Name: production of recombinant prmt proteins using the baculovirus expression vector system
Uploaded: 2021-07-17T14:00:00
Duration: 8 min 57 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Production of Recombinant PRMT Proteins using the Baculovirus Expression Vector System at JoVE.com

Los autores desean agradecer a Dalia Barsyte-Lovejoy por tomarse el tiempo para proporcionar comentarios valiosos y comentarios críticos sobre el manuscrito y todos nuestros colegas de SGC que trabajaron con la familia de proteínas PRMT expresada desde el Sistema de Vectores de Expresión de Baculovirus.
El SGC es una organización benéfica registrada (número 1097737) que recibe fondos de AbbVie, Bayer AG, Boehringer Ingelheim, Genentech, Genome Canada a través del Ontario Genomics Institute [OGI-196], la UE y la EFPIA a través de la Empresa Común Innovative Medicines Initiative 2 [subvención EUbOPEN 875510], Janssen, Merck KGaA (también conocida como EMD en Canadá y EE. UU.), Pfizer, Takeda y Wellcome Trust [106169/ZZ14/Z].

<ol>
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Los autores declaran que no hay conflicto de intereses.

Una de las ventajas de BEVS en células de insectos se centra en la capacidad de la maquinaria de modificación post-traduccional para permitir modificaciones más complejas como la fosforilación, la miristoilación y la glicosilación. Junto con el plegamiento altamente eficiente de las proteínas de mamíferos, estas modificaciones facilitan altas cantidades de proteínas modificadas y plegadas adecuadas para experimentos aguas abajo fisiológicamente relevantes16.
Aquí, se describen los protocolos detallados de la BEVS haciendo hincapié en los elementos críticos para la detección de expresión exitosa de múltiples construcciones de proteínas PRMT y la producción de proteínas PRMT a gran escala en la plataforma de expresión de Baculovirus: 1) El uso de pipetas multicanal regulares, ajustables y programables para transferir los materiales biológicos entre 24 - y 96 - placas de cultivo celular pozo y bloques en las etapas de la generación de ADN bacmid y virus; una colección de los virus recombinantes, la amplificación de los volúmenes virales de los virus recombinantes y la preparación de los bloques de cribado de expresión de proteínas. 2) Reactivos de transfección de alto rendimiento y rentables para la generación de virus recombinantes. 3) Cultivo en suspensión de células de insectos infectados por baculovirus (SCBIIC) para la producción de proteínas a gran escala. 4) Utilización de frascos de batido Fernbach de alto volumen de llenado de 2,8 L para mantener el cultivo de suspensión Sf9 y frascos de batido Tunair de 2,5 L y botellas de reactivos de 5 L para la producción de proteínas a gran escala.
Consideraciones especiales y justificación de los pasos de transformación y transfección. Aunque un protocolo comercial recomienda el uso de 100 μL de células competentes para una transformación14,la eficiencia de transformación de las células comerciales competentes DH10Bac E. coli es tan alta como 1 x 108 ufc / μg de ADN, por lo que utilizamos sólo 4 μL. Esto es suficiente para que cada transformante obtenga colonias recombinantes blancas aisladas para el aislamiento del ADN bacmid. Las células adherentes de Sf9 en la placa de transfección de 24 pozos se sembraron a una densidad celular de 2 x 105 /mL en 0,5 mL de medios de insectos sin suero. Este volumen es suficiente para garantizar una cobertura uniforme de la superficie de trabajo del pozo. Al mismo tiempo, no diluye demasiado la mezcla de transfección, lo que mejora la eficiencia de la transfección. Los reactivos de transfección no son tóxicos para las células Sf9, y el intercambio de medios no es necesario. En lugar de un cambio de medios, se agregan 1,5 mL adicionales de medios que contienen 10% (v/v) de FBS en la placa de transfección a las 4-5 horas de tiempo posterior a la transfección para facilitar el crecimiento celular. La eficiencia de transfección de ambos reactivos de transfección es alta. Aún así, con X-tremeGene 9, los signos de infección en las células transfectadas(Figura 2) aparecen10-12 h antes que con el reactivo JetPrime, por lo que elegimos entre estos reactivos en función del horario de trabajo de los siguientes pasos en los protocolos, lo que proporciona cierta flexibilidad en el proceso general.
La detección de expresión de pruebas de proteínas se puede configurar con virus P2 si la cantidad de los virus recombinantes iniciales, recolectados de la placa de transfección y etiquetados como P1, es un factor limitante a utilizar para el cribado de expresión de proteínas.
Consideraciones al pasar de volúmenes de referencia cultural pequeños a grandes. Históricamente, se creía que el crecimiento óptimo de las células requiere un alto espacio aéreo en el cultivo de suspensión de las producciones de mantenimiento y escalado de células Sf9. Sin embargo, en 2014, se informó que el alto espacio aéreo en los buques de cultivo es menos crítico de lo que se pensaba17. Un recipiente de cultivo configurado utilizando la velocidad de agitación ajustada adecuadamente al tiro orbital de la plataforma de agitación proporcionará suficiente transferencia de oxígeno incluso en el cultivo de suspensión de alto volumen de llenado mediante la creación y el mantenimiento de pequeñas burbujas de aire durante más tiempo. Con este enfoque, las células de insectos disponibles en el mercado se pueden cultivar a una velocidad de agitación más alta dentro de un rango normal del tiempo de duplicación de las células sin sacrificar la alta viabilidad celular.
Así, hace 6 años, comenzamos a aumentar el volumen de cultivo en suspensión en un matraz de agitación durante el mantenimiento celular e introdujimos un tipo diferente de recipiente de cultivo para la producción de proteínas mientras ajustamos y monitoreamos las condiciones de agitación(Figura 6). Para establecer condiciones óptimas en estos recipientes de cultivo, se supervisaron los parámetros de cultivo celular Sf9, tales como el tiempo de duplicación celular junto con la viabilidad celular, tamaño y forma, estado de agregación, y la infectabilidad de las células.
Por ejemplo, para el mantenimiento de células Sf9, en los frascos de agitación Fernbach de 2,8 L, cultivamos 2 L en lugar de 0,8 L de las células de suspensión Sf9 que tiemblan a 150 rpm a 27 °C y la viabilidad celular la mayor parte del tiempo es cercana al 99%, con células en división sanas de forma uniforme. Para la producción a escala, infectamos 4 L de células en botellas de reactivos de 5 L que tiemblan a alta velocidad a 145 rpm a una temperatura bajada de 25 °C. Las incubadoras más utilizadas con una plataforma de agitación incorporada pueden contener frascos de agitación de 6 x 2.8 L o botellas de reactivos de 6 x 5 L, o frascos de agitación Tunair de 10 x 2.5 L. Por lo tanto, la capacidad de la plataforma de agitación única, si llenamos los frascos de agitación Fernbach y las botellas de reactivos a 1/3 frente al volumen de alto llenado de los recipientes es de 4,8 L frente a 12 L utilizando frascos de agitación Fernbach de 2,8 L y 10 L frente a 24 L utilizando botellas de reactivos de 5 L(Figura 6). El mantenimiento del cultivo celular en suspensión y la producción a escala en los recipientes de cultivo con un volumen de llenado alto nos han ayudado a superar las limitaciones de los volúmenes de producción y adoptar una plataforma a gran escala. Por lo tanto, esto es muy útil para laboratorios sin acceso a biorreactores y / o espacio limitado en las tuberías de producción.
Este protocolo podría adaptarse fácilmente para la producción y purificación de construcciones de proteínas con diferentes etiquetas de afinidad mediante la utilización de resinas apropiadas y la modificación de tampones de purificación como se ha descrito en el documento publicado SGC6 para las proteínas de longitud completa marcadas con bandera de PRMT4, 7, 9, y el complejo PRMT5-MEP50 con etiqueta His y PRMT6. Aunque describimos un protocolo BEVS para la familia prmt de proteínas, el mismo enfoque se puede aplicar a cualquier otra familia de proteínas.

