Name: production of recombinant prmt proteins using the baculovirus expression vector system
Uploaded: 2021-07-17T14:00:00
Duration: 8 min 57 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Production of Recombinant PRMT Proteins using the Baculovirus Expression Vector System at JoVE.com

Авторы хотели бы поблагодарить Далию Барсайт-Лавджой за то, что она удостоилась времени, чтобы предоставить ценные отзывы и критические комментарии к рукописи, а также всех наших коллег из SGC, которые работали с семейством белков PRMT, выраженным из векторной системы экспрессии бакуловируса.
SGC является зарегистрированной благотворительной организацией (номер 1097737), которая получает средства от AbbVie, Bayer AG, Boehringer Ingelheim, Genentech, Genome Canada через Институт геномики Онтарио [OGI-196], ЕС и EFPIA через совместное предприятие Innovative Medicines Initiative 2 [грант EUbOPEN 875510], Janssen, Merck KGaA (aka EMD в Канаде и США), Pfizer, Takeda и Wellcome Trust [106169/ZZ14/Z].

<ol>
	<li>Guccione, E., Richard, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+regulation,+functions+and+relevance+of+arginine+methylation.">The regulation, functions and relevance of arginine methylation.</a> Nature Reviews in Molecular Cell Biology. 20 (10), 642-657 (2019).</li><li>Thandapani, P., O'Connor, T. R., Bailey, T. L., Richard, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+the+RGG/RG+motif.">Defining the RGG/RG motif.</a> Molecular Cell. 50 (5), 613-623 (2013).</li><li>Lorton, B. M., Shechter, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+consequences+of+arginine+methylation.">Cellular consequences of arginine methylation.</a> Cell and Molecular Life Sciences. 76 (15), 2933-2956 (2019).</li><li>Bedford, M. T., Clarke, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+arginine+methylation+in+mammals:+Who,+what,+and+why.">Protein arginine methylation in mammals: Who, what, and why.</a> Molecular Cell. 33 (1), 1-13 (2008).</li><li>Frankel, A., Brown, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+kinetic+data:+What+the+numbers+tell+us+about+PRMTs.">Evaluation of kinetic data: What the numbers tell us about PRMTs.</a> Biochimica Biophysica Acta Proteins Proteomics. 1867 (3), 306-316 (2018).</li><li>Li, A. S. M., Li, F., Eram, M. S., Bolotokova, A., Dela Se&#241;a, C. C., Vedadi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+probes+for+protein+arginine+methyltransferases.">Chemical probes for protein arginine methyltransferases.</a> Methods. 175, 30-43 (2020).</li><li>Savitsky, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+production+of+human+proteins+for+crystallization:+The+SGC+experience.">High-throughput production of human proteins for crystallization: The SGC experience.</a> Journal of Structural Biology. 172, 3-13 (2010).</li><li>Gileadi, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expressing+the+human+proteome+for+affinity+proteomics:+Optimizing+expression+of+soluble+protein+domains+and+in+vivo+biotinylation.">Expressing the human proteome for affinity proteomics: Optimizing expression of soluble protein domains and in vivo biotinylation.</a> New Biotechnology. 29 (5), 515-525 (2012).</li><li>Graslund, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+production+and+purification.">Protein production and purification.</a> Nature Methods. 5, 135 (2008).</li><li>Kost, T. A., Condreay, J. P., Jarvis, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Baculovirus+as+versatile+vectors+for+protein+expression+in+insect+and+mammalian+cells.">Baculovirus as versatile vectors for protein expression in insect and mammalian cells.</a> Nature Biotechnology. 23, 567-575 (2005).</li><li>Jarvis, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Baculovirus-insect+cell+expression+systems.">Baculovirus-insect cell expression systems.</a> Methods in Enzymology. 463, 191-222 (2009).</li><li>Shrestha, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Baculovirus+expression+vector+system:+an+emerging+host+for+high-throughput+eukaryotic+protein+expression.">Baculovirus expression vector system: an emerging host for high-throughput eukaryotic protein expression.</a> Methods in Molecular Biology. 439, 269-289 (2008).</li><li>Smith, G. E., Summers, M. D., Fraser, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+human+beta+interferon+in+insect+cells+infected+with+a+baculovirus+expression+vector.">Production of human beta interferon in insect cells infected with a baculovirus expression vector.</a> Molecular Cell Biology. 3, 2156-2165 (1983).</li><li>Invitrogen Life Technologies. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Invitrogen, Bac-to-Bac Baculovirus expression system. , (2010).</li><li>Luckow, V. A., Lee, S. C., Barry, G. F., Olins, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+generation+of+infectious+recombinant+baculoviruses+by+site-specific+transposon-mediated+insertion+of+foreign+genes+into+a+baculovirus+genome+propagated+in+Escherichia+coli.">Efficient generation of infectious recombinant baculoviruses by site-specific transposon-mediated insertion of foreign genes into a baculovirus genome propagated in Escherichia coli.</a> Journal of Virology. 67, 4566-4579 (1993).</li><li>Irons, S. L., Chambers, A. C., Lissina, O., King, L. A., Possee, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+Production+Using+the+Baculovirus+Expression+System.">Protein Production Using the Baculovirus Expression System.</a> Current Protocol in Protein Sciences. 91, 1-22 (2018).</li><li>Rieffel, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insect+cell+culture+in+reagent+bottles.">Insect cell culture in reagent bottles.</a> MethodsX. 1, 155-161 (2014).</li></ol>

