Name: production of recombinant prmt proteins using the baculovirus expression vector system
Uploaded: 2021-07-17T14:00:00
Duration: 8 min 57 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Production of Recombinant PRMT Proteins using the Baculovirus Expression Vector System at JoVE.com

Författarna vill tacka Dalia Barsyte-Lovejoy för att ha tagit sig tid att ge värdefull feedback och kritiska kommentarer om manuskriptet och alla våra SGC-kollegor som arbetade med PRMT-proteinfamiljen uttryckt från Baculovirus Expression Vector System.
SGC är en registrerad välgörenhetsorganisation (nummer 1097737) som får medel från AbbVie, Bayer AG, Boehringer Ingelheim, Genentech, Genome Canada genom Ontario Genomics Institute [OGI-196], EU och EFPIA genom det gemensamma företaget Innovative Medicines Initiative 2 [EUbOPEN grant 875510], Janssen, Merck KGaA (även känd som EMD i Kanada och USA), Pfizer, Takeda och Wellcome Trust [106169/ZZ14/Z].

<ol>
	<li>Guccione, E., Richard, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+regulation,+functions+and+relevance+of+arginine+methylation.">The regulation, functions and relevance of arginine methylation.</a> Nature Reviews in Molecular Cell Biology. 20 (10), 642-657 (2019).</li><li>Thandapani, P., O'Connor, T. R., Bailey, T. L., Richard, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+the+RGG/RG+motif.">Defining the RGG/RG motif.</a> Molecular Cell. 50 (5), 613-623 (2013).</li><li>Lorton, B. M., Shechter, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+consequences+of+arginine+methylation.">Cellular consequences of arginine methylation.</a> Cell and Molecular Life Sciences. 76 (15), 2933-2956 (2019).</li><li>Bedford, M. T., Clarke, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+arginine+methylation+in+mammals:+Who,+what,+and+why.">Protein arginine methylation in mammals: Who, what, and why.</a> Molecular Cell. 33 (1), 1-13 (2008).</li><li>Frankel, A., Brown, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+kinetic+data:+What+the+numbers+tell+us+about+PRMTs.">Evaluation of kinetic data: What the numbers tell us about PRMTs.</a> Biochimica Biophysica Acta Proteins Proteomics. 1867 (3), 306-316 (2018).</li><li>Li, A. S. M., Li, F., Eram, M. S., Bolotokova, A., Dela Se&#241;a, C. C., Vedadi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+probes+for+protein+arginine+methyltransferases.">Chemical probes for protein arginine methyltransferases.</a> Methods. 175, 30-43 (2020).</li><li>Savitsky, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+production+of+human+proteins+for+crystallization:+The+SGC+experience.">High-throughput production of human proteins for crystallization: The SGC experience.</a> Journal of Structural Biology. 172, 3-13 (2010).</li><li>Gileadi, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expressing+the+human+proteome+for+affinity+proteomics:+Optimizing+expression+of+soluble+protein+domains+and+in+vivo+biotinylation.">Expressing the human proteome for affinity proteomics: Optimizing expression of soluble protein domains and in vivo biotinylation.</a> New Biotechnology. 29 (5), 515-525 (2012).</li><li>Graslund, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+production+and+purification.">Protein production and purification.</a> Nature Methods. 5, 135 (2008).</li><li>Kost, T. A., Condreay, J. P., Jarvis, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Baculovirus+as+versatile+vectors+for+protein+expression+in+insect+and+mammalian+cells.">Baculovirus as versatile vectors for protein expression in insect and mammalian cells.</a> Nature Biotechnology. 23, 567-575 (2005).</li><li>Jarvis, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Baculovirus-insect+cell+expression+systems.">Baculovirus-insect cell expression systems.</a> Methods in Enzymology. 463, 191-222 (2009).</li><li>Shrestha, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Baculovirus+expression+vector+system:+an+emerging+host+for+high-throughput+eukaryotic+protein+expression.">Baculovirus expression vector system: an emerging host for high-throughput eukaryotic protein expression.</a> Methods in Molecular Biology. 439, 269-289 (2008).</li><li>Smith, G. E., Summers, M. D., Fraser, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+human+beta+interferon+in+insect+cells+infected+with+a+baculovirus+expression+vector.">Production of human beta interferon in insect cells infected with a baculovirus expression vector.</a> Molecular Cell Biology. 3, 2156-2165 (1983).</li><li>Invitrogen Life Technologies. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Invitrogen, Bac-to-Bac Baculovirus expression system. , (2010).</li><li>Luckow, V. A., Lee, S. C., Barry, G. F., Olins, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+generation+of+infectious+recombinant+baculoviruses+by+site-specific+transposon-mediated+insertion+of+foreign+genes+into+a+baculovirus+genome+propagated+in+Escherichia+coli.">Efficient generation of infectious recombinant baculoviruses by site-specific transposon-mediated insertion of foreign genes into a baculovirus genome propagated in Escherichia coli.</a> Journal of Virology. 67, 4566-4579 (1993).</li><li>Irons, S. L., Chambers, A. C., Lissina, O., King, L. A., Possee, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+Production+Using+the+Baculovirus+Expression+System.">Protein Production Using the Baculovirus Expression System.</a> Current Protocol in Protein Sciences. 91, 1-22 (2018).</li><li>Rieffel, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insect+cell+culture+in+reagent+bottles.">Insect cell culture in reagent bottles.</a> MethodsX. 1, 155-161 (2014).</li></ol>

Författarna förklarar ingen intressekonflikt.

