Name: production of recombinant prmt proteins using the baculovirus expression vector system
Uploaded: 2021-07-17T14:00:00
Duration: 8 min 57 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Production of Recombinant PRMT Proteins using the Baculovirus Expression Vector System at JoVE.com

Os autores desejam agradecer a Dalia Barsyte-Lovejoy por ter tomado tempo para fornecer feedback valioso e comentários críticos sobre o manuscrito e todos os nossos colegas do SGC que trabalharam com a família de proteínas PRMT expressa do Sistema de Vetores de Expressão baculovírus.
O SGC é uma instituição de caridade registrada (número 1097737) que recebe fundos da AbbVie, Bayer AG, Boehringer Ingelheim, Genentech, Genome Canada através do Ontario Genomics Institute [OGI-196], a UE e a EFPIA através da Iniciativa de Medicamentos Inovadores 2 Joint Undertaking [EUbOPEN grant 875510], Janssen, Merck KGaA (também conhecido como EMD no Canadá e nos EUA), Pfizer, Takeda e wellcome Trust [106169/ZZ14/Z].

<ol>
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Os autores não declaram conflito de interesses.

Uma das vantagens do BEVS em células de insetos centra-se na capacidade do maquinário de modificação pós-translacional para permitir modificações mais complexas, como fosforilação, miristoilação e glicosilação. Juntamente com a dobra altamente eficiente das proteínas mamíferas, essas modificações facilitam altas quantidades de proteína modificada e dobrada adequada para experimentos fisiologicamente relevantes a jusante16.
Aqui, descrevemos protocolos detalhados do BEVS enfatizando elementos críticos para a triagem de expressão bem-sucedida de múltiplas construções de proteínas PRMT e produção de proteína PRMT em larga escala na plataforma de expressão Baculovirus: 1) O uso de pipetas multicanais regulares, ajustáveis e programáveis para transferir os materiais biológicos entre 24 e 96 - placas e blocos de cultura de células bem nas fases de DNA bacmid e geração de vírus; uma coleção dos vírus recombinantes, amplificação dos volumes virais dos vírus recombinantes e preparação dos blocos de triagem de expressão proteica. 2) Reagentes de transfecção de alto desempenho e econômicos para a geração de vírus recombinantes. 3) Cultura de suspensão de células de insetos infectadas pelo baculovírus (SCBIIC) para produção de proteínas em larga escala. 4) Utilização de frascos de alto volume de enchimento 2,8 L Fernbach para manter a cultura de suspensão Sf9 e frascos de shake tunair de 2,5 L e garrafas de reagente de 5 L para a produção de proteínas em larga escala.
Considerações especiais e fundamentais para os passos de transformação e transfecção. Embora um protocolo comercial recomende o uso de 100 μL de células competentes para uma transformação14, a eficiência de transformação das células comerciais DH10Bac E. coli é tão alta quanto 1 x 108 cfu/ μg DNA, por isso usamos apenas 4 μL. Isso é suficiente para cada transformador obter colônias isoladas de recombinantes brancas para o isolamento do DNA bacmídeo. As células Sf9 aderentes na placa de transfecção de 24 poços foram semeadas a uma densidade celular de 2 x 105 /mL em 0,5 mL de Mídia de Insetos Sem Soro. Este volume é suficiente para garantir até mesmo a cobertura da superfície de trabalho do poço. Ao mesmo tempo, não dilui muito a mistura de transfecção, o que aumenta a eficiência da transfecção. Reagentes de transfecção não são tóxicos para as células Sf9, e a troca de mídia não é necessária. Em vez de uma mudança de mídia, um adicional de 1,5 mL de mídia contendo 10% (v/v) FBS é adicionado na placa de transfecção a 4-5 horas após a transfecção para facilitar o crescimento celular. A eficiência de transfecção de ambos os reagentes de transfecção é alta. Ainda assim, com x-tremeGene 9, os sinais de infecção nas células transfeinadas (Figura 2) aparecem 10-12 h mais cedo do que com o reagente JetPrime, por isso escolhemos entre esses reagentes dependendo do cronograma de trabalho dos próximos passos nos protocolos, o que proporciona alguma flexibilidade no processo geral.
A triagem de expressão de teste proteico pode ser configurada com vírus P2 se a quantidade dos vírus recombinantes iniciais, coletadas da placa de transfecção e rotuladas como P1, for um fator limitante a ser usado para a triagem da expressão proteica.
Considerações ao passar de pequenos para grandes volumes culturais. Historicamente, acreditava-se que o crescimento ideal das células requer um alto espaço aéreo na cultura de suspensão das produções de manutenção celular Sf9 e escala. No entanto, em 2014, foi relatado que o alto espaço aéreo em navios culturais é menos crítico do que se pensava17. Um vaso cultural criado usando velocidade de agitação adequadamente ajustada para o lançamento orbital da plataforma de agitação fornecerá transferência de oxigênio suficiente mesmo na cultura de suspensão de alto volume, criando e mantendo pequenas bolhas de ar por mais tempo. Com essa abordagem, as células de insetos disponíveis comercialmente podem ser cultivadas a uma velocidade de agitação mais alta dentro de uma faixa normal do tempo de duplicação das células sem sacrificar a alta viabilidade celular.
Assim, há 6 anos, começamos a aumentar o volume de cultura de suspensão em um frasco de agitação durante a manutenção celular e introduzimos um tipo diferente de vaso cultural para produção de proteínas, ajustando e monitorando as condições de agitação(Figura 6). Para estabelecer condições ideais nesses vasos culturais, monitoramos os parâmetros de cultura celular Sf9, como o tempo de duplicação celular, juntamente com viabilidade celular, tamanho e forma, estado de agregação e infectabilidade das células.
Por exemplo, para a manutenção celular Sf9, nos frascos de shake de 2,8 L Fernbach, nós cultura 2 L em vez de 0,8 L das células de suspensão Sf9 tremendo a 150 rpm a 27 °C e viabilidade celular na maior parte do tempo é perto de 99%, com células divisórias saudáveis em forma uniforme. Para a produção de escala, infectamos 4 L de células em garrafas de reagente 5 L tremendo em alta velocidade a 145 rpm a uma temperatura reduzida de 25 °C. As incubadoras mais usadas com uma plataforma de agitação embutida podem conter frascos de shake de 6 x 2,8 L ou garrafas de reagente 6 x 5 L, ou frascos de shake 10 x 2,5 L Tunair. Assim, a capacidade da plataforma de agitação, se enchermos frascos de shake Fernbach e garrafas de reagente a 1/3 versus o alto volume de enchimento dos vasos é de 4,8 L contra 12 L usando frascos de shake 2.8 L Fernbach e 10 L versus 24 L usando garrafas de reagente 5 L(Figura 6). A manutenção da cultura celular suspensa e a produção de escala nos navios de cultura com um volume de alto enchimento nos ajudaram a superar as limitações dos volumes de produção e adotar uma plataforma em larga escala. Assim, isso é altamente útil para laboratórios sem acesso a bioreatores e/ou espaço limitado nos gasodutos de produção.
Este protocolo poderia ser prontamente adaptado para a produção e purificação de construções proteicas com diferentes etiquetas de afinidade utilizando resinas apropriadas e modificando tampões de purificação, como foi descrito no artigo6 publicado pelo SGC para as proteínas de comprimento total marcadas por bandeiras do PRMT4, 7, 9, e do complexo PRMT5-MEP50 e PRMT6. Embora descrevamos um protocolo BEVS para a família prmt de proteínas, a mesma abordagem pode ser aplicada a qualquer outra família de proteínas.