Proteína arginina metiltransferasas (PRMTs) metilato arginina residuos en monometil o dimethyl simétrico / asimétrico. Las secuencias repetitivas RG/RGG/GRG son altamente preferidas por la mayoría de los PRMTs y se encuentran en una amplia variedad de proteínas1,2. Las proteínas metiladas con arginina como las histonas o los factores de transcripción y los factores de empalme regulan la transcripción, el empalme y la estructura de la cromatina3,4. El conocimiento cada vez mayor de la regulación diversa de la utilización del substrato y del cofactor, del volumen de ventas, y de la cinética de PRMTs, así como de la generación de inhibidores selectivos, ha vertido la luz mecanicista en estas enzimas y sus complejos5,6. Sin embargo, no todos los miembros de la familia PRMT son estudiados en la misma medida; por ejemplo, prmt9 fue descubierto recientemente para ser un miembro de la familia PRMT1. Los estudios de la estructura y de la función enzimática para estas proteínas requieren suficientes, a menudo miligramos, cantidades de proteína recombinante para estar disponibles.
El sistema de expresión procariota de Escherichia coli (E. coli)suele ser la primera opción para el cribado de expresión utilizando múltiples construcciones para una proteína dada7,8,9. Sin embargo, la expresión basada en E. colino siempre da lugar a cantidades suficientes de proteínas PRMT en sus formas activas, como hemos observado en particular para PRMT5 y PRMT7 (ver más abajo). Así, los PRMTs que no pudieron expresarse en E. coli o que necesitaban ser producidos por la maquinaria de expresión eucariota se subclonaron en vectores apropiados para el cribado de expresión en el sistema alternativo de vectores de expresión de baculovirus (BEVS). Mientras que las muestras expresadas de E. coli de PRMT1, PRMT3 y PRMT8 se han utilizado extensivamente para los análisis y la cristalografía ines vitro, otros PRMTs tales como PRMT5, que requiere el socio obligatorio MEP50 de su dominio dual de la metiltransferasa, y PRMTs tales como PRMT7 y 9, requieren la expresión de la célula del insecto para obtener cantidades suficientes de proteína activa. En general, los ensayos estandarizados de metiltransferasa de rendimiento medio para PRMT4, 5, 6, 7 y 9 han utilizado el BEVS en células de insectos6. El sistema de vectores de expresión de baculovirus (BEVS) es una plataforma versátil para producir proteínas recombinantes que requieren la maquinaria de expresión eucariota que permite modificaciones postraduccionales esenciales para estudios bioquímicos, biofísicos y estructurales10,11,12. Varios BEVSs han llegado a estar disponibles comercialmente desde el primer uso reportado de baculovirus en 1983 para la expresión de proteínas13. La mayoría de estos protocolos emplean diferentes estrategias para la transferencia del plásmido de expresión a las células de los insectos. Estos incluyen Bac-to-Bac, flashBAC, BaculoGOLD Bright, BacVector-3000, BacMagic, BacPAK, etc. Nuestro protocolo se basa en el sistema más comúnmente utilizado en BEVS, el sistema Bac-to-Bac14,que está diseñado para transferir el gen/ADNc que codifica la proteína de interés (POI, aquí los PRMTs) al genoma del baculovirus mantenido en una cepa especializada de E. coli a través de la transposición site-specific15.
Brevemente, el vector de transferencia de plásmidos que contiene el gen de interés se transformó en células competentes de DH10Bac E. coli para generar ADN bacmid viral recombinante. Las células adherentes Sf9 entonces fueron transfectadas con la DNA del bacmid. Cuatro a cinco días después de la transfección, los baculoviruses recombinantes iniciales secretados en el medio de cultivo celular fueron recuperados y etiquetados como el virus P1. Las existencias del baculovirus P1 entonces fueron utilizadas para la amplificación del virus (es decir, generación de acciones del baculovirus P2) y la investigación de la expresión de la proteína. De acuerdo con los resultados de la investigación de la expresión, los virus P2 para la mejor construcción de la expresión de la proteína fueron identificados y utilizados para generar culturas de la suspensión de las células baculovirus-infectadas del insecto (SCBIIS) para la producción a gran escala de la proteína. Aquí, describimos nuestros protocolos detallados y describimos el razonamiento detrás de nuestras opciones de reactivos y recipientes de cultivo para apoyar nuestra estrategia de desarrollar una metodología más eficiente en el tiempo, rentable y escalable para obtener cantidades suficientes de proteínas recombinantes deseadas.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2.8L Nalgene&#160; Fernbach Culture Flask, Polycarbonate,</td>
			<td>Nalgene</td>
			<td>29171-854</td>
			<td>For large scale maintenance of suspension culture of Sf9 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-Well Blocks RB</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>19583</td>
			<td>For incubation of&#160; 4ml of suspension&#160; Sf9 cells&#160; for protein&#160; expression screening</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-20 Criterion TGX Gel 26W 15 ul</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>5671095</td>
			<td>For SDS-PAGe analysis of the purified proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50ml Reagent Reservoir</td>
			<td>Celltreat Scientific Products</td>
			<td>229290</td>
			<td>&#160;Reservoir used for diluted transfection reagent&#160; and Sf9 cells suspension</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well cap mat, for use with square well, 2 mL</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>381080</td>
			<td>Used to cover 96 well block</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well PCR plate</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30129300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto agar</td>
			<td>BD</td>
			<td>214010</td>
			<td>For LB-agar selection paltes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Airpore Tape Sheets</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>19571</td>
			<td>To cover 24 well blocks for protein expression screening</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Allega X-15R Centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>392932</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic Antimycotic (100x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15240112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacmid DNA</td>
			<td>in-house</td>
			<td>non-catalog item</td>
			<td>Bacmid DNA for baculovirus production</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bluo-Gal, 1g</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15519028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beckman JLA 8.1000</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Plates, 24-Well, with lid, flat bottom, sterile</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30722116</td>
			<td>Tissue&#160; culture treated plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Resuspension Solution 0.5&#160;L</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>LSKCRS500</td>
			<td>For Bacmid DNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell&#160;Lysis Solution 0.5&#160;L</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>LSKCLS500</td>
			<td>For Bacmid DNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CELLSTAR&#160; Tissue Culture Plates, 96 well</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>655180</td>
			<td>For transfection mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ClipTip 1250, filter reload, sterile</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>94420818</td>