En av fördelarna med BEVS i insektsceller är förmågan hos maskinerna för postöversättningsmodifiering för att möjliggöra mer komplexa modifieringar som fosforylering, myristoylering och glykosylering. Tillsammans med den mycket effektiva vikningen av däggdjursproteiner underlättar dessa modifieringar stora mängder modifierat och vikt protein som lämpar sig för fysiologiskt relevanta nedströmsexperiment16.
Här beskrev vi detaljerade protokoll av BEVS betonar kritiska element för framgångsrik uttryck screening av flera konstruktioner av PRMT proteiner och storskalig PRMT proteinproduktion i Baculovirus uttryck plattform: 1) Användningen av regelbundna, justerbara och programmerbara flerkanaliga pipetter för att överföra de biologiska materialen mellan 24- och 96 - väl cell kulturplattor och block i stadierna av bacmid DNA och virus generation; En samling rekombinanta virus, förstärkning av virusvolymer av rekombinanta virus och beredning av proteinuttrycksscreeningsblocken. 2) Högpresterande och kostnadseffektiva transfection reagenser för generering av rekombinanta virus. 3) Suspensionskultur av baculovirusinfekterade insektsceller (SCBIIC) för storskalig proteinproduktion. 4) Användning av högfyllningsvolym 2,8 L Fernbachskakflaskor för att upprätthålla Sf9-suspensionskulturen och 2,5 L Tunair-skakflaskor och 5 L reagensflaskor för storskalig proteinproduktion.
Särskilda överväganden och motiveringar för omvandlings- och transfection-stegen. Även om ett kommersiellt protokoll rekommenderar att man använder 100 μL kompetenta celler för en omvandling14,är omvandlingseffektiviteten hos kommersiella DH10Bac E. coli-kompetenta celler så hög som 1 x 108 cfu / μg DNA, så vi använder bara 4 μL. Detta är tillräckligt för varje transformant för att få isolerade vita rekombinanta kolonier för bacmid DNA-isoleringen. Vidhäftande Sf9 celler i 24-brunn transfection plattan såddes med en celltäthet på 2 x 105 /mL i 0,5 mL serumfria insektsmedier. Denna volym är tillräcklig för att säkerställa jämn täckning av brunnens arbetsyta. Samtidigt späder det inte ut transfectionblandningen för mycket, vilket förbättrar transfectioneffektiviteten. Transfection reagenser är giftfria för Sf9-cellerna, och medieutbyte är inte nödvändigt. I stället för en medieändring tillsätts ytterligare 1,5 ml media som innehåller 10 % (v/v) FBS i transfektionsplattan vid 4-5 timmar efter transfection-tid för att underlätta celltillväxt. Transfection effektiviteten hos båda transfection reagenser är hög. Ändå, med X-tremeGene 9, visas tecknen på infektion i de transfekterade cellerna (figur 2) 10-12 h tidigare än med JetPrime reagens, så vi väljer mellan dessa reagenser beroende på arbetsschemat för nästa steg i protokollen, vilket ger viss flexibilitet i den övergripande processen.
Screening av proteintestuttryck kan ställas in med P2-virus om mängden av de ursprungliga rekombinanta virusen, som samlats in från transfektplattan och märkts som P1, är en begränsande faktor att använda för proteinuttrycksscreeningen.
Överväganden när man går från små till stora kulturvolymer. Historiskt sett trodde man att optimal celltillväxt kräver ett högt luftutrymme i upphängningskulturen av Sf9-cellunderhåll och uppskalning av produktioner. Men 2014 rapporterades det att högt luftrum i kulturfartyg är mindre kritiskt än man tidigare trott17. Ett kulturkärl som inrättats med hjälp av lämpligt justerad skakningshastighet till skakplattformens omloppskastning kommer att ge tillräcklig syreöverföring även i högfyllningsvolymupphängningskulturen genom att skapa och underhålla små luftbubblor under en längre tid. Med detta tillvägagångssätt kan kommersiellt tillgängliga insektsceller odlas med en högre skakningshastighet inom ett normalt intervall av cellernas fördubblingstid utan att offra hög cell livskraft.
För sex år sedan började vi alltså öka upphängningskulturen i en skakkolv under cellunderhållet och införde en annan typ av odlingskärl för proteinproduktion samtidigt som vi justerade och övervakade skakningsförhållandena (figur 6). För att fastställa optimala förhållanden i dessa odlingskärl övervakade vi Sf9-cellkulturparametrarna som celldubblingstid tillsammans med cellens livskraft, storlek och form, aggregeringstillstånd och cellernas smittsamhet.
Till exempel, för Sf9-cellunderhåll, i 2,8 L Fernbach-skakkolverna, odlar vi 2 L istället för 0,8 L av Sf9-suspensionscellerna som skakar vid 150 varv/min vid 27 °C och cellens livskraft är för det mesta nära 99%, med jämnt formade friska delningsceller. För uppskalning av produktionen infekterar vi 4 L celler i 5 L reagensflaskor som skakar i hög hastighet som 145 varv/min vid en sänkt temperatur på 25 °C. De vanligaste inkubatorerna med inbyggd skakplattform kan rymma 6 x 2,8 L skakflaskor eller 6 x 5 L reagensflaskor, eller 10 x 2,5 L Tunair shake-flaskor. Således är kapaciteten hos den enda skakplattformen, om vi fyller Fernbachs skakflaskor och reagensflaskor till 1/3 jämfört med kärlens höga fyllningsvolym, 4,8 L jämfört med 12 L med hjälp av 2,8 L Fernbach skakflaskor och 10 L mot 24 L med 5 L reagensflaskor (Figur 6). Underhåll av suspensionsceller och uppskalning av produktionen i kulturkärlen med hög fyllvolym har hjälpt oss att övervinna begränsningarna i produktionsvolymerna och anta en storskalig plattform. Detta är därför mycket användbart för laboratorier utan tillgång till bioreaktorer och/eller begränsat utrymme i produktionspipelinerna.
Detta protokoll skulle lätt kunna anpassas för produktion och rening av proteinkonstruktioner med olika affinitetstaggar genom att använda lämpliga hartser och modifiera reningsbuffertar som har beskrivits i SGC publiceradi kapitel 6 för de flaggmärkta fullängdsproteinerna PRMT4, 7, 9 och det hansmärkta PRMT5-MEP50-komplexet och PRMT6. Även om vi beskriver ett BEVS-protokoll för PRMT-familjen av proteiner, kan samma tillvägagångssätt tillämpas på alla andra proteinfamiljer.