Proteína arginina metiltransferases (PRMTs) resíduos de arginina metilato em uma moda dimetil monometo ou simétrica/assimétrica. As sequências repetitivas de RG/RGG/GRG são altamente preferidas pela maioria dos PRMTs e são encontradas em uma grande variedade de proteínas1,2. Proteínas metiladas de arginina, como histones ou fatores de transcrição e fatores de emenda, regulam transcrição, emenda e estrutura de cromatina3,4. O aumento do conhecimento da regulação diversificada da utilização do substrato e cofato, da rotatividade e da cinética dos PRMTs, bem como da geração de inibidores seletivos, lançaram luz mecanicista sobre essas enzimas e seus complexos5,6. No entanto, nem todos os membros da família PRMT são estudados na mesma medida; por exemplo, prMT9 foi recentemente descoberto como um membro da família PRMT1. Estudos de estrutura e função enzimática para essas proteínas requerem quantidades suficientes, muitas vezes miligramas, de proteína recombinante para estar disponível.
O sistema de expressão procariótica Escherichia coli (E. coli) é geralmente a primeira opção para a triagem de expressão utilizando múltiplos construtos para uma determinada proteína7,8,9. No entanto, a expressão baseada em E. colinem sempre resulta em quantidades suficientes de proteínas PRMT em suas formas ativas, como temos observado em particular para PRMT5 e PRMT7 (veja abaixo). Assim, os PRMTs que não se expressavam em E. coli ou precisavam ser produzidos pelas máquinas de expressão eucariótica foram subclolados em vetores apropriados para a triagem de expressão no sistema vetorial alternativo de expressão baculovírus (BEVS). Enquanto e. coli expressou amostras de PRMT1, PRMT3 e PRMT8 têm sido amplamente utilizados para ensaios in vitro e cristalografia, outros PRMTs como PRMT5, que requer mep50 parceiro vinculativo de seu domínio de metiltransferase dupla, e PRMTs como PRMT7 e 9, necessitam de expressão celular inseto para obter quantidades suficientes de proteína ativa. No geral, os ensaios padronizados de metiltransferase de média produção padronizados para PRMT4, 5, 6, 7 e 9 utilizaram o BEVS em célulasinsetos 6. O sistema vetorial de expressão de baculovírus (BEVS) é uma plataforma versátil para produzir proteínas recombinantes que requerem o maquinário de expressão eucariótica que permite modificações pós-translacionais essenciais para estudos bioquímicos, biofísicos e estruturais10,11,12. Vários BEVSs tornaram-se comercialmente disponíveis desde o primeiro uso relatado de baculovírus em 1983 para expressão proteica13. A maioria desses protocolos emprega diferentes estratégias para a transferência da expressão plasmid em células de insetos. Estes incluem Bac-to-Bac, flashBAC, BaculoGOLD Bright, BacVector-3000, BacMagic, BacPAK, etc. Nosso protocolo é baseado no sistema mais utilizado no BEVS, o sistema Bac-to-Bac14, que foi projetado para transferir o gene/cDNA codificando a proteína de interesse (POI, aqui os PRMTs) para o genoma baculovírus mantido em uma cepa especializada de E. coli via transposição específica do local15.
Resumidamente, o vetor de transferência plasmida contendo o gene de interesse foi transformado em células competentes DH10Bac E. coli para gerar DNA bacmídeo viral recombinante. As células Sf9 aderentes foram então transfeinadas com DNA bacmídeo. Quatro a cinco dias após a transfecção, baculovírus recombinantes iniciais escondidos no meio de cultura celular foram recuperados e rotulados como o vírus P1. Os estoques de baculovírus P1 foram então utilizados para amplificação de vírus (ou seja, geração de estoques de baculovírus P2) e triagem de expressão proteica. Com base nos resultados de triagem de expressão, foram identificados e utilizados vírus P2 para a melhor construção de expressão da proteína para gerar culturas de suspensão de células de insetos infectadas pelo baculovírus (SCBIIS) para a produção de proteínas em larga escala. Aqui, descrevemos nossos protocolos detalhados e descrevemos a lógica por trás de nossas escolhas de reagentes e vasos culturais para apoiar nossa estratégia de desenvolver uma metodologia mais eficiente, econômica e escalável para obter quantidades suficientes de proteínas recombinantes desejadas.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2.8L Nalgene&#160; Fernbach Culture Flask, Polycarbonate,</td>
			<td>Nalgene</td>
			<td>29171-854</td>
			<td>For large scale maintenance of suspension culture of Sf9 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-Well Blocks RB</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>19583</td>
			<td>For incubation of&#160; 4ml of suspension&#160; Sf9 cells&#160; for protein&#160; expression screening</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-20 Criterion TGX Gel 26W 15 ul</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>5671095</td>
			<td>For SDS-PAGe analysis of the purified proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50ml Reagent Reservoir</td>
			<td>Celltreat Scientific Products</td>
			<td>229290</td>
			<td>&#160;Reservoir used for diluted transfection reagent&#160; and Sf9 cells suspension</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well cap mat, for use with square well, 2 mL</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>381080</td>
			<td>Used to cover 96 well block</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well PCR plate</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30129300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto agar</td>
			<td>BD</td>
			<td>214010</td>
			<td>For LB-agar selection paltes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Airpore Tape Sheets</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>19571</td>
			<td>To cover 24 well blocks for protein expression screening</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Allega X-15R Centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>392932</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic Antimycotic (100x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15240112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacmid DNA</td>
			<td>in-house</td>
			<td>non-catalog item</td>
			<td>Bacmid DNA for baculovirus production</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bluo-Gal, 1g</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15519028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beckman JLA 8.1000</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Plates, 24-Well, with lid, flat bottom, sterile</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30722116</td>
			<td>Tissue&#160; culture treated plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Resuspension Solution 0.5&#160;L</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>LSKCRS500</td>
			<td>For Bacmid DNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell&#160;Lysis Solution 0.5&#160;L</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>LSKCLS500</td>
			<td>For Bacmid DNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CELLSTAR&#160; Tissue Culture Plates, 96 well</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>655180</td>
			<td>For transfection mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ClipTip 1250, filter reload, sterile</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>94420818</td>