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Одним из преимуществ BEVS в клетках насекомых является способность механизма постпереводной модификации обеспечивать более сложные модификации, такие как фосфорилирование, миристоилирование и гликозилирование. Вместе с высокоэффективным сворачиванию белков млекопитающих эти модификации способствуют большому количеству модифицированного и свернутого белка, подходящего для физиологически значимых последующих экспериментов16.
Здесь мы описали подробные протоколы BEVS, подчеркивающие критические элементы для успешного скрининга экспрессии множественных конструкций белков PRMT и крупномасштабной продукции белка PRMT в платформе экспрессии бакуловируса: 1) Использование регулярных, регулируемых и программируемых многоканальных пипеток для переноса биологических материалов между 24- и 96-клеточными культурами пластин и блоков на этапах генерации ДНК и вируса bacmid; сбор рекомбинантных вирусов, амплификация вирусных объемов рекомбинантных вирусов и подготовка блоков скрининга экспрессии белка. 2) Высокоэффективные и экономичные трансфекционные реагенты для генерации рекомбинантных вирусов. 3) Культура суспензии клеток насекомых, инфицированных бакуловирусом (SCBIIC) для крупномасштабного производства белка. 4) Использование колб fernbach с высоким объемом наполнения 2,8 л для поддержания культуры суспензии Sf9 и колб для коктейлей Tunair объемом 2,5 л и флаконов с реагентами 5 л для крупномасштабного производства белка.
Особые соображения и обоснование этапов преобразования и трансфекции. Хотя коммерческий протокол рекомендует использовать 100 мкл компетентных клеток для одной трансформации14,эффективность трансформации коммерческих компетентных клеток DH10Bac E. coli составляет 1 х 108 КОЕ / мкг ДНК, поэтому мы используем только 4 мкл. Этого достаточно для каждого трансформанта, чтобы получить изолированные белые рекомбинантные колонии для выделения ДНК бакмида. Адгезивные клетки Sf9 в 24-скважинной трансфекционной пластине засевали при плотности клеток 2 х 105 /мл в 0,5 мл среды насекомых без сыворотки. Этого объема достаточно, чтобы обеспечить равномерное покрытие рабочей поверхности скважины. В то же время он не разбавляет трансфекционную смесь слишком сильно, что повышает эффективность трансфекции. Трансфекционные реагенты не токсичны для клеток Sf9, и обмен сред не нужен. Вместо изменения среды в трансфекционную пластину добавляют дополнительные 1,5 мл среды, содержащей 10% (v/v) FBS через 4-5 часов после трансфекции, чтобы облегчить рост клеток. Эффективность трансфекции обоих трансфекционных реагентов высока. Тем не менее, при X-tremeGene 9 признаки инфекции в трансфеферированных клетках(рисунок 2)появляются на 10-12 ч раньше, чем при реагенте JetPrime, поэтому мы выбираем между этими реагентами в зависимости от рабочего графика следующих шагов в протоколах, что обеспечивает некоторую гибкость в общем процессе.
Скрининг экспрессии белка может быть настроен с вирусами P2, если количество исходных рекомбинантных вирусов, собранных из трансфекционной пластины и помеченных как P1, является ограничивающим фактором для использования для скрининга экспрессии белка.
Рекомендации при переходе от малых к большим объемам языка и культуры. Исторически считалось, что оптимальный рост клеток требует большого воздушного пространства в культуре суспензии клеток Sf9 и масштабирования производства. Однако в 2014 году сообщалось, что высокое воздушное пространство в культурных судах менее критично, чем считалосьранее 17. Культуральный сосуд, настроенный с использованием соответствующим образом отрегулированной скорости встряхивания до орбитального броска встряхивающей платформы, обеспечит достаточный перенос кислорода даже в культуре суспензии с высоким объемом заполнения, создавая и поддерживая небольшие пузырьки воздуха в течение более длительного времени. При таком подходе коммерчески доступные клетки насекомых можно культивируем с более высокой скоростью встряхивания в пределах нормального диапазона времени удвоения клеток без ущерба для высокой жизнеспособности клеток.
Таким образом, 6 лет назад мы начали увеличивать объем культуры суспензии в трясущейся колбе во время поддержания клеток и ввели другой тип культурального сосуда для производства белка при корректировке и мониторинге условий встряхивания(рисунок 6). Чтобы установить оптимальные условия в этих сосудах культуры, мы контролировали параметры культуры клеток Sf9, такие как время удвоения клеток, а также жизнеспособность клеток, размер и форма, состояние агрегации и инфекционность клеток.
Например, для поддержания клеток Sf9 в колбах для встряхивания Фернбаха 2,8 л мы культивируем 2 л вместо 0,8 л суспензионных клеток Sf9, трясущихся при 150 об/мин при 27 °C, а жизнеспособность клеток большую часть времени близка к 99%, с равномерной формой здоровых делящихся клеток. Для масштабного производства мы заражаем 4 л клеток в 5 л реагентных флаконах, встряхивающихся с высокой скоростью до 145 оборотов в минуту при пониженной температуре 25 °C. Наиболее часто используемые инкубаторы со встроенной встряхивающей платформой могут вмещать 6 x 2,8 л колб для коктейлей или 6 x 5 л реагентных бутылок, или 10 x 2,5 л колб Tunair. Таким образом, емкость одной встряхивающей платформы, если мы заполняем колбы и бутылки с реагентами Fernbach до 1/3 по сравнению с большим объемом наполнения сосудов, составляет 4,8 л против 12 л при использовании 2,8 л колб для коктейлей Fernbach и 10 л против 24 л при использовании 5 л реагентных бутылок(рисунок 6). Поддержание культуры суспензии и масштабирование производства в сосудах культуры с высоким объемом заполнения помогли нам преодолеть ограничения объемов производства и принять крупномасштабную платформу. Таким образом, это очень полезно для лабораторий, не имеющих доступа к биореакторам и / или ограниченного пространства в производственных конвейерах.
Этот протокол может быть легко адаптирован для производства и очистки белковых конструкций с различными метками сродства путем использования соответствующих смол и модификации буферов очистки, как было описано в опубликованной SGC статье6 для помеченных флагом полноразмерных белков PRMT4, 7, 9 и комплекса PRMT5-MEP50 и PRMT6 с метками His. Хотя мы описываем протокол BEVS для семейства белков PRMT, тот же подход может быть применен к любому другому семейству белков.