Protein arginin metyltransferaser (PRMTs) metylat argininrester på monometyl eller symmetriskt/asymmetriskt dimetyl sätt. De repetitiva RG/ RGG / GRG-sekvenserna är mycket föredragna av de flesta PRMTs och finns i en mängd olikaproteiner 1,2. Arginin metylerade proteiner såsom histoner eller transkriptionsfaktorer och splitsfaktorer reglerar transkription, skarvning och kromatinstruktur3,4. Ökande kunskap om olika regleringar av substrat och kofaktorutnyttjande, omsättning och kinetik hos PRMTs, liksom generering av selektiva hämmare, har kastat mekanistiskt ljus på dessa enzymer och deras komplex5,6. Emellertid studeras inte alla PRMT-familjemedlemmar i samma utsträckning; Till exempel upptäcktes PRMT9 först nyligen vara medlem i PRMT-familjen1. Struktur- och enzymfunktionsstudier för dessa proteiner kräver tillräckliga, ofta milligram, mängder rekombinant protein för att vara tillgängliga.
Escherichia coli (E. coli) prokaryota uttryckssystem är vanligtvis förstahandsvalet för uttrycksscreening med hjälp av flera konstruktioner för ett givet protein7,8,9. E. coli-baseradeuttryck resulterar dock inte alltid i tillräckliga mängder PRMT-proteiner i sina aktiva former, vilket vi särskilt har noterat för PRMT5 och PRMT7 (se nedan). Prmts som inte uttryckte sig i E. coli eller behövde produceras av eukaryota uttrycksmaskiner var således instubberade i vektorer som var lämpliga för uttrycksscreening i det alternativa baculovirusuttrycksvektorsystemet (BEVS). Medan E. coli uttryckte prover av PRMT1, PRMT3 och PRMT8 har använts i stor utsträckning för in vitro-analyser och kristallografi, kräver andra PRMTs såsom PRMT5, som kräver parlamentsledamot50 bindande partner för sin dubbla metyltransferasdomän, och PRMTs som PRMT7 och 9, insektscelluttryck för att erhålla tillräckliga mängder aktivt protein. Sammantaget har de standardiserade metyltransferasanalyserna för MEDELGENOMSTRÖMNING för PRMT4, 5, 6, 7 och 9 använt BEVS i insektsceller6. Baculovirus uttryck vektorsystem (BEVS) är en mångsidig plattform för att producera rekombinanta proteiner som kräver eukaryota uttryck maskiner som möjliggör post-translationella modifieringar väsentliga för biokemiska, biofysiska och strukturella studier10,11,12. Flera BEVSs har blivit kommersiellt tillgängliga sedan den första rapporterade användningen av baculovirus 1983 för proteinuttryck13. De flesta av dessa protokoll använder olika strategier för överföring av uttrycket plasmid till insektsceller. Dessa inkluderar Bac-to-Bac, flashBAC, BaculoGOLD Bright, BacVector-3000, BacMagic, BacPAK, etc. Vårt protokoll är baserat på det vanligaste systemet i BEVS, Bac-to-Bac-systemet14, som är utformat för att överföra genen / cDNA kodning av proteinet av intresse (POI, här PRMTs) till baculovirusgenomet som upprätthålls i en specialiserad stam av E. coli via platsspecifikt införlivande15.
Kortfattat omvandlades plasmid överföring vektor som innehåller genen av intresse till DH10Bac E. coli kompetenta celler för att generera rekombinant viral bacmid DNA. Vidhäftande Sf9 celler var sedan transfected med bacmid DNA. Fyra till fem dagar efter transfection, första rekombinanta baculovirus utsöndras i cell kultur medium återfanns och märkts som P1 virus. P1 baculovirus lager användes sedan för virusförstärkning (dvs generation av P2 baculovirus lager) och protein uttryck screening. Baserat på uttrycket screening resultat identifierades P2 virus för bästa uttryck konstruktion av proteinet och används för att generera suspension kulturer av baculovirus-infekterade insekt celler (SCBIIS) för storskalig protein produktion. Här beskriver vi våra detaljerade protokoll och beskriver logiken bakom våra reagens- och kulturkärlsval för att stödja vår strategi att utveckla en mer tidseffektiv, kostnadseffektiv och skalbar metodik för att få tillräckliga mängder önskade rekombinanta proteiner.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2.8L Nalgene&#160; Fernbach Culture Flask, Polycarbonate,</td>
			<td>Nalgene</td>
			<td>29171-854</td>
			<td>For large scale maintenance of suspension culture of Sf9 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-Well Blocks RB</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>19583</td>
			<td>For incubation of&#160; 4ml of suspension&#160; Sf9 cells&#160; for protein&#160; expression screening</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-20 Criterion TGX Gel 26W 15 ul</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>5671095</td>
			<td>For SDS-PAGe analysis of the purified proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50ml Reagent Reservoir</td>
			<td>Celltreat Scientific Products</td>
			<td>229290</td>
			<td>&#160;Reservoir used for diluted transfection reagent&#160; and Sf9 cells suspension</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well cap mat, for use with square well, 2 mL</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>381080</td>
			<td>Used to cover 96 well block</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well PCR plate</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30129300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto agar</td>
			<td>BD</td>
			<td>214010</td>
			<td>For LB-agar selection paltes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Airpore Tape Sheets</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>19571</td>
			<td>To cover 24 well blocks for protein expression screening</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Allega X-15R Centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>392932</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic Antimycotic (100x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15240112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacmid DNA</td>
			<td>in-house</td>
			<td>non-catalog item</td>
			<td>Bacmid DNA for baculovirus production</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bluo-Gal, 1g</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15519028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beckman JLA 8.1000</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Plates, 24-Well, with lid, flat bottom, sterile</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30722116</td>
			<td>Tissue&#160; culture treated plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Resuspension Solution 0.5&#160;L</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>LSKCRS500</td>
			<td>For Bacmid DNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell&#160;Lysis Solution 0.5&#160;L</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>LSKCLS500</td>
			<td>For Bacmid DNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CELLSTAR&#160; Tissue Culture Plates, 96 well</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>655180</td>
			<td>For transfection mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ClipTip 1250, filter reload, sterile</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>94420818</td>
			<td>Tips for&#160; programmable and adjustable multichannel pipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP Mix (25 mM each)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>R1121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E1-ClipTip&#160; Electronic Adjustable Tip Spacing Multichannel Equalizer Pipette, 15 to 1250 &#956;L</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>4672090BT</td>