			<td>Tips for&#160; programmable and adjustable multichannel pipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP Mix (25 mM each)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>R1121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E1-ClipTip&#160; Electronic Adjustable Tip Spacing Multichannel Equalizer Pipette, 15 to 1250 &#956;L</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>4672090BT</td>
			<td>Programmable and adjustable multichannel pipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E4&#160; XLS adjustable spacer 6-channel pipette, 20-300 &#956;L</td>
			<td>Ranin</td>
			<td>LTS EA6-300XLS</td>
			<td>Ranin adjustable multichannel pipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter microplate, 96-well, polypropylene, with 25 &#181;m ultra high molecular weight polyethylene membrane</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>201005-100</td>
			<td>For protein purification in expression screening</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Full-Baffle Flask Kit Tunair, 2.5L</td>
			<td>IBI Scientific</td>
			<td>SS-6003C</td>
			<td>For large scale protein production in suspension culture of SF9 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin 10x10ml</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>15750078</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat Inactivated Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Wisent Biocenter</td>
			<td>080-450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>I-Max Insect Media W/ L-Glutamine, 1 L</td>
			<td>Wisent Biocenter</td>
			<td>301-045-LL</td>
			<td>Serum free insect cells growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>InstantBlue, Ultrafast Protein Stain</td>
			<td>Expedeon Protein Solutions</td>
			<td>ISB1L-1L</td>
			<td>For protein gel (SDS-PAGE) staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iptg, Ultra Pure, Dioxane Free, Min 99.5%</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>IPT001.100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JetPRIME Transfection Reagent&#160; Provided with&#160; jetPRIME buffer</td>
			<td>POLYPLUS TRANSFECTION Inc</td>
			<td>114-01</td>
			<td>For Sf9 cells transfection to generate baculovirus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin Monosulfate</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>KAN201.100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lb Broth (Lennox), Powder Microbial Gro&#38;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L3022-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterblock 96 deep well 2.4mL</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>780285-FD</td>
			<td>Used in the transformation and expression screening procedures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Max Efficiency DH10Bac Competent Cells , 0.5ml</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>10361012</td>
			<td>Competent cells for bacmid DNA generation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mLINE 12-Channel Pipette, adjustable 30 - 300 uL</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>Sartorius 725240</td>
			<td>12 channel pipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neutralization Solution, 0.5&#160;L</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>LSKNS0500</td>
			<td>For bacmid DNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>New Brunswick&#160; Innova 44R, 120V, orbit 2.5 cm (1 in)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>M1282-0004</td>
			<td>Shaker incubator for incubaion of suspension of Sf9 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA Agarose</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>30250</td>
			<td>For protein purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>LS15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PYREX&#160; Delong Shaker Erlenmeyer Flask with Baffles, Corning&#160; 500ml</td>
			<td>Pyrex</td>
			<td>4444-500</td>
			<td>For&#160; suspension culture of Sf9 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PYREX Delong Shaker Erlenmeyer Flask with Baffles, Corning&#160; 125ml</td>
			<td>Pyrex</td>
			<td>4444-125</td>
			<td>For suspension culture of Sf9 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PYREX Delong Shaker Erlenmeyer Flask with Baffles, Corning&#160; 250ml</td>
			<td>Pyrex</td>
			<td>4444-250</td>
			<td>For suspension culture of Sf9 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RedSafe&#160;Nucleic&#160;Acid&#160;Staining&#160;Solution</td>
			<td>Froggabio</td>
			<td>21141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase A, 0.9&#160;mL</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>LSKPMRN30</td>
			<td>For suspension buffer for bacmid DNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roll &#38; Grow Spherical Glass Plating Beads</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>115000550</td>
			<td>For&#160; spread&#160; of bacterial&#160; cells across the surface of an agar plate.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RT-LTS-A-300&#956;L-768/8 (tips)</td>
			<td>Ranin</td>
			<td>30389253</td>
			<td>Tips for ranin multichannel pipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S.O.C. Medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15544034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serum, Cell Culture, Fetal Bovine Serum (Fbs), Hyclone, Characterized Canadian</td>
			<td>cytivalifesciences</td>
			<td>SH3039602</td>
			<td>Addition to the serum free medim for&#160; the transfected cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sf9 cells</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>12659017</td>
			<td>Insect cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sfx-Insect Cell Culture Media</td>
			<td>Cytiva (Formerly GE Healthcare Life Sciences)</td>
			<td>SH3027802</td>
			<td>Serum free insect cells growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tape Pad</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>19570</td>
			<td>Tape Pad</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taq DNA Polymerase with ThermoPol Buffer - 2,000 units</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0267L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetracycline Hcl</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>TET701.10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue 0.4% Solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15250061</td>
			<td>For&#160; assessment of cell viability</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VITLAB&#160; Reagent Bottles, PP with Screw Caps, PP, BrandTech, 5L</td>
			<td>VITLAB</td>
			<td>V100889</td>
			<td>For large scale protein production in suspension culture of Sf9 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR&#160; Digital Mini Incubator</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10055-006</td>
			<td>Incubator for adherent Sf9 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR&#160; Incubating Microplate Shaker</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97043-606</td>
			<td>Incubator for suspension culture of Sf9 cells in 24 well blocks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Petri Dishes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>CA73370-037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-tremeGene 9 DNA&#160; Transfection Reagent&#160; 1.0 M</td>
			<td>Roche</td>
			<td>6365787001</td>
			<td>For Sf9 cells transfection to generate recombinant baculovirus</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