Белковые аргининметилтрансферазы (PRMT) метилат аргинина остатки монометилового или симметричного/асимметричного диметилового виде. Повторяющиеся последовательности RG/RGG/GRG являются весьма предпочтительными для большинства PRMT и содержатся в широком спектре белков1,2. Аргининовые метилированные белки, такие как гистоны или факторы транскрипции и факторы сплайсинга, регулируют транскрипцию, сплайсинг и структуру хроматина3,4. Растущие знания о разнообразной регуляции использования субстрата и кофактора, оборота и кинетики PRMT, а также генерации селективных ингибиторов пролили механистический свет на эти ферменты и их комплексы5,6. Однако не все члены семьи ПРМТ изучаются в одинаковой степени; например, PRMT9 только недавно был обнаружен как член семейства PRMT1. Исследования структуры и функции ферментов для этих белков требуют достаточного, часто миллиграммового, количества рекомбинантного белка, чтобы быть доступным.
Система экспрессии прокариотической экспрессии Escherichia coli (E. coli)обычно является первым выбором для скрининга экспрессии с использованием нескольких конструкций для данного белка7,8,9. Однако экспрессия на основе E. coliне всегда приводит к достаточному количеству белков PRMT в их активных формах, как мы отметили, в частности, для PRMT5 и PRMT7 (см. Ниже). Таким образом, PRMT, которые не смогли экспрессироваться в E. coli или должны были быть получены механизмом эукариотической экспрессии, были субклонированы в векторы, подходящие для скрининга экспрессии в альтернативной системе векторов экспрессии бакуловируса (BEVS). В то время как экспрессируемые E. coli образцы PRMT1, PRMT3 и PRMT8 широко использовались для анализов in vitro и кристаллографии, другие PRMT, такие как PRMT5, который требует партнера по связыванию MEP50 своего двойного метилтрансферазного домена, и PRMT, такие как PRMT7 и 9, требуют экспрессии клеток насекомых для получения достаточного количества активного белка. В целом, стандартизированные среднепроизводительный анализ метилтрансферазы для PRMT4, 5, 6, 7 и 9 использовали BEVS в клетках насекомых6. Векторная система экспрессии бакуловируса (BEVS) является универсальной платформой для получения рекомбинантных белков, требующих механизма эукариотической экспрессии, который позволяет осуществлять постперекренческие модификации, необходимые для биохимических, биофизических и структурных исследований10,11,12. Несколько BEVS стали коммерчески доступными с момента первого сообщения об использовании бакуловирусов в 1983 году для экспрессии белка13. Большинство из этих протоколов используют различные стратегии для передачи экспрессии плазмиды в клетки насекомых. К ним относятся Bac-to-Bac, flashBAC, BaculoGOLD Bright, BacVector-3000, BacMagic, BacPAK и т. Д. Наш протокол основан на наиболее часто используемой системе в BEVS, системе Bac-to-Bac14,которая предназначена для передачи гена / кДНК, кодирующей интересуяще белок (POI, здесь PRMT), в геном бакуловируса, поддерживаемый в специализированном штамме E. coli посредством сайт-специфической транспозиции15.
Вкратце, переносной вектор плазмиды, содержащий интересующий ген, был преобразован в клетки, компетентные DH10Bac E. coli, для генерации рекомбинантной вирусной днк bacmid. Затем адгезивные клетки Sf9 были трансфектованы ДНК bacmid. Через четыре-пять дней после трансфекции первоначальные рекомбинантные бакуловирусы, секретируемые в среду клеточной культуры, были восстановлены и помечены как вирус P1. Запасы бакуловируса P1 затем использовались для амплификации вируса (т. Е. Генерации запасов бакуловируса P2) и скрининга экспрессии белка. На основе результатов скрининга экспрессии вирусы P2 для наилучшей экспрессии белка были идентифицированы и использованы для создания культур суспензии инфицированных бакуловирусом клеток насекомых (SCBIIS) для крупномасштабного производства белка. Здесь мы описываем наши подробные протоколы и описываем обоснование нашего выбора реагентов и сосудов для культивирования для поддержки нашей стратегии разработки более эффективной по времени, экономичности и масштабируемости методологии для получения достаточного количества желаемых рекомбинантных белков.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2.8L Nalgene&#160; Fernbach Culture Flask, Polycarbonate,</td>
			<td>Nalgene</td>
			<td>29171-854</td>
			<td>For large scale maintenance of suspension culture of Sf9 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-Well Blocks RB</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>19583</td>
			<td>For incubation of&#160; 4ml of suspension&#160; Sf9 cells&#160; for protein&#160; expression screening</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-20 Criterion TGX Gel 26W 15 ul</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>5671095</td>
			<td>For SDS-PAGe analysis of the purified proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50ml Reagent Reservoir</td>
			<td>Celltreat Scientific Products</td>
			<td>229290</td>
			<td>&#160;Reservoir used for diluted transfection reagent&#160; and Sf9 cells suspension</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well cap mat, for use with square well, 2 mL</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>381080</td>
			<td>Used to cover 96 well block</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well PCR plate</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30129300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto agar</td>
			<td>BD</td>
			<td>214010</td>
			<td>For LB-agar selection paltes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Airpore Tape Sheets</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>19571</td>
			<td>To cover 24 well blocks for protein expression screening</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Allega X-15R Centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>392932</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic Antimycotic (100x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15240112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacmid DNA</td>
			<td>in-house</td>
			<td>non-catalog item</td>
			<td>Bacmid DNA for baculovirus production</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bluo-Gal, 1g</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15519028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beckman JLA 8.1000</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Plates, 24-Well, with lid, flat bottom, sterile</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30722116</td>
			<td>Tissue&#160; culture treated plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Resuspension Solution 0.5&#160;L</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>LSKCRS500</td>
			<td>For Bacmid DNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell&#160;Lysis Solution 0.5&#160;L</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>LSKCLS500</td>
			<td>For Bacmid DNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CELLSTAR&#160; Tissue Culture Plates, 96 well</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>655180</td>
			<td>For transfection mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ClipTip 1250, filter reload, sterile</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>94420818</td>