			<td>Programmable and adjustable multichannel pipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E4&#160; XLS adjustable spacer 6-channel pipette, 20-300 &#956;L</td>
			<td>Ranin</td>
			<td>LTS EA6-300XLS</td>
			<td>Ranin adjustable multichannel pipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter microplate, 96-well, polypropylene, with 25 &#181;m ultra high molecular weight polyethylene membrane</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>201005-100</td>
			<td>For protein purification in expression screening</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Full-Baffle Flask Kit Tunair, 2.5L</td>
			<td>IBI Scientific</td>
			<td>SS-6003C</td>
			<td>For large scale protein production in suspension culture of SF9 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin 10x10ml</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>15750078</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat Inactivated Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Wisent Biocenter</td>
			<td>080-450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>I-Max Insect Media W/ L-Glutamine, 1 L</td>
			<td>Wisent Biocenter</td>
			<td>301-045-LL</td>
			<td>Serum free insect cells growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>InstantBlue, Ultrafast Protein Stain</td>
			<td>Expedeon Protein Solutions</td>
			<td>ISB1L-1L</td>
			<td>For protein gel (SDS-PAGE) staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iptg, Ultra Pure, Dioxane Free, Min 99.5%</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>IPT001.100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JetPRIME Transfection Reagent&#160; Provided with&#160; jetPRIME buffer</td>
			<td>POLYPLUS TRANSFECTION Inc</td>
			<td>114-01</td>
			<td>For Sf9 cells transfection to generate baculovirus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin Monosulfate</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>KAN201.100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lb Broth (Lennox), Powder Microbial Gro&#38;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L3022-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterblock 96 deep well 2.4mL</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>780285-FD</td>
			<td>Used in the transformation and expression screening procedures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Max Efficiency DH10Bac Competent Cells , 0.5ml</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>10361012</td>
			<td>Competent cells for bacmid DNA generation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mLINE 12-Channel Pipette, adjustable 30 - 300 uL</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>Sartorius 725240</td>
			<td>12 channel pipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neutralization Solution, 0.5&#160;L</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>LSKNS0500</td>
			<td>For bacmid DNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>New Brunswick&#160; Innova 44R, 120V, orbit 2.5 cm (1 in)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>M1282-0004</td>
			<td>Shaker incubator for incubaion of suspension of Sf9 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA Agarose</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>30250</td>
			<td>For protein purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>LS15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PYREX&#160; Delong Shaker Erlenmeyer Flask with Baffles, Corning&#160; 500ml</td>
			<td>Pyrex</td>
			<td>4444-500</td>
			<td>For&#160; suspension culture of Sf9 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PYREX Delong Shaker Erlenmeyer Flask with Baffles, Corning&#160; 125ml</td>
			<td>Pyrex</td>
			<td>4444-125</td>
			<td>For suspension culture of Sf9 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PYREX Delong Shaker Erlenmeyer Flask with Baffles, Corning&#160; 250ml</td>
			<td>Pyrex</td>
			<td>4444-250</td>
			<td>For suspension culture of Sf9 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RedSafe&#160;Nucleic&#160;Acid&#160;Staining&#160;Solution</td>
			<td>Froggabio</td>
			<td>21141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase A, 0.9&#160;mL</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>LSKPMRN30</td>
			<td>For suspension buffer for bacmid DNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roll &#38; Grow Spherical Glass Plating Beads</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>115000550</td>
			<td>For&#160; spread&#160; of bacterial&#160; cells across the surface of an agar plate.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RT-LTS-A-300&#956;L-768/8 (tips)</td>
			<td>Ranin</td>
			<td>30389253</td>
			<td>Tips for ranin multichannel pipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S.O.C. Medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15544034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serum, Cell Culture, Fetal Bovine Serum (Fbs), Hyclone, Characterized Canadian</td>
			<td>cytivalifesciences</td>
			<td>SH3039602</td>
			<td>Addition to the serum free medim for&#160; the transfected cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sf9 cells</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>12659017</td>
			<td>Insect cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sfx-Insect Cell Culture Media</td>
			<td>Cytiva (Formerly GE Healthcare Life Sciences)</td>
			<td>SH3027802</td>
			<td>Serum free insect cells growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tape Pad</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>19570</td>
			<td>Tape Pad</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taq DNA Polymerase with ThermoPol Buffer - 2,000 units</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0267L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetracycline Hcl</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>TET701.10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue 0.4% Solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15250061</td>
			<td>For&#160; assessment of cell viability</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VITLAB&#160; Reagent Bottles, PP with Screw Caps, PP, BrandTech, 5L</td>
			<td>VITLAB</td>
			<td>V100889</td>
			<td>For large scale protein production in suspension culture of Sf9 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR&#160; Digital Mini Incubator</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10055-006</td>
			<td>Incubator for adherent Sf9 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR&#160; Incubating Microplate Shaker</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97043-606</td>
			<td>Incubator for suspension culture of Sf9 cells in 24 well blocks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Petri Dishes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>CA73370-037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-tremeGene 9 DNA&#160; Transfection Reagent&#160; 1.0 M</td>
			<td>Roche</td>
			<td>6365787001</td>
			<td>For Sf9 cells transfection to generate recombinant baculovirus</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