			<td>Tips for&#160; programmable and adjustable multichannel pipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP Mix (25 mM each)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>R1121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E1-ClipTip&#160; Electronic Adjustable Tip Spacing Multichannel Equalizer Pipette, 15 to 1250 &#956;L</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>4672090BT</td>
			<td>Programmable and adjustable multichannel pipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E4&#160; XLS adjustable spacer 6-channel pipette, 20-300 &#956;L</td>
			<td>Ranin</td>
			<td>LTS EA6-300XLS</td>
			<td>Ranin adjustable multichannel pipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter microplate, 96-well, polypropylene, with 25 &#181;m ultra high molecular weight polyethylene membrane</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>201005-100</td>
			<td>For protein purification in expression screening</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Full-Baffle Flask Kit Tunair, 2.5L</td>
			<td>IBI Scientific</td>
			<td>SS-6003C</td>
			<td>For large scale protein production in suspension culture of SF9 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin 10x10ml</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>15750078</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat Inactivated Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Wisent Biocenter</td>
			<td>080-450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>I-Max Insect Media W/ L-Glutamine, 1 L</td>
			<td>Wisent Biocenter</td>
			<td>301-045-LL</td>
			<td>Serum free insect cells growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>InstantBlue, Ultrafast Protein Stain</td>
			<td>Expedeon Protein Solutions</td>
			<td>ISB1L-1L</td>
			<td>For protein gel (SDS-PAGE) staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iptg, Ultra Pure, Dioxane Free, Min 99.5%</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>IPT001.100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JetPRIME Transfection Reagent&#160; Provided with&#160; jetPRIME buffer</td>
			<td>POLYPLUS TRANSFECTION Inc</td>
			<td>114-01</td>
			<td>For Sf9 cells transfection to generate baculovirus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin Monosulfate</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>KAN201.100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lb Broth (Lennox), Powder Microbial Gro&#38;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L3022-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterblock 96 deep well 2.4mL</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>780285-FD</td>
			<td>Used in the transformation and expression screening procedures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Max Efficiency DH10Bac Competent Cells , 0.5ml</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>10361012</td>
			<td>Competent cells for bacmid DNA generation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mLINE 12-Channel Pipette, adjustable 30 - 300 uL</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>Sartorius 725240</td>
			<td>12 channel pipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neutralization Solution, 0.5&#160;L</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>LSKNS0500</td>
			<td>For bacmid DNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>New Brunswick&#160; Innova 44R, 120V, orbit 2.5 cm (1 in)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>M1282-0004</td>
			<td>Shaker incubator for incubaion of suspension of Sf9 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA Agarose</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>30250</td>
			<td>For protein purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>LS15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PYREX&#160; Delong Shaker Erlenmeyer Flask with Baffles, Corning&#160; 500ml</td>
			<td>Pyrex</td>
			<td>4444-500</td>
			<td>For&#160; suspension culture of Sf9 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PYREX Delong Shaker Erlenmeyer Flask with Baffles, Corning&#160; 125ml</td>
			<td>Pyrex</td>
			<td>4444-125</td>
			<td>For suspension culture of Sf9 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PYREX Delong Shaker Erlenmeyer Flask with Baffles, Corning&#160; 250ml</td>
			<td>Pyrex</td>
			<td>4444-250</td>
			<td>For suspension culture of Sf9 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RedSafe&#160;Nucleic&#160;Acid&#160;Staining&#160;Solution</td>
			<td>Froggabio</td>
			<td>21141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase A, 0.9&#160;mL</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>LSKPMRN30</td>
			<td>For suspension buffer for bacmid DNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roll &#38; Grow Spherical Glass Plating Beads</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>115000550</td>
			<td>For&#160; spread&#160; of bacterial&#160; cells across the surface of an agar plate.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RT-LTS-A-300&#956;L-768/8 (tips)</td>
			<td>Ranin</td>
			<td>30389253</td>
			<td>Tips for ranin multichannel pipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S.O.C. Medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15544034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serum, Cell Culture, Fetal Bovine Serum (Fbs), Hyclone, Characterized Canadian</td>
			<td>cytivalifesciences</td>
			<td>SH3039602</td>
			<td>Addition to the serum free medim for&#160; the transfected cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sf9 cells</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>12659017</td>
			<td>Insect cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sfx-Insect Cell Culture Media</td>
			<td>Cytiva (Formerly GE Healthcare Life Sciences)</td>
			<td>SH3027802</td>
			<td>Serum free insect cells growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tape Pad</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>19570</td>
			<td>Tape Pad</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taq DNA Polymerase with ThermoPol Buffer - 2,000 units</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0267L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetracycline Hcl</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>TET701.10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue 0.4% Solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15250061</td>
			<td>For&#160; assessment of cell viability</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VITLAB&#160; Reagent Bottles, PP with Screw Caps, PP, BrandTech, 5L</td>
			<td>VITLAB</td>
			<td>V100889</td>
			<td>For large scale protein production in suspension culture of Sf9 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR&#160; Digital Mini Incubator</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10055-006</td>
			<td>Incubator for adherent Sf9 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR&#160; Incubating Microplate Shaker</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97043-606</td>
			<td>Incubator for suspension culture of Sf9 cells in 24 well blocks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Petri Dishes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>CA73370-037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-tremeGene 9 DNA&#160; Transfection Reagent&#160; 1.0 M</td>
			<td>Roche</td>
			<td>6365787001</td>
			<td>For Sf9 cells transfection to generate recombinant baculovirus</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

