduksjonene ble de tilsvarende P2-virusene brukt til å infisere suspensjonskulturen til Sf9 insektceller. Dette trinnet genererer 50/100/200 ml baculovirusinfiserte celler som inneholder infiserte celler og P3-virus i supernatanten. For den store proteinproduksjonen ble 2 L Sf9-celler dyrket i hver av 2,8 L Fernbach risteflasker ved 150 o/min, 27 °C (figur 6). På produksjonsdagen > 2 L Sf9-celler (celle levedyktighet > 97%) i 2,5 L Tunair shake kolber eller 4 L i 5 L reagensflasker ble fortynnet til en celletetthet på 4 x 106/ ml. Disse cellene ble smittet direkte med 10-12 ml / l suspensjonskultur av baculovirusinfiserte insektceller og inkubert ved en senket temperatur på 25 °C, ved 145 o/min. Infeksjon av produksjonspartiet direkte med en suspensjonskultur av baculovirus-infiserte insektceller reduserte betydelig arbeidskrevende og tidkrevende trinn i virusvolumforsterkning, unntatt den ekstra håndteringen av de infiserte cellene, og unngikk reduksjon i titer og virusforringelse. SF9 cellekulturvedlikehold og oppskaleringsproduksjon er gjort i kulturfartøyene med høyt fyllvolum for å vedta en storskala proteinproduksjon i den ene batchen (figur 6).
Full lengde PRMT 4, 5 (i kompleks med MEP50), 6, 7 og 9 proteiner produsert fra Baculovirus mediert produksjonsplattform har blitt brukt til kinetisk karakterisering og inhibitor sammensatt screening ved SGC6. Krystallstrukturer ble løst og deponert i Protein Data Bank (PDB) for full lengde eller avkortede former for proteinene PRMT 4, 6, 7 og 9 med ulike kjemiske sonder og inhibitorer. Uttrykksplasmider for disse PRMT-ene ble deponert i Addgene plasmid-repositoriet (Addgene er en distribuerende partner for SGC, https://www.addgene.org/) og er tilgjengelig for forskningsmiljøet (Figur 5).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62510/62510fig01.jpg"> Figur 1: Skjematisk oversikt over trinnene i baculovirusuttrykksprosessen <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62510/62510fig01large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62510/62510fig02.jpg"> Figur 2: Baculovirus Infiserte og uinfiserte Sf9-celler. Tegn på infeksjon er strukturelle endringer i insektcellene, for eksempel en 25-50% økning i cellediameteren, forstørrede cellekjerner, jevnt avrundet form, tap av spredning og overholdelse av kulturrettens overflate, samt en reduksjon i celle levedyktighet. Hvit skala bar 200 μm. Tegn på infeksjon presentert her er de samme for de transfekterte cellene ved hjelp av både transfeksjonsreagenser, JetPrime og X-tremeGene 9. Det spesielle eksemplet som vises er for JetPrime-transfeksjonsreagensen. (A) Uinferte Sf9-celler som en kontroll. (B) Baculovirus-infiserte Sf9 celler. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62510/62510fig02large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62510/62510fig03.jpg"> Figur 3: Bindingsplatemontering for rask rensing av testuttrykksproteiner. Se tekst for mer informasjon, trinn 3.2.1-2 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62510/62510fig03large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62510/62510fig04.jpg"> Figur 4: Resultater av screening av proteinuttrykk. Proteinuttrykk screening resultater av baculovirus mediert protein produksjon i 4 ml Sf9 suspensjon kultur infisert med tilsvarende P1 rekombinante virus for ulike PRMTs og PRMT5-MEP50 komplekset. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62510/62510fig04large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62510/62510fig05.jpg"> Figur 5: Sammendrag av uttrykkskonstruksjoner for PRMT4, 6, 7 og 9 som brukes til krystallstrukturstudier ved Structural Genomics Consortium, Toronto (SGC). Krystallstrukturene ble løst og deponert i Protein Data Bank (PDB) for full lengde eller avkortede former for proteiner PRMT 4, 6, 7 og 9 med ulike kjemiske sonder og inhibitorer. Uttrykksplasmider for disse PRMT-ene ble deponert i Addgene plasmid-depotet og er tilgjengelige for forskningsmiljøet (Addgene er en distribuerende partner for SGC, https://www.addgene.org/). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62510/62510fig05large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62510/62510fig06.jpg"> Figur 6: Sf9 insektcellevedlikehold og proteinproduksjon i de ulike kulturfartøyene: (A) 2,8 L Fernbach-kolbe for cellevedlikehold og proteinproduksjon. Bruken av 72% påfyllingsvolum øker gjennomstrømningshastigheten med 2,5 ganger i en risteplattform. (B) Tunair shake kolber (bare 9 kolber av 10 presenteres på dette bildet) og reagensflasker med et 80% fyllvolum øker risteplattformens produksjonskapasitet drastisk. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62510/62510fig06large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Production of Recombinant PRMT Proteins using the Baculovirus Expression Vector System at JoVE.com