production of recombinant prmt proteins using the baculovirus expression vector system

Protein arginin metyltransferaser (PRMTs) metylat argininrester på en mängd olika proteiner som spelar roller i många cellulära processer. PRMTs kan antingen mono- eller dimetylate arginin guanidino grupper symmetriskt eller asymmetriskt. Enzymologin hos dessa proteiner är ett komplext och intensivt undersökt område som kräver milligram mängder högkvalitativt rekombinant protein. Baculovirus uttryck vektorsystem (BEVS) använder Autographa californica flera nukleopolyhedrovirus (AcMNPV) och Spodoptera frugiperda 9 (Sf9) insektsceller har använts för uttryck screening och produktion av många PRMTs, inklusive PRMT 1, 2 och 4 till 9. För att samtidigt screena för uttryck av flera konstruktioner av dessa proteiner, inklusive domäner och trunkerade fragment samt fulllängdsproteiner, har vi tillämpat skalbara metoder som använder justerbara och programmerbara flerkanalspipetter, kombinerat med 24- och 96-brunnsplattor och block. Sammantaget möjliggjorde dessa metodjusteringar en storskalig generation av bacmid-DNA, rekombinanta virus och proteinuttrycksscreening. Att använda kulturkärl med en hög fyllningsvolym av Sf9-cellfjädring hjälpte till att övervinna utrymmesbegränsningar i produktionspipelinen för storskalig proteinproduktion med en sats. Här beskriver vi detaljerade protokoll för effektiva och kostnadseffektiva uttryck av funktionella PRMTs för biokemiska, biofysiska och strukturella studier.