production of recombinant prmt proteins using the baculovirus expression vector system

Proteína arginina metiltransferases (PRMTs) mtilato resíduos de arginina em uma grande variedade de proteínas que desempenham papéis em inúmeros processos celulares. PrMTs podem agrupar-se de grupos de arginina guanidino mono ou dimetilato simetricamente ou assimetria. A enzima dessas proteínas é uma área complexa e intensamente investigada que requer quantidades miligramas de proteína recombinante de alta qualidade. O sistema vetorial de expressão baculovírus (BEVS) que emprega células de insetos Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus (AcMNPV) e Spodoptera frugiperda 9 (Sf9) tem sido usado para triagem e produção de expressões de muitos PRMTs, incluindo PRMT 1, 2 e 4 a 9. Para testar simultaneamente a expressão de múltiplas construções dessas proteínas, incluindo domínios e fragmentos truncados, bem como as proteínas de comprimento completo, aplicamos métodos escaláveis utilizando pipetas multicanais ajustáveis e programáveis, combinados com placas e blocos de 24 e 96 poços. No geral, esses ajustes de método permitiram uma geração em larga escala de DNA bacmídeo, vírus recombinantes e rastreamento de expressão proteica. O uso de embarcações culturais com um alto volume de suspensão celular Sf9 ajudou a superar as limitações de espaço no gasoduto de produção para produção de proteínas em grande escala em lote único. Aqui, descrevemos protocolos detalhados para a expressão eficiente e econômica dos PRMTs funcionais para estudos bioquímicos, biofísicos e estruturais.