			<td>Tips for&#160; programmable and adjustable multichannel pipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP Mix (25 mM each)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>R1121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E1-ClipTip&#160; Electronic Adjustable Tip Spacing Multichannel Equalizer Pipette, 15 to 1250 &#956;L</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>4672090BT</td>
			<td>Programmable and adjustable multichannel pipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E4&#160; XLS adjustable spacer 6-channel pipette, 20-300 &#956;L</td>
			<td>Ranin</td>
			<td>LTS EA6-300XLS</td>
			<td>Ranin adjustable multichannel pipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter microplate, 96-well, polypropylene, with 25 &#181;m ultra high molecular weight polyethylene membrane</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>201005-100</td>
			<td>For protein purification in expression screening</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Full-Baffle Flask Kit Tunair, 2.5L</td>
			<td>IBI Scientific</td>
			<td>SS-6003C</td>
			<td>For large scale protein production in suspension culture of SF9 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin 10x10ml</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>15750078</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat Inactivated Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Wisent Biocenter</td>
			<td>080-450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>I-Max Insect Media W/ L-Glutamine, 1 L</td>
			<td>Wisent Biocenter</td>
			<td>301-045-LL</td>
			<td>Serum free insect cells growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>InstantBlue, Ultrafast Protein Stain</td>
			<td>Expedeon Protein Solutions</td>
			<td>ISB1L-1L</td>
			<td>For protein gel (SDS-PAGE) staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iptg, Ultra Pure, Dioxane Free, Min 99.5%</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>IPT001.100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JetPRIME Transfection Reagent&#160; Provided with&#160; jetPRIME buffer</td>
			<td>POLYPLUS TRANSFECTION Inc</td>
			<td>114-01</td>
			<td>For Sf9 cells transfection to generate baculovirus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin Monosulfate</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>KAN201.100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lb Broth (Lennox), Powder Microbial Gro&#38;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L3022-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterblock 96 deep well 2.4mL</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>780285-FD</td>
			<td>Used in the transformation and expression screening procedures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Max Efficiency DH10Bac Competent Cells , 0.5ml</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>10361012</td>
			<td>Competent cells for bacmid DNA generation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mLINE 12-Channel Pipette, adjustable 30 - 300 uL</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>Sartorius 725240</td>
			<td>12 channel pipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neutralization Solution, 0.5&#160;L</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>LSKNS0500</td>
			<td>For bacmid DNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>New Brunswick&#160; Innova 44R, 120V, orbit 2.5 cm (1 in)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>M1282-0004</td>
			<td>Shaker incubator for incubaion of suspension of Sf9 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA Agarose</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>30250</td>
			<td>For protein purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>LS15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PYREX&#160; Delong Shaker Erlenmeyer Flask with Baffles, Corning&#160; 500ml</td>
			<td>Pyrex</td>
			<td>4444-500</td>
			<td>For&#160; suspension culture of Sf9 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PYREX Delong Shaker Erlenmeyer Flask with Baffles, Corning&#160; 125ml</td>
			<td>Pyrex</td>
			<td>4444-125</td>
			<td>For suspension culture of Sf9 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PYREX Delong Shaker Erlenmeyer Flask with Baffles, Corning&#160; 250ml</td>
			<td>Pyrex</td>
			<td>4444-250</td>
			<td>For suspension culture of Sf9 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RedSafe&#160;Nucleic&#160;Acid&#160;Staining&#160;Solution</td>
			<td>Froggabio</td>
			<td>21141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase A, 0.9&#160;mL</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>LSKPMRN30</td>
			<td>For suspension buffer for bacmid DNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roll &#38; Grow Spherical Glass Plating Beads</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>115000550</td>
			<td>For&#160; spread&#160; of bacterial&#160; cells across the surface of an agar plate.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RT-LTS-A-300&#956;L-768/8 (tips)</td>
			<td>Ranin</td>
			<td>30389253</td>
			<td>Tips for ranin multichannel pipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S.O.C. Medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15544034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serum, Cell Culture, Fetal Bovine Serum (Fbs), Hyclone, Characterized Canadian</td>
			<td>cytivalifesciences</td>
			<td>SH3039602</td>
			<td>Addition to the serum free medim for&#160; the transfected cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sf9 cells</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>12659017</td>
			<td>Insect cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sfx-Insect Cell Culture Media</td>
			<td>Cytiva (Formerly GE Healthcare Life Sciences)</td>
			<td>SH3027802</td>
			<td>Serum free insect cells growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tape Pad</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>19570</td>
			<td>Tape Pad</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taq DNA Polymerase with ThermoPol Buffer - 2,000 units</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0267L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetracycline Hcl</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>TET701.10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue 0.4% Solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15250061</td>
			<td>For&#160; assessment of cell viability</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VITLAB&#160; Reagent Bottles, PP with Screw Caps, PP, BrandTech, 5L</td>
			<td>VITLAB</td>
			<td>V100889</td>
			<td>For large scale protein production in suspension culture of Sf9 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR&#160; Digital Mini Incubator</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10055-006</td>
			<td>Incubator for adherent Sf9 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR&#160; Incubating Microplate Shaker</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97043-606</td>
			<td>Incubator for suspension culture of Sf9 cells in 24 well blocks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Petri Dishes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>CA73370-037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-tremeGene 9 DNA&#160; Transfection Reagent&#160; 1.0 M</td>
			<td>Roche</td>
			<td>6365787001</td>
			<td>For Sf9 cells transfection to generate recombinant baculovirus</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