En översikt över BEVS-protokollet beskrivs i figur 1. Flera uttryckskonstruktioner av PRMTs, inklusive full längd, domäner och trunkerade fragment, genererades vid Structural Genomics Consortium (SGC, Toronto) enligt interna strategier med ett försök att öka framgångsgraden för att identifiera lösliga och stabila proteiner med en relativt hög uttrycksnivå7,9. Intresserade läsare uppmuntras att granska SGC: s definitioner och metodik för att utforma ett "fragment" som segmentet i gensekvensen som ingår i en uttrycksklon, "domän" som en PFAM-kommenterad strukturell domän och "konstruera" som fragmentet klonat i ett uttryck vektor, som alla har beskrivits i detalj i en tidigarepublikation 7. Uttryck konstruktioner av PRMTs presenteras i detta protokoll är för produktion av polyhistidin-märkta proteiner klonas i pFBOH-MHL vektor, som är ett derivat av pFastBac1 vektor. I figur 4presenterar vi SDS-PAGE-analys av de hismärkta lösliga konstruktionerna av PRMT1, 2, 4-9 renade från pellets som samlats in efter 4 ml produktion i Sf9-celler (steg 3.1.4). Full längd (FL) PRMT1 och PRMT9 presenteras inte i denna gel, eftersom FL PRMT1 har producerats från E. coli, och FL PRMT9 som produceras från BEVS har renats av Flag-tag6. De trunkerade konstruktionerna av PRMT1, FL PRMT4 och alla PRMT8-konstruktioner visar ett relativt högt utbyte, men proteinelektriat innehåller fraktioner av samrenade föroreningar. Dessa konstruktioner kräver ytterligare optimering av reningsprotokollen. Det krävs därför ytterligare metoder för att förbättra renheten hos dessa proteiner från uppskalning av produktioner, såsom en minskning av mängden nickelpärlor i inkubationsstadiet med ett förtydligat lysat. En ökning av imidazolkoncentrationerna i tvättbuffertarna. klyvning av His-tag med TEV protease, följt av tillämpning på en Ni-affinity harts; och ytterligare reningssteg såsom storleksuteslutning och jonutbyteskromatografi. Konstruktionerna av PRMT2 visar betydligt lägre utbyte jämfört med andra proteiner och PRMT2-protein i full längd tillsammans med ett starkt föroreningsband. Uppskalningsproduktion och två steg av rening, såsom IMAC och storleksuteslutning, bekräftade en låg uttrycksnivå för denna konstruktion tillsammans med den ihållande förekomsten av det samrenande föroreningsmedlet för FL-proteinet. Rena proteiner har erhållits för PRMT5-komplexet som produceras och renas med sin obligatoriska bindande partner, MEP50. Den trunkerade konstruktionen av PRMT9 har nästan två eller tre gånger lägre uttrycksnivå, nära 1,5 mg/L, jämfört med andra PRMTs. De rekombinanta viruslagren i denna konstruktion har dock använts för uppskalning av produktion, diffractingkristaller erhölls och strukturen löstes för detta protein tillsammans med PRMT4, 6 och 7 (Figur 5).
För uppskalningsproduktionerna användes motsvarande P2-virus för att infektera suspensionskulturen hos Sf9-insektsceller. Detta steg genererar 50/100/200 ml baculovirusinfekterade celler som innehåller infekterade celler och P3-virus i supernaten. För den storskaliga proteinproduktionen odlades 2 L Sf9-celler i var och en av 2,8 L Fernbachskakkolvar vid 150 varv/min, 27 °C (figur 6). På produktionsdagen var 2 L Sf9-celler (cellens livskraft > 97%) i 2,5 L Tunair skakflaskor eller 4 L i 5 L reagensflaskor späddes till en celltäthet på 4 x 106/ml. Dessa celler smittades direkt med 10-12 ml/L suspension kultur av baculovirus-infekterade insekt celler och inkuberade vid en sänkt temperatur av 25 °C, vid 145 rpm. Infektion i produktionspartiet direkt med en suspensionskultur av baculovirusinfekterade insektsceller minskade avsevärt mödosamma och tidskrävande steg i virusvolymförstärkning, exklusive extra hantering av de infekterade cellerna, och undvek minskning av titer och virusnedbrytning. Underhåll av SF9-cellkultur och uppskalning har gjorts i kulturkärlen med hög fyllvolym för att anta en storskalig proteinproduktion i ett parti (figur 6).
Prmt 4, 5 i full längd (i komplext med MEP50), 6, 7 och 9 proteiner som framställts från baculovirusmedling produktionsplattformen har använts för kinetisk karakterisering och inhibitorföreningsscreening vid SGC6. Kristallstrukturer löstes och deponerades i Protein Data Bank (PDB) för de full längd eller trunkerade formerna av proteinerna PRMT 4, 6, 7 och 9 med olika kemiska sonder och hämmare. Uttrycksplasmider för dessa PRMTs deponerades till Addgene plasmid-arkivet (Addgene är en distribuerande partner till SGC, https://www.addgene.org/) och är tillgängliga för forskarsamhället (Figur 5).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62510/62510fig01.jpg"> Bild 1: Schematisk översikt över stegen i baculovirusuttrycksprocessen <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62510/62510fig01large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av den här figuren.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62510/62510fig02.jpg"> Figur 2: Baculovirus Infekterade och oinfekterade Sf9-celler. Tecken på infektion är strukturella förändringar i insektscellerna, såsom en 25-50% ökning av celldiametern, förstorade cellkärnor, jämnt rundad form, förlust av spridning och vidhäftning av odlingsskålens yta, liksom en minskning av cellens livskraft. Vit skala bar 200 μm. De tecken på infektion som presenteras här är desamma för de transfekterade cellerna med hjälp av både transfection reagenser, JetPrime och X-tremeGene 9. Det särskilda exemplet som visas är för JetPrime transfection reagens. A)Oinfekterade Sf9-celler som en kontroll. B)Baculovirusinfekterade Sf9-celler. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62510/62510fig02large.jpg" target="_blank">Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62510/62510fig03.jpg"> Figur 3:Bindningsplatta för snabb rening av testuttrycksproteiner. Se text för mer information, steg 3.2.1-2 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62510/62510fig03large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av den här figuren.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62510/62510fig04.jpg"> Figur 4: Screeningresultat för proteinuttryck. Protein uttryck screening resultat av baculovirus medierade protein produktion i 4 ml Sf9 suspension kultur infekterad med motsvarande P1 rekombinanta virus för olika PRMTs och PRMT5-MEP50 komplexa. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62510/62510fig04large.jpg" target="_blank">Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62510/62510fig05.jpg"> Figur 5: Sammanfattning av uttryckskonstruktioner för PRMT4, 6, 7 och 9 som används för kristallstrukturstudier vid Structural Genomics Consortium, Toronto (SGC). Kristallstrukturerna löstes och deponerades i Protein Data Bank (PDB) för hela längden eller trunkerade former av proteiner PRMT 4, 6, 7 och 9 med olika kemiska sonder och hämmare. Uttrycksplasmider för dessa PRMTs deponerades till Addgene plasmid-arkivet och är tillgängliga för forskarsamhället (Addgene är en distribuerande partner till SGC, https://www.addgene.org/). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62510/62510fig05large.jpg" target="_blank">Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62510/62510fig06.jpg"> Figur 6: Underhåll av insektsceller och proteinproduktion i de olika odlingskärlen: (A) 2,8 L Fernbachkolv för cellunderhåll och proteinproduktion. Användningen av 72% fyllningsvolym ökar genomströmningshastigheten med 2,5 gånger i en skakningsplattform. B)Skakflaskor från Tunair (endast 9 flaskor av 10 presenteras på denna bild) och reagensflaskor med en 80- procentig påfyllningsvolym ökar drastiskt skakplattformens produktionskapacitet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62510/62510fig06large.jpg" target="_blank">Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Production of Recombinant PRMT Proteins using the Baculovirus Expression Vector System at JoVE.com

Production of Recombinant PRMT Proteins using the Baculovirus Expression Vector System

Baculovirus uttryck vektorsystem (BEVS) är en robust plattform för uttryck screening och produktion av protein arginin metyltransferaser (PRMTs) som ska användas för biokemiska, biofysiska och strukturella studier. Milligram mängder material kan produceras för de flesta PRMTs och andra proteiner av intresse som kräver en eukaryotic uttryck plattform.