production of recombinant prmt proteins using the baculovirus expression vector system

Proteína arginina metiltransferasas (PRMTs) metilato arginina residuos en una amplia variedad de proteínas que desempeñan papeles en numerosos procesos celulares. PrmTs puede mono- o dimethylate arginina guanidino grupos simétricamente o asimétricamente. La enzimología de estas proteínas es un área compleja e intensamente investigada que requiere cantidades de miligramos de proteína recombinante de alta calidad. El sistema de vectores de expresión de baculovirus (BEVS) que emplea autographa californica nucleopolyhedrovirus múltiple (AcMNPV) y células de insectos Spodoptera frugiperda 9 (Sf9) se ha utilizado para la detección de expresión y la producción de muchos PRMTs, incluyendo PRMT 1, 2, y 4 a través de 9. Para detectar simultáneamente la expresión de múltiples construcciones de estas proteínas, incluidos dominios y fragmentos truncados, así como las proteínas de longitud completa, hemos aplicado métodos escalables utilizando pipetas multicanal ajustables y programables, combinadas con placas y bloques de 24 y 96 pozos. En general, estos ajustes del método permitieron una generación a gran escala de ADN bacmid, virus recombinantes y cribado de expresión de proteínas. El uso de recipientes de cultivo con un alto volumen de llenado de suspensión de células Sf9 ayudó a superar las limitaciones de espacio en la tubería de producción para la producción de proteínas a gran escala de un solo lote. Aquí, se describen protocolos detallados para la expresión eficiente y rentable de PRMTs funcionales para estudios bioquímicos, biofísicos y estructurales.