production of recombinant prmt proteins using the baculovirus expression vector system

Белковые аргининметилтрансферазы (PRMT) метилат аргинина остатки на широком спектре белков, которые играют роль в многочисленных клеточных процессах. PRMT могут либо моно-, либо диметилат аргинин гуанидиновых групп симметрично или асимметрично. Энзимология этих белков представляет собой сложную и интенсивно исследуемую область, которая требует миллиграммового количества высококачественного рекомбинантного белка. Векторная система экспрессии бакуловируса (BEVS), использующая клетки насекомых Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus (AcMNPV) и Spodoptera frugiperda 9 (Sf9), использовалась для скрининга экспрессии и производства многих PRMT, включая PRMT 1, 2 и 4-9. Для одновременного скрининга экспрессии нескольких конструкций этих белков, включая домены и усеченные фрагменты, а также полноразмерные белки, мы применили масштабируемые методы с использованием регулируемых и программируемых многоканальных пипеток в сочетании с 24- и 96-скважинными пластинами и блоками. В целом, эти корректировки метода позволили крупномасштабную генерацию ДНК bacmid, рекомбинантных вирусов и скрининг экспрессии белка. Использование емкостей для культивирования с большим объемом клеточной суспензии Sf9 помогло преодолеть ограничения пространства в производственном конвейере для односерийного крупномасштабного производства белка. Здесь мы описываем подробные протоколы для эффективной и экономичной экспрессии функциональных PRMT для биохимических, биофизических и структурных исследований.