Produktion av rekombinanta PRMT-proteiner med baculovirusuttrycksvektorsystemet

Protein arginine methyltransferases (PRMTs) methylate arginine residues on a wide variety of proteins that play roles in numerous cellular processes. ...

Det övergripande målet med detta protokoll är uttryck screening av flera konstruktion av protein arginin metyltransferaser i storskalig produktion för att erhålla milligram mängd av proteinet för biokemiska, biofysiska och strukturella studier i det mediumstödda, kostnadseffektiva läget i täckningen av uttryck plattform S, baculovirus uttryck vektorsystem. Dr.Alma Seitova kommer att presentera följande steg. Späd ut de exponentiellt växande SF9-cellerna till den slutliga celltätheten på 0,4 miljoner per mil i det serumfria insektsmediet och häll i den sterila reagensbehållaren.Använd en programmerbar flerkanalspipett för att så 0,5 mil av de utspädda SF9-cellerna till varje brunn på 24-brunnsplattan. Denna volym är tillräcklig för att säkerställa jämn täckning av brunnens arbetsyta. Samtidigt späder den inte ut transfectionblandningen för mycket, vilket möjliggör transfection effektivitet.Märk en brunn av plattan som endast cell och använd den som en kontroll för jämförelse av den transfekterade och icke-transfecterade cellen för att bedöma för potentiella tecken på infektion. Inkubera plattorna vid 27 grader tills det behövs, ungefär en timme, för att låta cellerna fästa på cellkulturplattorna. Späd välblandat transfection reagens i det obevaklade insektsmediet och en steril reagensbehållare och blanda försiktigt i 10 sekunder.Använd en 12-kanalig pipett och överför 102 mikroliter av det utspädda transaktionsreagenset till en steril 96 MicroWell-platta. Överför 10 mikroliter på 0,2 mikrogram per mikroliter rekombinant bacmid-DNA till motsvarande brunn på 96-brunns MicroWell-plattan och blanda genom att försiktigt skaka och knacka på plattan från sidorna. Inkubera transfectionblandningen i 15 till 20 minuter för en komplex formation.Använd en justerbar sexkanalig pipett utformad för överföring mellan en 96- och 24-brunnsplatta, överlägg transfectionblandningen på cellerna drop-wise i motsvarande brunnar på transfectionplattorna och inkubera i fyra timmar vid 27 grader. För att säkerställa jämn fördelning av transfectionblandningen över cellernas monoskikt, vagga försiktigt plattorna fram och tillbaka flera gånger under inkubationstiden. Fyra till fem timmar efter transfection-tiden, tillsätt 1,5 mil serumfria insektsmedier.Komplettera det med 10% slutligt värmeinaktiverat fetala nötkreatur serum och 1%antibiotikum och antimycotic. Inkubera celler i en 27-graders inkubator i 72 till 96 timmar. Gunga försiktigt transfectionplattorna en gång om dagen när det är möjligt.Leta efter tecken på infektion uppenbart i transfected celler vid 72 till 96 timmar efter transfection tid. Fyra till fem dagar efter transfektion bör tecken på infektion vara uppenbara i de transfekterade cellerna i jämförelse med kontrollcellerna under ett inverterat mikroskop, och de första rekombinanta baculovirusen som utsöndras i cellkulturmediet bör vara redo att samlas in. Använd en programmerbar elektronisk flerkanal för att samtidigt möjliggöra insamling av P1-virus, infektion av nysådda SF9-celler vid infektion av suspensionsceller i deras 24 brunnsblock med 150 mikroliter av P1-virusen.Snurra ner resten av de kollektiva P1-viruslagren i 15 minuter, täck de 24 brunnsblocken med suspensionskultur av de infekterade SF9-cellerna med ett AirPore-ark. Inkubera 24-brunnsblocket vid 27 grader med skakningar vid 245 RPM:er i 72 till 96 timmar. Fyra dagar före planerad produktionstid, dela exponentiellt växande SF9 celler, med en slutlig celltäthet på 2 miljoner per mil i Erlenmeyer glas shake tandtråd med baffel i serumfria insektsmedier som innehåller 1%slutligt antibiotikum och antimykotiskt.Detta steg kommer att generera suspensionskultur av infekterade insektsceller och P2-virus i supernaten för infektion av nya celler i produktionspartiet. Tillsätt motsvarande P2-virus och inkubera infekterade celler vid den lägre temperaturen på 25 grader för att bromsa celltillväxten och skaka vid 165 RPM:er på en orbital shaker med en tums slaglängd. Fyra dagar före den planerade produktionstiden frö två liter exponentiellt växande SF9-celler i insektsserumfria medier till celltätheten på 1 miljon per mil, i den 2,8 liters Fernbach shake-kolven.Skaka kolven i 27 grader med skakningar vid 150 RPM: er. Forskaren Ashley Hutchinson kommer att visa följande protokoll. Dela fyra liter exponentiellt växande SF9-celler och insektsserumfria medier till den slutliga celltätheten på 4 miljoner per mil i de stora fem liter reagensflaskorna.Tillsätt 10 till 12 mil av suspensionskulturen hos de baculovirusinfekterade insektscellerna. Inkubera den infekterade kulturen hos SF9-cellerna i en skakapparat som skakar ut 145 RPM vid en lägre temperatur på 25 grader Celsius i 72 till 96 timmar. Milligram mängder av flera rekombinanta proteiner från PRMT familjen express i baculovirus omedelbar produktion i SF9 celler används för biokemiska biofysiska instruktionsstudier, som kan ses i figur fem.På SGC löstes kristallstrukturer i deponeras i proteindatabanken för hela längden eller trunkerade former av proteinerna PRMT4, 6, 7 och 9 med olika kemiska sonder och hämmare. Uttrycksplasmider för dessa PRMTs deponerades för att lägga till gensamling av SGC och är tillgängliga för forskarsamhället. I den här videon har vi betonat viktiga element för framgångsrik expeditionsscreening av deras multipla konstruktion av proteinet argininmetyltransferaser i den storskaliga produktionen i baculovirusuttryckssystemet.Användningen av de vanliga justerbara och programmerbara flerkanalspipetterna gjorde hela processen snabbare än effektiv. Användning av högpresterande och mindre cell giftigt för cellerna, transfection reagens för generering av rekombinanta virus ledde till mer kostnadseffektivt och denna cell hantering transfection protokoll. Infektion i den storskaliga satsen för proteinproduktion med suspensionskultur av baculovirus infekterat i sex celler minskade avsevärt arbetet i tidskrävande steg i vital starterförstärkning.Är till exempel centrifugering detta med speciell kultur av infekterade celler. Det är naturligtvis i utesluten extra hantering av de infekterade cellerna i undvika i deras hårdare i virusnedbrytning. Underhåll av produktionsceller för suspensionskultur i denna skala upp produktionen i kulturkärlet var hög fältvolym hjälper oss att övervinna begränsningen av produktionsvolymen och anta en storskalig plattform.Detta är mycket användbart för labben utan tillgång till bioreaktorerna eller begränsat utrymme i produktionspipelinen. Även om vårt protokoll har beskrivits för proteinet arginin metyltransferaser familjen, kan samma tillvägagångssätt tillämpas på alla andra proteiner familj som kräver uttryck plattform för att erhålla en tillräcklig mängd av deras protein för biokemiska biofysiska instruktionsstudier.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Recombinant Protein Expression, Crystallization, and Biophysical Studies of a Bacillus-conserved Nucleotide Pyrophosphorylase, BcMazG