Uma visão geral do protocolo BEVS está descrita na Figura 1. Múltiplos construtos de expressões de PRMTs, incluindo comprimento total, domínios e fragmentos truncados, foram gerados no Structural Genomics Consortium (SGC, Toronto) de acordo com estratégias internas com a tentativa de aumentar a taxa de sucesso para identificar proteínas solúveis e estáveis com um nível de expressão relativamente alto7,9. Os leitores interessados são encorajados a rever as definições e a metodologia do SGC de projetar um "fragmento" como o segmento da sequência genética incorporada em um clone de expressão, "domínio" como domínio estrutural anotado pelo PFAM e "construção" como o fragmento clonado em um vetor de expressão, todos os quais foram descritos em detalhes em uma publicação anterior7. Os construtos de expressão de PRMTs apresentados neste protocolo são para a produção das proteínas com marca polihistidina clonadas no vetor pFBOH-MHL, que é um derivado do vetor pFastBac1. Na Figura 4,apresentamos a análise SDS-PAGE das construções solúveis marcadas por Sua marcadas de PRMT1, 2, 4-9 purificadas a partir de pelotas coletadas após 4 mL de produção em células Sf9 (etapa 3.1.4). O PRMT1 e o PRMT9 de comprimento completo (FL) não são apresentados neste gel, uma vez que o FL PRMT1 foi produzido a partir de E. coli, e FL PRMT9 produzido a partir de BEVS foi purificado pela Bandeira-tag6. As construções truncadas de PRMT1, FL PRMT4 e todos os construtos PRMT8 mostram um rendimento relativamente alto, mas elunatos proteicos contêm frações de contaminantes co-purificados. Esses construtos requerem maior otimização dos protocolos de purificação. Abordagens adicionais são, portanto, necessárias para melhorar a pureza dessas proteínas a partir de produções de escala, como a redução da quantidade de contas de níquel na fase da incubação com um lise esclarecido; aumento das concentrações de imidazol nos tampões de lavagem; decote da sua tag com protease TEV, seguido de aplicação em uma resina ni-affinity; e, etapas adicionais de purificação, como exclusão de tamanho e cromatografia de troca de íons. As construções de PRMT2 apresentam rendimento significativamente menor em comparação com outras proteínas e proteína PRMT2 de comprimento total acompanhada por uma forte faixa contaminante. A produção de escala e duas etapas de purificações, como o IMAC e a exclusão de tamanho, confirmaram um baixo nível de expressão para este construto, juntamente com a presença persistente do contaminante co-purificador para a proteína FL. Proteínas puras foram obtidas para o complexo PRMT5 produzido e purificado com seu parceiro obrigatório de ligação, o MEP50. A construção truncada de PRMT9 tem nível de expressão quase duas ou três vezes menor, perto de 1,5 mg/L, em comparação com outros PRMTs. No entanto, os estoques virais recombinantes desta construção têm sido utilizados para a produção de escala, difundindo cristais, e a estrutura foi resolvida para essa proteína juntamente com PRMT4, 6 e 7(Figura 5).
Para as produções de escala, os vírus P2 correspondentes foram utilizados para infectar a cultura de suspensão das células de insetos Sf9. Esta etapa gera 50/100/200 mL de células infectadas por baculovírus contendo células infectadas e vírus P3 no supernanato. Para a produção de proteínas em larga escala, 2 L de células Sf9 foram cultivadas em cada um dos frascos de shake de 2,8 L Fernbach a 150 rpm, 27 °C(Figura 6). No dia da produção, 2 L de células Sf9 (viabilidade celular > 97%) em 2,5 L Tunair shake flasks ou 4 L em 5 L garrafas de reagente foram diluídas para uma densidade celular de 4 x 106/mL. Estas células foram infectadas diretamente com 10-12 mL/L de cultura de suspensão de células de insetos infectadas por baculovírus e incubadas a uma temperatura reduzida de 25 °C, a 145 rpm. A infecção do lote de produção diretamente com uma cultura de suspensão de células de insetos infectadas pelo baculovírus reduziu significativamente as etapas laboriosas e demoradas na amplificação do volume do vírus, excluindo o manuseio extra das células infectadas, e evitou a redução da degradação de titer e vírus. A manutenção da cultura celular SF9 e a produção de escala têm sido feitas nos vasos de cultura com um alto volume de preenchimento para adotar uma produção de proteína em larga escala em um lote(Figura 6).