Una descripción general del protocolo BEVS se describe en la Figura 1. Múltiples construcciones de expresión de PRMTs, incluyendo de longitud completa, dominios y fragmentos truncados, se generaron en el Structural Genomics Consortium (SGC, Toronto) de acuerdo con estrategias internas con un intento de aumentar la tasa de éxito para la identificación de proteínas solubles y estables con un nivel de expresión relativamente alto7,9. Se anima a los lectores interesados a revisar las definiciones y la metodología del SGC de diseñar un "fragmento" como el segmento de la secuencia génica incorporada en un clon de expresión, "dominio" como un dominio estructural anotado por PFAM, y "constructo" como el fragmento clonado en un vector de expresión, todos los cuales han sido descritos en detalle en una publicación anterior7. Las construcciones de expresión de PRMTs presentadas en este protocolo son para la producción de las proteínas marcadas con polihistidina clonadas en el vector pFBOH-MHL, que es un derivado del vector pFastBac1. En la Figura 4,presentamos el análisis SDS-PAGE de las construcciones solubles his-tagged de PRMT1, 2, 4-9 purificados a partir de pellets recogidos después de 4 mL de producción en células Sf9 (paso 3.1.4). Prmt1 y PRMT9 de longitud completa (FL) no se presentan en este gel, ya que FL PRMT1 se ha producido a partir de E. coli,y FL PRMT9 producido a partir de BEVS ha sido purificado por Flag-tag6. Las construcciones truncadas de PRMT1, FL PRMT4 y todas las construcciones de PRMT8 muestran un rendimiento relativamente alto, pero los eluatos de proteínas contienen fracciones de contaminantes co-purificados. Estas construcciones requieren una mayor optimización de los protocolos de purificación. Por lo tanto, se requieren enfoques adicionales para mejorar la pureza de estas proteínas a partir de producciones a escala, como una reducción en la cantidad de perlas de níquel en la etapa de incubación con un lisato clarificado; un aumento de las concentraciones de imidazol en los tampones de lavado; escisión de la His-tag con la proteasa tev, seguido de la aplicación en una resina de afinidad ni; y, pasos de purificación adicionales como la cromatografía de exclusión de tamaño e intercambio iónico. Las construcciones de PRMT2 muestran un rendimiento significativamente menor en comparación con otras proteínas y la proteína PRMT2 de longitud completa acompañada de una fuerte banda de contaminantes. La producción a escala y dos pasos de purificaciones como IMAC y exclusión de tamaño confirmaron un bajo nivel de expresión para este constructo junto con la presencia persistente del contaminante co-purificante para la proteína FL. Se han obtenido proteínas puras para el complejo PRMT5 producidas y purificadas con su socio de unión obligado, MEP50. La construcción truncada de PRMT9 tiene un nivel de expresión casi dos o tres veces menor, cercano a 1,5 mg/L, en comparación con otros PRMTs. Sin embargo, las existencias virales recombinantes de este constructo se han utilizado para la producción a escala, se obtuvieron cristales difraccionantes, y se resolvió la estructura para esta proteína junto con PRMT4, 6 y 7(Figura 5).
Para las producciones de escalado vertical, se utilizaron los virus P2 correspondientes para infectar el cultivo en suspensión de las células de insectos Sf9. Este paso genera 50/100/200 mL de células infectadas por baculovirus que contienen células infectadas y virus P3 en el sobrenadante. Para la producción de proteínas a gran escala, se cultivaron 2 L de células Sf9 en cada uno de los matraces de agitación Fernbach de 2,8 L a 150 rpm, 27 °C(Figura 6). En el día de la producción, 2 L de células Sf9 (viabilidad celular > 97%) en 2,5 L los frascos de agitación Tunair o 4 L en 5 L botellas de reactivos se diluyeron a una densidad celular de 4 x 106/mL. Estas células fueron infectadas directamente con 10-12 mL/L de cultivo en suspensión de células de insectos infectados por baculovirus e incubadas a una temperatura bajada de 25 °C, a 145 rpm. La infección del lote de producción directamente con un cultivo en suspensión de células de insectos infectados por baculovirus redujo significativamente los pasos laboriosos y lentos en la amplificación del volumen del virus, excluyendo el manejo adicional de las células infectadas, y evitó la reducción del título y la degradación del virus. El mantenimiento del cultivo celular SF9 y la producción a escala se han realizado en los recipientes de cultivo con un volumen de alto llenado para adoptar una producción de proteínas a gran escala en un lote (Figura 6).