Обзор протокола BEVS приведен на рисунке 1. Множественные конструкции экспрессии PRMT, включая полноразмерные, домены и усеченные фрагменты, были сгенерированы в Консорциуме структурной геномики (SGC, Торонто) в соответствии с стратегиями in-house с попыткой увеличить показатель успеха для идентификации растворимых и стабильных белков с относительно высоким уровнем экспрессии7,9. Заинтересованным читателям предлагается ознакомиться с определениями и методологией SGC по проектированию «фрагмента» как сегмента последовательности генов, включенного в клон экспрессии, «домена» как аннотированного PFAM структурного домена и «конструкции» как фрагмента, клонированного в векторе экспрессии, все из которых были подробно описаны в более ранней публикации7. Конструкции экспрессии PRMT, представленные в этом протоколе, предназначены для получения белков, помеченных полигистидином, клонированных в вектор pFBOH-MHL, который является производным вектора pFastBac1. На рисунке 4представлен анализ SDS-PAGE растворимых конструкций PRMT1, 2, 4-9, очищенных из гранул, собранных после 4 мл продукции в ячейках Sf9 (этап 3.1.4). Полноразмерные (FL) PRMT1 и PRMT9 не представлены в этом геле, так как FL PRMT1 был произведен из E. coli,а FL PRMT9, полученный из BEVS, был очищен Flag-tag6. Усеченные конструкции PRMT1, FL PRMT4 и всех конструкций PRMT8 показывают относительно высокий выход, но элюаты белка содержат фракции коочищенных загрязняющих веществ. Эти конструкции требуют дальнейшей оптимизации протоколов очистки. Таким образом, для повышения чистоты этих белков от масштабных производств требуются дополнительные подходы, такие как уменьшение количества никелевых шариков на стадии инкубации с осветленным лизатом; повышение концентрации имидазола в промывных буферах; расщепление His-метки с протеазой TEV с последующим нанесением на Ni-аффинную смолу; и дополнительные этапы очистки, такие как исключение размера и ионная хроматография. Конструкции PRMT2 показывают значительно более низкий выход по сравнению с другими белками и полноразмерным белком PRMT2, сопровождаемым сильной полосой загрязняющих веществ. Масштабирование производства и две ступени очистки, такие как IMAC и исключение размера, подтвердили низкий уровень экспрессии для этой конструкции наряду с постоянным присутствием коочистающего загрязнителя для белка FL. Чистые белки были получены для комплекса PRMT5, произведенного и очищенного с его партнером по связыванию облигатов, MEP50. Усеченная конструкция PRMT9 имеет почти в два или три раза более низкий уровень экспрессии, близкий к 1,5 мг/л, по сравнению с другими PRMT. Тем не менее, рекомбинантные вирусные запасы этой конструкции были использованы для масштабирования производства, были получены дифрактируемые кристаллы, и структура была решена для этого белка вместе с PRMT4, 6 и 7(Рисунок 5).
Для масштабирования производства соответствующие вирусы P2 использовались для заражения культуры суспензии клеток насекомых Sf9. Этот этап генерирует 50/100/200 мл инфицированных бакуловирусом клеток, содержащих инфицированные клетки и вирусы P3 в супернатанте. Для крупномасштабного производства белка 2 л клеток Sf9 культивировали в каждой из 2,8 л колбы Fernbach shake при 150 об/мин, 27 °C(рисунок 6). В день производства 2 л клеток Sf9 (жизнеспособность клеток > 97%) в колбах Tunair объемом 2,5 л или 4 л в флаконах с реагентами по 5 л разбавляли до плотности ячейки 4 х10 6/мл. Эти клетки были инфицированы непосредственно 10-12 мл / л суспензии культуры инфицированных бакуловирусом клеток насекомых и инкубированы при пониженной температуре 25 ° C при 145 оборотах в минуту. Заражение производственной партии непосредственно суспензионной культурой зараженных бакуловирусом клеток насекомых значительно снижало трудоемкие и трудоемкие этапы амплификации объема вируса, исключая дополнительную обработку инфицированных клеток, и избегало снижения титра и деградации вируса. Поддержание клеточной культуры SF9 и масштабирование производства были выполнены в сосудах для культивирования с большим объемом заполнения для принятия крупномасштабного производства белка в одной партии(рисунок 6).
Полноразмерные PRMT 4, 5 (в комплексе с белками MEP50), 6, 7 и 9, полученные из опосредоопосредования бакуловирусной производственной платформы, использовались для кинетической характеристики и скрининга ингибиторных соединений в SGC6. Кристаллические структуры решали и депонировали в Банк данных о белках (PDB) для полноразмерных или усеченных форм белков PRMT 4, 6, 7 и 9 с различными химическими зондами и ингибиторами. Экспрессионные плазмиды для этих PRMT были депонированы в репозиторий плазмид Addgene (Addgene является дистрибьютором SGC, https://www.addgene.org/) и доступны исследовательским сообществу(рисунок 5).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62510/62510fig01.jpg"> Рисунок 1:Схематический обзор этапов процесса экспрессии бакуловируса <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62510/62510fig01large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62510/62510fig02.jpg"> Рисунок 2:Бакуловирус Инфицированные и неинфицированные клетки Sf9. Признаками инфекции являются структурные изменения в клетках насекомых, такие как увеличение диаметра клеток на 25-50%, увеличение клеточных ядер, равномерно округлая форма, потеря пролиферации и прилипания к поверхности чашки культуры, а также снижение жизнеспособности клеток. Белая шкала 200 мкм. Признаки инфекции, представленные здесь, одинаковы для трансфектированных клеток, использующих оба трансфекционных реагента, JetPrime и X-tremeGene 9. Конкретный пример приведен для трансфекционного реагента JetPrime. (A) Неинфицированные клетки Sf9 в качестве контроля. (B) Бакуловирус-инфицированные клетки Sf9. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62510/62510fig02large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62510/62510fig03.jpg"> Рисунок 3:Сборка связующей пластины для быстрой очистки белков тестовой экспрессии. Пожалуйста, смотрите текст для деталей, шаги 3.2.1-2 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62510/62510fig03large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62510/62510fig04.jpg"> Рисунок 4:Результаты скрининга экспрессии белка. Результаты скрининга экспрессии белка опосредования бакуловирусом производства белка в 4 мл культуры суспензии Sf9, инфицированной соответствующими рекомбинантными вирусами P1 для различных PRMT и комплекса PRMT5-MEP50. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62510/62510fig04large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62510/62510fig05.jpg"> Рисунок 5:Краткое изложение конструкций экспрессии для PRMT4, 6, 7 и 9, используемых для исследований кристаллической структуры в Консорциуме структурной геномики, Торонто (SGC). Кристаллические структуры решали и депонировали в Банк белковых данных (PDB) для полноразмерных или усеченных форм белков PRMT 4, 6, 7 и 9 с различными химическими зондами и ингибиторами. Экспрессионные плазмиды для этих PRMT были депонированы в репозиторий плазмид Addgene и доступны исследовательского сообщества (Addgene является дистрибьютором SGC, https://www.addgene.org/). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62510/62510fig05large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62510/62510fig06.jpg"> Рисунок 6:Sf9 поддержание клеток насекомых и производство белка в различных сосудах культуры: (A) 2,8 л колбы Фернбаха для поддержания клеток и производства белка. Использование 72% объема заполнения увеличивает пропускную способность в 2,5 раза на одной встряхиваемой платформе. (B) Колбы для встряхивания Tunair (на этом рисунке представлено только 9 колб из 10) и бутылки с реагентами с объемом заполнения 80% резко увеличивают производственную мощность встряхивающей платформы. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62510/62510fig06large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Production of Recombinant PRMT Proteins using the Baculovirus Expression Vector System at JoVE.com

Production of Recombinant PRMT Proteins using the Baculovirus Expression Vector System

Векторная система экспрессии бакуловируса (BEVS) является надежной платформой для скрининга экспрессии и производства белковых аргининметилтрансфераз (PRMT), которые будут использоваться для биохимических, биофизических и структурных исследований. Миллиграммовые количества материала могут быть получены для большинства PRMT и других белков, представляющих интерес, требующих платформы эукариотической экспрессии.

Производство рекомбинантных белков PRMT с использованием векторной системы экспрессии бакуловируса

Protein arginine methyltransferases (PRMTs) methylate arginine residues on a wide variety of proteins that play roles in numerous cellular processes. ...