PrMT 4, 5 (em complexo com MEP50), 6, 7 e 9 proteínas produzidas a partir da plataforma de produção mediada por Baculovirus têm sido utilizadas para caracterização cinética e triagem de compostos inibidores no SGC6. Estruturas cristalinas foram resolvidas e depositadas no Protein Data Bank (PDB) para as formas de comprimento total ou truncada das proteínas PRMT 4, 6, 7 e 9 com várias sondas químicas e inibidores. Os plasmídeos de expressão desses PRMTs foram depositados no repositório plasmídeo addgene (Addgene é um parceiro distribuidor do SGC, https://www.addgene.org/) e estão disponíveis para a comunidade de pesquisa (Figura 5).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62510/62510fig01.jpg"> Figura 1: Visão geral esquemática das etapas do processo de expressão do baculovírus Clique aqui para ver uma versão maior desta <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62510/62510fig01large.jpg" target="_blank">figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62510/62510fig02.jpg"> Figura 2: Células Sf9 infectadas e não infectadas. Os sinais de infecção são mudanças estruturais nas células de insetos, como um aumento de 25-50% no diâmetro celular, núcleos celulares ampliados, forma uniformemente arredondada, perda de proliferação e adesão à superfície do prato de cultura, bem como uma diminuição na viabilidade celular. Barra de escala branca 200 μm. Os sinais de infecção aqui apresentados são os mesmos para as células transfeccionadas usando ambos os reagentes de transfecção, JetPrime e X-tremeGene 9. O exemplo em particular é para o reagente de transfecção JetPrime. (A) Células Sf9 não infectadas como controle. (B) Células Sf9 infectadas por baculovírus. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62510/62510fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62510/62510fig03.jpg"> Figura 3: Montagem de placa de ligação para purificação rápida de proteínas de expressão de teste. Consulte o texto para obter detalhes, passos 3.2.1-2 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62510/62510fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62510/62510fig04.jpg"> Figura 4: Resultados de triagem de expressão proteica. Resultados de triagem de expressão proteica da produção de proteína mediada por baculovírus em 4 mL de cultura de suspensão Sf9 infectados com vírus recombinantes P1 correspondentes para diferentes PRMTs e o complexo PRMT5-MEP50. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62510/62510fig04large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62510/62510fig05.jpg"> Figura 5: Resumo das construções de expressão para PRMT4, 6, 7 e 9 utilizados para estudos de estrutura de cristal no Structural Genomics Consortium, Toronto (SGC). As estruturas cristalinas foram resolvidas e depositadas no Banco de Dados de Proteínas (PDB) para as formas de comprimento completo ou truncadas de proteínas PRMT 4, 6, 7 e 9 com várias sondas químicas e inibidores. Os plasmídeos de expressão desses PRMTs foram depositados no repositório plasmídeo addgene e estão disponíveis para a comunidade de pesquisa (Addgene é um parceiro distribuidor do SGC, https://www.addgene.org/). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62510/62510fig05large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62510/62510fig06.jpg"> Figura 6: Manutenção de células de insetos Sf9 e produção de proteínas nos diferentes vasos da cultura: (A) 2,8 L Frasco de Fernbach para manutenção celular e produção de proteínas. O uso do volume de preenchimento de 72% aumenta a taxa de rendimento em 2,5 vezes em uma plataforma de agitação. (B) Os frascos de shake tunair (apenas 9 frascos de 10 são apresentados nesta imagem) e garrafas de reagente com um volume de preenchimento de 80% aumentam drasticamente a capacidade de produção da plataforma de agitação. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62510/62510fig06large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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Production of Recombinant PRMT Proteins using the Baculovirus Expression Vector System