Las proteínas de longitud completa PRMT 4, 5 (en complejo con MEP50), 6, 7 y 9 producidas a partir de la plataforma de producción mediada por Baculovirus se han utilizado para la caracterización cinética y el cribado de compuestos inhibidores en el SGC6. Las estructuras cristalinas fueron resueltas y depositadas en el banco de datos de la proteína (PDB) para las formas completas o truncadas de las proteínas PRMT 4, 6, 7, y 9 con las varias puntas de prueba e inhibidores químicos. Los plásmidos de expresión para estos PRMTs se depositaron en el repositorio de plásmidos Addgene (Addgene es un socio distribuidor del SGC, https://www.addgene.org/) y están disponibles para la comunidad de investigación(Figura 5).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62510/62510fig01.jpg"> Figura 1:Descripción general esquemática de los pasos del proceso de expresión de baculovirus Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62510/62510fig01large.jpg" target="_blank">figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62510/62510fig02.jpg"> Figura 2: Baculovirus Células Sf9 infectadas y no infectadas. Los signos de infección son cambios estructurales en las células de los insectos, como un aumento del 25-50% en el diámetro celular, núcleos celulares agrandados, forma uniformemente redondeada, pérdida de proliferación y adherencia a la superficie del plato de cultivo, así como una disminución en la viabilidad celular. Barra de escala blanca 200 μm. Los signos de infección presentados aquí son los mismos para las células transfectadas que utilizan ambos reactivos de transfección, JetPrime y X-tremeGene 9. El ejemplo particular que se muestra es para el reactivo de transfección JetPrime. (A)Células Sf9 no infectadas como control. (B)Células Sf9 infectadas por baculovirus. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62510/62510fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62510/62510fig03.jpg"> Figura 3:Montaje de placas de unión para la purificación rápida de las proteínas de expresión de prueba. Consulte el texto para obtener más información, pasos 3.2.1-2 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62510/62510fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62510/62510fig04.jpg"> Figura 4:Resultados del cribado de expresión proteica. Los resultados del cribado de expresión proteica del baculovirus mediaron la producción de proteínas en 4 mL de cultivo en suspensión sf9 infectados con los correspondientes virus recombinantes P1 para diferentes PRMTs y el complejo PRMT5-MEP50. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62510/62510fig04large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62510/62510fig05.jpg"> Figura 5:Resumen de constructos de expresión para PRMT4, 6, 7 y 9 utilizados para estudios de estructura cristalina en el Structural Genomics Consortium, Toronto (SGC). Las estructuras cristalinas fueron resueltas y depositadas en el banco de datos de la proteína (PDB) para la longitud completa o las formas truncadas de proteínas PRMT 4, 6, 7, y 9 con las varias puntas de prueba y de los inhibidores químicos. Los plásmidos de expresión para estos PRMTs se depositaron en el repositorio de plásmidos Addgene y están disponibles para la comunidad de investigación (Addgene es un socio distribuidor del SGC, https://www.addgene.org/). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62510/62510fig05large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62510/62510fig06.jpg"> Figura 6:Mantenimiento de células de insectos Sf9 y producción de proteínas en los diferentes recipientes de cultivo: (A)Matraz Fernbach de 2,8 L para mantenimiento celular y producción de proteínas. El uso del volumen de llenado del 72% aumenta la tasa de rendimiento en 2,5 veces en una plataforma de agitación. (B) Los frascos de agitación de Tunair (solo 9 frascos de cada 10 se presentan en esta imagen) y las botellas de reactivos con un volumen de llenado del 80% aumentan drásticamente la capacidad de producción de la plataforma de agitación. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62510/62510fig06large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.</a>