Общей целью данного протокола является скрининг экспрессии множественной конструкции белковых аргининметилтрансфераз в крупномасштабном производстве для получения миллиграммового количества белка для биохимических, биофизических и структурных исследований в среде поддерживаемом, экономически эффективном режиме в покрытии платформы экспрессии S, векторной системы экспрессии бакуловируса. Д-р Алма Сеитова представит следующие шаги. Разбавьте экспоненциально растущие клетки SF9 до конечной плотности клеток 0,4 миллиона на мил в среде насекомых, свободной от сыворотки, и вылейте в резервуар стерильных реагентов.Используйте программируемую многоканальный пипетку для посева 0,5 мил разбавленных ячеек SF9 в каждую скважину 24-скважинной пластины. Этого объема достаточно, чтобы обеспечить равномерное покрытие рабочей поверхности скважины. В то же время он не разбавляет трансфекционную смесь слишком сильно, что обеспечивает эффективность трансфекции.Пометьте один колодец пластины только как клетку и используйте его в качестве контроля для сравнения трансфектериальной и неперераженной клетки для оценки потенциальных признаков инфекции. Инкубируют пластины при 27 градусах до тех пор, пока это не понадобится, примерно один час, чтобы позволить клеткам прикрепиться к пластинам клеточной культуры. Разбавьте хорошо смешанный трансфекционный реагент в недоставленной среде насекомых и резервуаре стерильного реагента и осторожно перемешайте в течение 10 секунд.Используя 12-канальный пипетку, переведите 102 микролитра разбавленного реагента транзакции в стерильную пластину 96 MicroWell. Переложите 10 микролитров по 0,2 мкг на микролитр рекомбинантной бакмидной ДНК в соответствующий колодец 96-луночной пластины MicroWell и перемешайте, осторожно встряхнув, постукивая пластиной с боков. Инкубировать трансфекционную смесь в течение 15-20 минут для сложного образования.Используя регулируемую шестиканальный пипетку, предназначенную для переноса между 96 и 24-скважинной пластиной, накладывайте трансфекционную смесь на ячейки по каплям в соответствующих колодцах трансфекционных пластин и инкубируйте в течение четырех часов при 27 градусах. Чтобы обеспечить равномерное распределение трансфекционной смеси по монослою клеток, осторожно раскачивайте пластины вперед и назад несколько раз в течение инкубационного времени. Через четыре-пять часов после трансфекции добавьте 1,5 милы безсывороточных сред насекомых.Дополни его 10% финалом инактивированной теплом фетальной бытовой сыворотки и 1% антибиотиком и антимикотиком. Инкубировать клетки в 27-градусном инкубаторе в течение 72-96 часов. Осторожно раскачивая трансфекционные пластины один раз в день, когда это возможно.Ищите признаки инфекции, проявивающиеся в трансфектированных клетках через 72-96 часов после трансфекции. Через четыре-пять дней после трансфекции признаки инфекции должны проявляться в трансфектированных клетках по сравнению с контрольными клетками под инвертируемым микроскопом, а исходные рекомбинантные бакуловирусы, секретируемые в среду клеточной культуры, должны быть готовы к сбору. Используйте программируемую электронную многоканальность, позволяющую одновременно проводить сбор вирусов P1, инфицирование свежезасеянных клеток SF9 при инфицировании суспензионных клеток в их 24 колодезных блоках со 150 микролитрами вирусов P1.Раскрутите остальные коллективные вирусные запасы P1 в течение 15 минут, покройте 24 блока скважины культурой суспензии инфицированных клеток SF9 листом AirPore. Инкубируйте блок из 24 скважин при 27 градусах с встряхиванием при 245 оборотах в час в течение 72-96 часов. За четыре дня до запланированного времени производства разделите экспоненциально растущие клетки SF9 при конечной плотности клеток 2 миллиона на мил на стеклянную нить Эрленмейера с перегородками в сывороточных свободных от насекомых средах, содержащих 1% конечного антибиотика и антимикотика.Этот шаг будет генерировать культуру суспензии инфицированных клеток насекомых и вирусов P2 в надводном питателье для заражения новых клеток в производственной партии. Добавьте соответствующие вирусы P2 и инкубирует инфицированные клетки при более низкой температуре 25 градусов, чтобы замедлить рост клеток, встряхивая при 165 оборотах в час на орбитальном шейкере одним сантиметровым ударом. За четыре дня до запланированного времени производства, посейте два литра экспоненциально растущих клеток SF9 в свободной от насекомых среде сыворотки до плотности клеток 1 миллион на мил, в 2,8-литровую колбу Fernbach shake.Встряхните колбу при 27 градусах с встряхиванием при 150 оборотах в об/м. Ученый Эшли Хатчинсон продемонстрирует следующий протокол. Разделите четыре литра экспоненциально растущих клеток SF9 и свободных сред от сыворотки насекомых до конечной плотности клеток 4 миллиона на мил в большие пятилитровые бутылки с реагентами.Добавьте от 10 до 12 мил суспензии культуры клеток насекомых, инфицированных бакуловирусом. Инкубируют инфицированную культуру клеток SF9 в шейкере, вытряхивая 145 оборотов в минуту при более низкой температуре 25 градусов Цельсия в течение 72-96 часов. Миллиграммовые количества нескольких рекомбинантных белков из семейства PRMT, экспрессируемых в бакуловирусе, немедленное производство в клетках SF9 используются для биохимических биофизических учебных исследований, как видно на рисунке пять.В SGC кристаллические структуры решались в депонированном в банке белковых данных для полноразмерных или усеченных форм белков PRMT4, 6, 7 и 9 с различными химическими зондами и ингибиторами. Экспрессионные плазмиды для этих PRMT были депонированы для добавления коллекции генов SGC и доступны для исследовательского сообщества. В этом видео мы подчеркнули ключевые элементы для успешного экспедиционного скрининга их множественной конструкции белка аргининметилтрансфераз в крупномасштабном производстве в системе экспрессии бакуловируса.Использование обычных регулируемых и программируемых многоканальных пипеток сделало весь их процесс более быстрым, чем эффективным. Использование высокоэффективных и менее токсичных для клеток реагентов трансфекции для генерации рекомбинантных вирусов привело к более экономичности и этой обработке клеток трансфекционного протокола. Заражение крупномасштабной партии для производства белка культурой суспензии бакуловируса, инфицированной в шести клетках, значительно уменьшало трудозатраты на трудоемком этапе в жизненно важной амплификации стартера.Это, например, центрифугирование этого специальной культурой инфицированных клеток. Это, конечно, в исключении дополнительной обработки инфицированных клеток в избегание в их более плотной деградации вируса. Поддержание клеток культуры суспензии культуры в этом масштабе производства в культурном сосуде было большим полевым объемом, что помогло нам преодолеть ограничение объема производства и принять крупномасштабную платформу.Это очень полезно для лабораторий, не имеющих доступа к биореакторам или ограниченного пространства в производственном конвейере. Хотя наш протокол был описан для белков семейства белков аргининметилтрансфераз, тот же подход может быть применен к любому другому семейству белков, требующих платформы экспрессии для получения достаточного количества их белка для биохимических биофизических учебных исследований.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Recombinant Protein Expression, Crystallization, and Biophysical Studies of a Bacillus-conserved Nucleotide Pyrophosphorylase, BcMazG