O sistema vetorial de expressão baculovírus (BEVS) é uma plataforma robusta para triagem de expressão e produção de metiltransferases de arginina proteica (PRMTs) a serem utilizadas para estudos bioquímicos, biofísicos e estruturais. Quantidades de miligrama de material podem ser produzidas para a maioria dos PRMTs e outras proteínas de interesse que requerem uma plataforma de expressão eucariótica.

Produção de Proteínas PRMT Recombinantes utilizando o Sistema Vetorial de Expressão baculovírus

Protein arginine methyltransferases (PRMTs) methylate arginine residues on a wide variety of proteins that play roles in numerous cellular processes. ...

O objetivo geral deste protocolo é a triagem de expressão de múltiplos construtos de metiltransferases de arginina proteica na produção em larga escala para obter a quantidade de miligrama da proteína para estudos bioquímicos, biofísicos e estruturais no modo médio suportado e econômico na cobertura da plataforma de expressão S, sistema vetorial de expressão baculovirus. Alma Seitova apresentará os seguintes passos. Diluir as células SF9 em crescimento exponencial para a densidade celular final de 0,4 milhões por mil na mídia de insetos sem soro, e despeje no reservatório de reagentes estéreis.Use uma pipeta multicanal programável para semear 0,5 mil das células SF9 diluídas em cada poço da placa de 24 poços. Este volume é suficiente para garantir até mesmo a cobertura da superfície de trabalho do poço. Ao mesmo tempo, não dilui muito a mistura de transfecção, o que permite a eficiência da transfecção.Rotule um poço da placa apenas como célula, e use-o como controle para a comparação da célula transfecida e não transfecida para avaliar possíveis sinais de infecção. Incubar as placas a 27 graus até que seja necessário, aproximadamente uma hora, para deixar as células se prenderem às placas de cultura celular. Diluir reagente de transfecção bem misturado no meio de inseto não espartilado e um reservatório de reagente estéril, e misturar suavemente por 10 segundos.Usando uma pipeta de 12 canais, transfira 102 microliters do reagente de transação diluído em uma placa MicroWell estéril. Transfira 10 microliters de 0,2 microgramas por microlitra de DNA bacmídeo recombinante para o poço correspondente da placa MicroWell de 96 poços e misture tremendo suavemente, tocando a placa pelos lados. Incubar a mistura de transfecção por 15 a 20 minutos para uma formação complexa.Usando uma pipeta de seis canais ajustável projetada para a transferência entre uma placa de 96 e 24 poços, sobreponha a mistura de transfecção sobre as células em termos de gota em poços correspondentes das placas de transfecção, e incubar por quatro horas a 27 graus. Para garantir a distribuição uniforme da mistura de transfecção sobre a monocamada das células, balance suavemente as placas para frente e para trás várias vezes durante o tempo de incubação. Quatro a cinco horas após o tempo de transfecção, adicione 1,5 mil de mídia de insetos sem soro.Suplementá-lo com 10% de soro bovino fetal inativado pelo calor e 1% antibiótico e antimíctico. Incubar células em uma incubadora de 27 graus por 72 a 96 horas. Balance suavemente as placas de transfecção uma vez por dia, quando possível.Procure sinais de infecção evidentes em células transfeinadas entre 72 e 96 horas após a transfecção. Quatro a cinco dias após a transfecção, os sinais de infecção devem ser evidentes nas células transfeccionadas em comparação com as células de controle sob um microscópio invertido, e os baculovírus recombinantes iniciais secretados no meio de cultura celular devem estar prontos para coletar. Use um multicanal eletrônico programável para permitir simultaneamente a coleta de vírus P1, a infecção de células SF9 recém-semeadas na infecção de células de suspensão em seus 24 blocos de poços com 150 microliters dos vírus P1.Gire o resto dos estoques virais P1 coletivos por 15 minutos, cubra os 24 blocos de poços com cultura de suspensão das células SF9 infectadas com uma folha airpore. Incubar o bloco de poços 24 a 27 graus com agitação em 245 RPMs por 72 a 96 horas. Quatro dias antes do tempo de produção programado, dividiu exponencialmente as células SF9, a uma densidade celular final de 2 milhões por mil em erlenmeyer de vidro shake fio dental com defleções em mídia de insetos livres de soro contendo antibiótico 1% final e antimíctico.Esta etapa gerará cultura de suspensão de células de insetos infectados e vírus P2 no supernante para a infecção de novas células no lote de produção. Adicione os vírus P2 correspondentes e incuba as células infectadas na temperatura mais baixa de 25 graus para retardar o crescimento celular, tremendo a 165 RPMs em um agitador orbital com um curso de uma polegada. Quatro dias antes do tempo de produção programado, semente dois litros de células SF9 que crescem exponencialmente em mídia livre de soro de insetos para a densidade celular de 1 milhão por mil, no frasco de 2,8 litros fernbach shake.Agite o frasco a 27 graus com tremor a 150 RPMs. A cientista ashley Hutchinson demonstrará o seguinte protocolo. Divida quatro litros de células SF9 em crescimento exponencial e mídia livre de soro de insetos para a densidade celular final de 4 milhões por mil nas grandes garrafas de reagente de cinco litros.Adicione 10 a 12 mil da cultura de suspensão das células de insetos infectadas pelo baculovírus. Incubar a cultura infectada das células SF9 em um shaker sacudindo 145 RPM a uma temperatura mais baixa de 25 graus Celsius por 72 a 96 horas. Quantidades de miligramas de várias proteínas recombinantes da família PRMT expressas na produção imediata de baculovírus em células SF9 são usadas para estudos bioquímicos biofísicos instrucionais, como pode ser visto na figura cinco.No SGC, as estruturas cristalinas foram resolvidas no banco de dados de proteínas para as formas de comprimento total ou truncadas das proteínas PRMT4, 6, 7 e 9 com várias sondas químicas e inibidores. Os plasmídeos de expressão desses PRMTs foram depositados para adicionar coleta genética pelo SGC e estão disponíveis para a comunidade de pesquisa. Neste vídeo, enfatizamos elementos-chave para a triagem bem-sucedida da expedição de sua construção múltipla das metiltransferases de arginina proteica na produção em larga escala no sistema de expressão de baculovírus.O uso das pipetas multicanais ajustáveis e programáveis regulares, tornou todo o seu processo mais rápido do que eficiente. O uso de células tóxicas de alto desempenho e menos células para as células, reagente de transfecção para a geração de vírus recombinantes levou a um protocolo de transfecção mais econômico e este protocolo de transfecção de manuseio celular. A infecção do lote em larga escala para produção de proteínas com cultura de suspensão de baculovírus infectado em seis células reduziu significativamente os trabalhos em etapa demorada na amplificação vital da partida.É, por exemplo, centrifugando isso com cultura especial de células infectadas. Isso é, naturalmente, em excluir o manuseio extra das células infectadas em evitar em sua mais apertada na degradação do vírus. A manutenção da célula de cultura de cultura de suspensão nesta escala de produção no navio de cultura foi de alto volume de campo nos ajuda a superar a limitação do volume de produção e adotar uma plataforma em larga escala.Isso é altamente útil para os laboratórios sem acesso aos bioreatores ou espaço limitado no pipeline de produção. Embora nosso protocolo tenha sido descrito para as proteínas da família de metilatransferases de proteína arginina, a mesma abordagem pode ser aplicada a qualquer outra família de proteínas que exija plataforma de expressão para obter uma quantidade suficiente de sua proteína para estudos bioquímicos biofísicos instrucionais.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Recombinant Protein Expression, Crystallization, and Biophysical Studies of a Bacillus-conserved Nucleotide Pyrophosphorylase, BcMazG