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Production of Recombinant PRMT Proteins using the Baculovirus Expression Vector System

El sistema de vectores de expresión de baculovirus (BEVS) es una plataforma robusta para la detección de expresión y la producción de proteínas arginina metiltransferasas (PRMTs) que se utilizarán para estudios bioquímicos, biofísicos y estructurales. Cantidades de miligramo de material se pueden producir para la mayoría de prmts y otras proteínas de interés que requieren una plataforma de expresión eucariota.

Producción De Proteínas Prmt Recombinantes Utilizando El Sistema De Vectores De Expresión De Baculovirus

Protein arginine methyltransferases (PRMTs) methylate arginine residues on a wide variety of proteins that play roles in numerous cellular processes. ...

El objetivo general de este protocolo es la proyección de expresión de la construcción múltiple de la proteína arginina metiltransferasas en la producción a gran escala para obtener la cantidad de miligramo de la proteína para estudios bioquímicos, biofísicos y estructurales en el medio apoyado, modo rentable en la cobertura de la plataforma de expresión S, sistema de vectores de expresión de baculovirus. La Dra. Alma Seitova presentará los siguientes pasos. Diluya las células SF9 de crecimiento exponencial a la densidad celular final de 0,4 millones por mil en los medios de insectos sin suero, y vierta en el depósito de reactivos estériles.Utilice una pipeta multicanal programable para sembrar 0,5 milésimas de las células SF9 diluidas en cada pozo de la placa de 24 pozos. Este volumen es suficiente para garantizar una cobertura uniforme de la superficie de trabajo del pozo. Al mismo tiempo, no diluye demasiado la mezcla de transfección, lo que permite la eficiencia de la transfección.Etiquete un pozo de la placa como célula solamente, y utilícese como control para la comparación de la célula transfectada y no transfectada para evaluar si hay muestras potenciales de la infección. Incubar las placas a 27 grados hasta que sea necesario, aproximadamente una hora, para dejar que las células se adhieran a las placas de cultivo celular. Diluya el reactivo de transfección bien mezclado en el medio de insectos no compensado y en un depósito de reactivo estéril, y mezcle suavemente durante 10 segundos.Utilizando una pipeta de 12 canales, transfiera 102 microlitros del reactivo de transacción diluido a una placa estéril de 96 MicroWell. Transfiera 10 microlitros de 0,2 microgramos por microlitro de ADN de bacmid recombinante al pozo correspondiente de la placa MicroWell de 96 pozos y mezcle agitando suavemente, tocando la placa desde los lados. Incubar la mezcla de transfección durante 15 a 20 minutos para una formación compleja.Usando una pipeta ajustable de seis canales diseñada para la transferencia entre una placa de 96 y 24 pozos, superponga la mezcla de transfección en las células en cuanto a gotas en los pozos correspondientes de las placas de transfección, e incube durante cuatro horas a 27 grados. Para asegurar una distribución uniforme de la mezcla de transfección sobre la monocapa de las células, mezcle suavemente las placas hacia adelante y hacia atrás varias veces durante el tiempo de incubación. De cuatro a cinco horas después del tiempo de transfección, agregue 1.5 mils de medios de insectos sin suero.Complementarlo con un 10% final de suero fetal bovino inactivado por calor y un 1% antibiótico y antimicótico. Incubar células en una incubadora de 27 grados durante 72 a 96 horas. Mezcle suavemente las placas de transfección una vez al día cuando sea posible.Busque signos de infección evidentes en las células transfectadas a las 72 a 96 horas después del tiempo de transfección. Cuatro a cinco días después de la transfección, los signos de infección deben ser evidentes en las células transfectadas en comparación con las células de control bajo un microscopio invertido, y los baculovirus recombinantes iniciales secretados en el medio de cultivo celular deben estar listos para recoger. Utilice un multicanal electrónico programable para permitir simultáneamente la recolección de virus P1, la infección de células SF9 recién sembradas en la infección de células de suspensión en sus 24 bloques de pozos con 150 microlitros de los virus P1.Gire el resto de las acciones virales colectivas P1 durante 15 minutos, cubra los 24 bloques de pozos con cultivo en suspensión de las células SF9 infectadas con una lámina airpore. Incube el bloque de 24 pozos a 27 grados con agitación a 245 RPM durante 72 a 96 horas. Cuatro días antes del tiempo de producción programado, dividir exponencialmente el crecimiento de las células SF9, en una densidad celular final de 2 millones por mil en hilo dental de agitación de vidrio Erlenmeyer con deflectores en medios de insectos libres de suero que contienen 1% antibiótico final y antimicótico.Este paso generará un cultivo en suspensión de células de insectos infectados y virus P2 en el sobrenadante para la infección de nuevas células en el lote de producción. Agregue los virus P2 correspondientes e incube las células infectadas a la temperatura más baja de 25 grados para retardar el crecimiento celular, temblando a 165 RPM en una coctelera orbital con un movimiento de una pulgada. Cuatro días antes del tiempo de producción programado, Semilla dos litros de células SF9 de crecimiento exponencial en medios libres de suero de insectos a la densidad celular de 1 millón por mil, en el matraz de agitación Fernbach de 2.8 litros.Agite el matraz a 27 grados con agitación a 150 RPM. La científica investigadora Ashley Hutchinson demostrará el siguiente protocolo. Divida cuatro litros de células SF9 de crecimiento exponencial y medios libres de suero de insectos a la densidad celular final de 4 millones por mil en las botellas grandes de reactivos de cinco litros.Agregue de 10 a 12 milésimas del cultivo en suspensión de las células de insectos infectados por el baculovirus. Incubar el cultivo infectado de las células SF9 en una coctelera sacudiendo 145 RPM a una temperatura más baja de 25 grados Centígrados durante 72 a 96 horas. Las cantidades miligramos de varias proteínas recombinantes de la familia PRMT expresas en la producción inmediata de baculovirus en células SF9 se utilizan para estudios bioquímicos de instrucción biofísica, como se puede observar en la figura cinco.En el SGC, las estructuras cristalinas se resolvieron en depositado en el banco de datos de proteínas para las formas de longitud completa o truncadas de las proteínas PRMT4, 6, 7 y 9 con varias sondas químicas e inhibidores. Plásmidos de expresión para estos PRMTs fueron depositados para agregar la colección de genes por SGC y están disponibles para la comunidad de investigación. En este vídeo, hemos hecho hincapié en los elementos clave para el éxito de la expedición de cribado de su construcción múltiple de la proteína arginina metiltransferasas en la producción a gran escala en el sistema de expresión de baculovirus.El uso de las pipetas multicanal ajustables y programables regulares, hizo que todo su proceso fuera más rápido que eficiente. El uso de alto rendimiento y menos tóxico celular para las células, reactivo de transfección para la generación de virus recombinantes llevó a un protocolo de transfección más rentable y este manejo celular. La infección del lote a gran escala para la producción de proteínas con cultivo en suspensión de baculovirus infectado en seis células redujo significativamente los trabajos en un paso lento en la amplificación vital del iniciador.Es por ejemplo, centrifugamiento de esto con cultivo especial de células infectadas. Eso es, por supuesto, en excluido el manejo adicional de las células infectadas en evitar en su más apretado en la degradación del virus. El mantenimiento de la célula de cultivo en suspensión en esta escala de producción en el recipiente de cultivo fue de alto volumen de campo nos ayudó a superar la limitación del volumen de producción y adoptar una plataforma a gran escala.Esto es muy útil para los laboratorios sin acceso a los biorreactores o espacio limitado en la tubería de producción. Aunque nuestro protocolo se haya descrito para las proteínas de la familia de las metiltransferasas de la arginina de la proteína, el mismo acercamiento se puede aplicar a cualquier otra familia de las proteínas que requiere la plataforma de la expresión para obtener una cantidad suficiente de su proteína para los estudios instructivos biofísicos biofísicos.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Recombinant Protein Expression, Crystallization, and Biophysical Studies of a Bacillus-conserved Nucleotide Pyrophosphorylase, BcMazG