Production of Recombinant PRMT Proteins using the Baculovirus Expression Vector System

Baculovirus expression vector system (BEVS) er en robust plattform for expression screening og produksjon av protein arginin metyltransferaser (PRMTs) som skal brukes til biokjemiske, biofysiske og strukturelle studier. Milligram mengder materiale kan produseres for de fleste PRMTs og andre proteiner av interesse som krever en eukaryotisk uttrykksplattform.

Produksjon av rekombinante PRMT-proteiner ved hjelp av Baculovirus Expression Vector System

Protein arginine methyltransferases (PRMTs) methylate arginine residues on a wide variety of proteins that play roles in numerous cellular processes. ...

Det overordnede målet med denne protokollen er uttrykksscreening av flere konstruksjoner av protein arginin metyltransferaser i storskala produksjon for å oppnå milligrammengden av proteinet for biokjemisk, biofysisk og strukturelle studier i middels støttet, kostnadseffektiv modus i dekningen av uttrykksplattform S, baculovirusuttrykksvektorsystem. Dr.Alma Seitova vil presentere følgende trinn. Fortynn de eksponentielt voksende SF9-cellene til den endelige celletettheten på 0,4 millioner per mil i det serumfrie insektmediet, og hell i det sterile reagensreservoaret.Bruk en programmerbar flerkanals pipette til å frø 0,5 mil av de fortynnede SF9-cellene til hver brønn av 24-brønnsplaten. Dette volumet er nok til å sikre jevn dekning av brønnens arbeidsflate. Samtidig fortynner det ikke transfeksjonsblandingen for mye, noe som muliggjør transfeksjonseffektivitet.Merk en brønn av platen som bare celle, og bruk den som en kontroll for sammenligning av den transfekterte og ikke-transfekterte cellen for å vurdere for potensielle tegn på infeksjon. Inkuber platene ved 27 grader til det trengs, omtrent en time, for å la cellene feste seg til cellekulturplatene. Fortynn godt blandet transfeksjonsreagens i det unsupplementerte insektmediet og et sterilt reagensreservoar, og bland forsiktig i 10 sekunder.Bruk en 12-kanals pipette og overfør 102 mikroliter av det fortynnede transaksjonsreagenset til en steril 96 MicroWell-plate. Overfør 10 mikroliter 0,2 mikrogram per mikroliter rekombinant bacmid DNA til den tilsvarende brønnen til den 96-brønns MicroWell-platen og bland ved å riste forsiktig og banke platen fra sidene. Inkuber transfeksjonsblandingen i 15 til 20 minutter for en kompleks formasjon.Bruk en justerbar sekskanals pipette designet for overføring mellom en 96- og 24-brønnsplate, overlegg transfeksjonsblandingen på cellene drop-wise i tilsvarende brønner på transfeksjonsplatene, og inkuber i fire timer ved 27 grader. For å sikre jevn fordeling av transfeksjonsblandingen over cellenes monolayer, rock platene forsiktig frem og tilbake flere ganger i inkubasjonstiden. Fire til fem timer etter transfeksjonstid, legg til 1,5 mil serumfrie insektmedier.Suppler det med 10% endelig av varmeinaktivert foster bovint serum og 1% antibiotika og antimykotisk. Inkuber celler i en 27-graders inkubator i 72 til 96 timer. Gyng transfekksjonsplatene forsiktig en gang om dagen når det er mulig.Se etter tegn på infeksjon tydelig i transfekterte celler ved 72 til 96 timer etter transfeksjonstid. Fire til fem dager etter transfeksjon bør tegn på infeksjon være tydelig i de transfekterte cellene i forhold til kontrollcellene under et invertert mikroskop, og de første rekombinante baculovirusene som utskilles i cellekulturmediet, bør være klare til å samle seg. Bruk en programmerbar elektronisk flerkanals for å tillate samtidig innsamling av P1-virus, infeksjon av nyseedede SF9-celler i infeksjon av suspensjonsceller i sine 24 brønnblokker med 150 mikroliter P1-virus.Spinn ned resten av de kollektive