Recombinant Protein Expression, Crystallization, and Biophysical Studies of a Bacillus-conserved Nucleotide Pyrophosphorylase, BcMazG

Expressão de Proteína Recombinante, Cristalização e Estudos Biofísicos de<em&gt; Bacillus</em&gt; -conservado Nucleotide Pyrophosphorylase, BcMazG

To overcome safety restrictions and regulations when studying genes and proteins from true pathogens, their homologues can be studied. Bacillus anthracis ...

Bioquímica

Transient Expression in Nicotiana Benthamiana Leaves for Triterpene Production at a Preparative Scale

Transient Expression in Nicotiana Benthamiana Leaves for Triterpene Production at a Preparative Scale

Expressão transiente em Nicotiana Benthamiana deixa triterpeno produção em escala preparativa

The triterpenes are one of the largest and most structurally diverse families of plant natural products. Many triterpene derivatives have been shown to ...

Modifying Baculovirus Expression Vectors to Produce Secreted Plant Proteins in Insect Cells

Modificar vetores de expressão de Baculovirus para produzir secretado proteínas vegetais em células de inseto

It has been a challenge for scientists to express recombinant secretory eukaryotic proteins for structural and biochemical studies. The ...

Large-scale Production of Recombinant RNAs on a Circular Scaffold Using a Viroid-derived System in Escherichia coli

Large-scale Production of Recombinant RNAs on a Circular Scaffold Using a Viroid-derived System in Escherichia coli

Produção em grande escala de RNAs recombinantes em um andaime Circular usando um sistema derivado de Viroid em Escherichia coli

With increasing interest in RNA biology and the use of RNA molecules in sophisticated biotechnological applications, the methods to produce large amounts ...

Use of Recombinant Fusion Proteins in a Fluorescent Protease Assay Platform and Their In-gel Renaturation

Utilização de proteínas recombinantes de fusão em uma plataforma de ensaio de Protease fluorescente e sua renaturalização em-gel

Proteases are intensively studied enzymes due to their essential roles in several biological pathways of living organisms and in pathogenesis; therefore, ...

Localization of SUMO-modified Proteins Using Fluorescent Sumo-trapping Proteins

Localização de proteínas SUMO-modificadas usando proteínas de captura de sumo fluorescentes

Here we are presenting a novel method to study the sumoylation of proteins and their sub-cellular localization in mammalian cells and nematode oocytes. ...

Expression, Purification, Crystallization, and Enzyme Assays of Fumarylacetoacetate Hydrolase Domain-Containing Proteins

Expressão, purificação, cristalização e ensaios enzimáticos de proteínas contendo domínio de Fumarilacetoacetato de hidrolase

Fumarylacetoacetate hydrolase (FAH) domain-containing proteins (FAHD) are identified members of the FAH superfamily in eukaryotes. Enzymes of this ...

Characterization of Membrane Transporters by Heterologous Expression in E. coli and Production of Membrane Vesicles

Characterization of Membrane Transporters by Heterologous Expression in E. coli and Production of Membrane Vesicles

Caracterização de transportadores de membrana por expressão heterologous em E. coli e produção de vesículas de membrana

Several methods have been developed to functionally characterize novel membrane transporters. Polyamines are ubiquitous in all organisms, but polyamine ...

Transverse Sectioning of Mature Rice (Oryza sativa L.) Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Transverse Sectioning of Mature Rice Oryza sativa L. Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Secção Transversa de Arroz Maduro (Oryza sativa L.) Kernels para digitalização de imagens de microscopia eletrônica usando dicas de pipeta como suporte à imobilização

Starch granules (SGs) exhibit different morphologies depending on the plant species, especially in the endosperm of the Poaceae family. Endosperm ...

Cell-Free Production of Proteoliposomes for Functional Analysis and Antibody Development Targeting Membrane Proteins

Produção Livre de Células de Proteolipossomas para Análise Funcional e Desenvolvimento de Anticorpos Visando Proteínas de Membrana

Membrane proteins play essential roles in a variety of cellular processes and perform vital functions. Membrane proteins are medically important in drug ...