Recombinant Protein Expression, Crystallization, and Biophysical Studies of a Bacillus-conserved Nucleotide Pyrophosphorylase, BcMazG

Expresión de Proteínas Recombinantes, Cristalización y Estudios Biofísicos de un<em&gt; Bacillus</em&gt; -conservado Nucleótido Pirofosforilasa, BcMazG

To overcome safety restrictions and regulations when studying genes and proteins from true pathogens, their homologues can be studied. Bacillus anthracis ...

Investigación

Bioquímica

Transient Expression in Nicotiana Benthamiana Leaves for Triterpene Production at a Preparative Scale

Transient Expression in Nicotiana Benthamiana Leaves for Triterpene Production at a Preparative Scale

Expresión transitoria en Nicotiana Benthamiana las hojas para la producción de triterpeno a escala preparativa

The triterpenes are one of the largest and most structurally diverse families of plant natural products. Many triterpene derivatives have been shown to ...

Modifying Baculovirus Expression Vectors to Produce Secreted Plant Proteins in Insect Cells

Modificación de vectores de expresión de Baculovirus para producir secretado proteínas vegetales en células de los insectos

It has been a challenge for scientists to express recombinant secretory eukaryotic proteins for structural and biochemical studies. The ...

Large-scale Production of Recombinant RNAs on a Circular Scaffold Using a Viroid-derived System in Escherichia coli

Large-scale Production of Recombinant RNAs on a Circular Scaffold Using a Viroid-derived System in Escherichia coli

Producción a gran escala de ARN recombinante en un andamio Circular utilizando un sistema derivado de Viroide en Escherichia coli

With increasing interest in RNA biology and the use of RNA molecules in sophisticated biotechnological applications, the methods to produce large amounts ...

Use of Recombinant Fusion Proteins in a Fluorescent Protease Assay Platform and Their In-gel Renaturation

Uso de proteínas de fusión recombinantes en una plataforma de ensayo fluorescente proteasa y su renaturalización en gel

Proteases are intensively studied enzymes due to their essential roles in several biological pathways of living organisms and in pathogenesis; therefore, ...

Localization of SUMO-modified Proteins Using Fluorescent Sumo-trapping Proteins

Localización de proteínas de SUMO modificado utilizando proteínas de atrapamiento de sumo fluorescente

Here we are presenting a novel method to study the sumoylation of proteins and their sub-cellular localization in mammalian cells and nematode oocytes. ...

Expression, Purification, Crystallization, and Enzyme Assays of Fumarylacetoacetate Hydrolase Domain-Containing Proteins

Expresión, purificación, cristalización y ensayos enzimáticos de proteínas que contienen el dominio de la hidrolasa fumarilacetoacetato

Fumarylacetoacetate hydrolase (FAH) domain-containing proteins (FAHD) are identified members of the FAH superfamily in eukaryotes. Enzymes of this ...

Characterization of Membrane Transporters by Heterologous Expression in E. coli and Production of Membrane Vesicles

Characterization of Membrane Transporters by Heterologous Expression in E. coli and Production of Membrane Vesicles

Caracterización de transportadores de membranas por expresión heteróloga en E. coli y producción de vesículas de membrana

Several methods have been developed to functionally characterize novel membrane transporters. Polyamines are ubiquitous in all organisms, but polyamine ...

Transverse Sectioning of Mature Rice (Oryza sativa L.) Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Transverse Sectioning of Mature Rice Oryza sativa L. Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Seccionamiento transversal de arroz maduro (Oryza sativa L.) Núcleos para imágenes de microscopía electrónica de barrido utilizando puntas de pipeta como soporte de inmovilización

Starch granules (SGs) exhibit different morphologies depending on the plant species, especially in the endosperm of the Poaceae family. Endosperm ...

Cell-Free Production of Proteoliposomes for Functional Analysis and Antibody Development Targeting Membrane Proteins

Producción libre de células de proteoliposomas para análisis funcional y desarrollo de anticuerpos dirigidos a proteínas de membrana

Membrane proteins play essential roles in a variety of cellular processes and perform vital functions. Membrane proteins are medically important in drug ...