Recombinant Protein Expression, Crystallization, and Biophysical Studies of a Bacillus-conserved Nucleotide Pyrophosphorylase, BcMazG

Рекомбинантная экспрессия белков, кристаллизация и биофизические исследования<em&gt; Bacillus</em&gt; -содержащая нуклеотидная пирофосфорилаза, BcMazG

To overcome safety restrictions and regulations when studying genes and proteins from true pathogens, their homologues can be studied. Bacillus anthracis ...

Transient Expression in Nicotiana Benthamiana Leaves for Triterpene Production at a Preparative Scale

Transient Expression in Nicotiana Benthamiana Leaves for Triterpene Production at a Preparative Scale

Переходных выражение в Nicotiana Benthamiana листья для производства тритерпеновых препаративные масштаба

The triterpenes are one of the largest and most structurally diverse families of plant natural products. Many triterpene derivatives have been shown to ...

Modifying Baculovirus Expression Vectors to Produce Secreted Plant Proteins in Insect Cells

Изменение бакуловирусы векторы выражения производить выделяется растительных белков в клетках насекомых

It has been a challenge for scientists to express recombinant secretory eukaryotic proteins for structural and biochemical studies. The ...

Large-scale Production of Recombinant RNAs on a Circular Scaffold Using a Viroid-derived System in Escherichia coli

Large-scale Production of Recombinant RNAs on a Circular Scaffold Using a Viroid-derived System in Escherichia coli

Крупномасштабное производство рекомбинантных молекул РНК на круговой лески с помощью вироиды производные системы в Escherichia coli

With increasing interest in RNA biology and the use of RNA molecules in sophisticated biotechnological applications, the methods to produce large amounts ...

Use of Recombinant Fusion Proteins in a Fluorescent Protease Assay Platform and Their In-gel Renaturation

Использование рекомбинантных Fusion белков в платформу Assay флуоресцентные протеазы и их выемка в гель

Proteases are intensively studied enzymes due to their essential roles in several biological pathways of living organisms and in pathogenesis; therefore, ...

Localization of SUMO-modified Proteins Using Fluorescent Sumo-trapping Proteins

Локализация сумо-модифицированных белков с использованием флуоресцентного сумо-улавливания белков

Here we are presenting a novel method to study the sumoylation of proteins and their sub-cellular localization in mammalian cells and nematode oocytes. ...

Expression, Purification, Crystallization, and Enzyme Assays of Fumarylacetoacetate Hydrolase Domain-Containing Proteins

Выражение, очищение, кристаллизация и ферментные анализы Fumarylacetoacetate Hydrolase Домен-содержащих белков

Fumarylacetoacetate hydrolase (FAH) domain-containing proteins (FAHD) are identified members of the FAH superfamily in eukaryotes. Enzymes of this ...

Characterization of Membrane Transporters by Heterologous Expression in E. coli and Production of Membrane Vesicles

Characterization of Membrane Transporters by Heterologous Expression in E. coli and Production of Membrane Vesicles

Характеристика Мембранных Транспортеров по гетерологусному выражению в кишечной палочке и производству Мембранных Весиклей

Several methods have been developed to functionally characterize novel membrane transporters. Polyamines are ubiquitous in all organisms, but polyamine ...

Transverse Sectioning of Mature Rice (Oryza sativa L.) Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Transverse Sectioning of Mature Rice Oryza sativa L. Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Поперечное секционирование зрелого риса (Oryza sativa L.) Ядра для сканирующей электронной микроскопии с использованием наконечников пипеток в качестве поддержки иммобилизации

Starch granules (SGs) exhibit different morphologies depending on the plant species, especially in the endosperm of the Poaceae family. Endosperm ...

Cell-Free Production of Proteoliposomes for Functional Analysis and Antibody Development Targeting Membrane Proteins

Бесклеточная продукция протеолипосом для функционального анализа и разработки антител, нацеленных на мембранные белки

Membrane proteins play essential roles in a variety of cellular processes and perform vital functions. Membrane proteins are medically important in drug ...