P1-viruslagrene i 15 minutter, dekk de 24 brønnblokkene med suspensjonskulturen til de infiserte SF9-cellene med et AirPore-ark. Inkuber 24 brønnblokken ved 27 grader med risting ved 245 RPMer i 72 til 96 timer. Fire dager før planlagt produksjonstid, splitt eksponentielt voksende SF9 celler, på en endelig celle tetthet på 2 millioner per mil i Erlenmeyer glass shake floss med baffles i serumfrie insektmedier som inneholder 1% endelig antibiotika og antimykotisk.Dette trinnet vil generere suspensjonskultur av infiserte insektceller og P2-virus i supernatanten for infeksjon av nye celler i produksjonspartiet. Legg til de tilsvarende P2-virusene og inkuber infiserte celler ved lavere temperatur på 25 grader for å bremse celleveksten, rist på 165 RPMer på en orbital shaker med ett tomme slag. Fire dager før planlagt produksjonstid, Frø to liter eksponentielt voksende SF9 celler i insektsserumfrie medier til celletettheten på 1 million per mil, i 2,8 liter Fernbach shake kolbe.Rist kolben på 27 grader med risting ved 150 RPMer. Forsker Ashley Hutchinson vil demonstrere følgende protokoll. Del fire liter eksponentielt voksende SF9-celler og insektsserumfrie medier til den endelige celletettheten på 4 millioner per mil i de store fem liter reagensflaskene.Tilsett 10 til 12 mil av suspensjonskulturen til de baculovirus infiserte insektcellene. Inkuber den infiserte kulturen til SF9-cellene i en shaker som rister ut 145 RPM ved en lavere temperatur på 25 grader Celsius i 72 til 96 timer. Milligram mengder av flere rekombinante proteiner fra PRMT-familien uttrykker i baculovirus umiddelbar produksjon i SF9 celler brukes til biokjemiske biofysiske instruksjonsstudier, som det fremgår av figur fem.Ved SGC ble krystallstrukturer løst i deponert i proteindatabanken for full lengde eller avkortede former for proteinene PRMT4, 6, 7 og 9 med ulike kjemiske sonder og hemmere. Uttrykksplasmider for disse PRMT-ene ble deponert for å legge til gensamling av SGC og er tilgjengelige for forskningsmiljøet. I denne videoen har vi lagt vekt på viktige elementer for vellykket ekspedisjonsscreening av deres multippel konstruksjon av proteinet arginin metyltransferaser i storskalaproduksjonen i baculovirusuttrykkssystemet.Bruk av de vanlige justerbare og programmerbare flerkanals pipettene gjorde hele prosessen raskere enn effektiv. Bruk av høy ytelse og mindre celletoksisk for cellene, transfeksjonsreagens for generering av rekombinante virus førte til mer kostnadseffektiv og denne cellehåndteringstransfeksjonsprotokollen. Infeksjon av storskala batch for proteinproduksjon med suspensjonskultur av baculovirus smittet i seks celler reduserte arbeidet betydelig i tidkrevende trinn i vital startforsterkning.Er for eksempel sentrifugering dette med spesiell kultur av infiserte celler. Det er selvfølgelig i utelukket ekstra håndtering av de infiserte cellene i unngå i deres strammere i virusforringelse. Suspensjon kultur kultur celle vedlikehold i denne skalaen opp produksjonen i kulturfartøyet var høyt feltvolum hjelpe oss å overvinne begrensning av produksjonsvolumet og vedta en storskala plattform.Dette er svært nyttig for laboratoriene uten tilgang til bioreaktorer eller begrenset plass i produksjonsrørledningen. Selv om vår protokoll er beskrevet for proteinene i proteinet arginin metyltransferaser familien, kan den samme tilnærmingen brukes på andre proteiner familie som krever uttrykk plattform for å oppnå en tilstrekkelig mengde av deres protein for biokjemiske biofysiske instruksjonsstudier.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Recombinant Protein Expression, Crystallization, and Biophysical Studies of a Bacillus-conserved Nucleotide Pyrophosphorylase, BcMazG

Recombinant Protein Expression, Crystallization, and Biophysical Studies of a Bacillus-conserved Nucleotide Pyrophosphorylase, BcMazG

Rekombinant Proteinuttrykk, Krystallisering og Biofysiske Studier av a<em&gt; Bacillus</em&gt; -konserverte nukleotidpyrofosforylase, BcMazG

To overcome safety restrictions and regulations when studying genes and proteins from true pathogens, their homologues can be studied. Bacillus anthracis ...

Transient Expression in Nicotiana Benthamiana Leaves for Triterpene Production at a Preparative Scale

Transient Expression in Nicotiana Benthamiana Leaves for Triterpene Production at a Preparative Scale

Forbigående uttrykk i Nicotiana Benthamiana forlater Triterpene produksjon i skytevåpen skala

The triterpenes are one of the largest and most structurally diverse families of plant natural products. Many triterpene derivatives have been shown to ...

Modifying Baculovirus Expression Vectors to Produce Secreted Plant Proteins in Insect Cells

Endre Baculovirus uttrykk vektorer å produsere utskilles anlegget proteiner i insekt celler

It has been a challenge for scientists to express recombinant secretory eukaryotic proteins for structural and biochemical studies. The ...

Large-scale Production of Recombinant RNAs on a Circular Scaffold Using a Viroid-derived System in Escherichia coli

Large-scale Production of Recombinant RNAs on a Circular Scaffold Using a Viroid-derived System in Escherichia coli

Storskalaproduksjon av rekombinant RNAs på en sirkulær stillaset med en Viroid-avledet System i Escherichia coli

With increasing interest in RNA biology and the use of RNA molecules in sophisticated biotechnological applications, the methods to produce large amounts ...

Use of Recombinant Fusion Proteins in a Fluorescent Protease Assay Platform and Their In-gel Renaturation

Bruk av rekombinant Fusion proteiner i en fluorescerende Protease analysen plattform og deres i-gel-Renaturation

Proteases are intensively studied enzymes due to their essential roles in several biological pathways of living organisms and in pathogenesis; therefore, ...

Localization of SUMO-modified Proteins Using Fluorescent Sumo-trapping Proteins

Lokalisering av SUMO-modifisert proteiner bruke fluorescerende Sumo-fangst proteiner

Here we are presenting a novel method to study the sumoylation of proteins and their sub-cellular localization in mammalian cells and nematode oocytes. ...

Expression, Purification, Crystallization, and Enzyme Assays of Fumarylacetoacetate Hydrolase Domain-Containing Proteins

Uttrykk, rensing, krystallisering, og enzym analyser av Fumarylacetoacetate Hydrolase domene-inneholdende proteiner

Fumarylacetoacetate hydrolase (FAH) domain-containing proteins (FAHD) are identified members of the FAH superfamily in eukaryotes. Enzymes of this ...

Characterization of Membrane Transporters by Heterologous Expression in E. coli and Production of Membrane Vesicles

Characterization of Membrane Transporters by Heterologous Expression in E. coli and Production of Membrane Vesicles

Karakterisering av membran transportører av Heterologous uttrykk i E. coli og produksjon av membran blemmer

Several methods have been developed to functionally characterize novel membrane transporters. Polyamines are ubiquitous in all organisms, but polyamine ...

Transverse Sectioning of Mature Rice (Oryza sativa L.) Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Transverse Sectioning of Mature Rice Oryza sativa L. Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Tverrgående seksjonering av eldre ris (Oryza sativa L.) Kjerner for skanning av elektronmikroskopiavbildning ved hjelp av pipettespisser som immobiliseringsstøtte

Starch granules (SGs) exhibit different morphologies depending on the plant species, especially in the endosperm of the Poaceae family. Endosperm ...

Cell-Free Production of Proteoliposomes for Functional Analysis and Antibody Development Targeting Membrane Proteins

Cellefri produksjon av proteoliposomer for funksjonell analyse og antistoffutvikling rettet mot membranproteiner

Membrane proteins play essential roles in a variety of cellular processes and perform vital functions. Membrane proteins are medically important in drug ...