Recombinant Protein Expression, Crystallization, and Biophysical Studies of a Bacillus-conserved Nucleotide Pyrophosphorylase, BcMazG

Rekombinant Proteinuttryck, Kristallisation och Biofysiska Studier av a<em&gt; Bacillus</em&gt; -konserverad nukleotidpyrofosforylas, BcMazG

To overcome safety restrictions and regulations when studying genes and proteins from true pathogens, their homologues can be studied. Bacillus anthracis ...

Transient Expression in Nicotiana Benthamiana Leaves for Triterpene Production at a Preparative Scale

Transient Expression in Nicotiana Benthamiana Leaves for Triterpene Production at a Preparative Scale

Övergående uttryck i Nicotiana Benthamiana lämnar för Triterpene produktion i preparativ skala

The triterpenes are one of the largest and most structurally diverse families of plant natural products. Many triterpene derivatives have been shown to ...

Modifying Baculovirus Expression Vectors to Produce Secreted Plant Proteins in Insect Cells

Modifiera baculoviridae uttryck vektorer att producera utsöndras växtproteiner i insekt celler

It has been a challenge for scientists to express recombinant secretory eukaryotic proteins for structural and biochemical studies. The ...

Large-scale Production of Recombinant RNAs on a Circular Scaffold Using a Viroid-derived System in Escherichia coli

Large-scale Production of Recombinant RNAs on a Circular Scaffold Using a Viroid-derived System in Escherichia coli

Storskalig produktion av rekombinant RNAs på en cirkulär byggnadsställning Viroid-härledda System med i Escherichia coli

With increasing interest in RNA biology and the use of RNA molecules in sophisticated biotechnological applications, the methods to produce large amounts ...

Use of Recombinant Fusion Proteins in a Fluorescent Protease Assay Platform and Their In-gel Renaturation

Användning av rekombinanta fusionsproteinerna i en fluorescerande proteas Assay plattform och deras i-gel utvinningsarbete

Proteases are intensively studied enzymes due to their essential roles in several biological pathways of living organisms and in pathogenesis; therefore, ...

Localization of SUMO-modified Proteins Using Fluorescent Sumo-trapping Proteins

Lokalisering av SUMO-modifierade proteiner med fluorescerande Sumo-fångst proteiner

Here we are presenting a novel method to study the sumoylation of proteins and their sub-cellular localization in mammalian cells and nematode oocytes. ...

Expression, Purification, Crystallization, and Enzyme Assays of Fumarylacetoacetate Hydrolase Domain-Containing Proteins

Uttryck, rening, kristallisering, och enzym analyser av Fumarylacetoacetat Hydrolase Domain-innehållande proteiner

Fumarylacetoacetate hydrolase (FAH) domain-containing proteins (FAHD) are identified members of the FAH superfamily in eukaryotes. Enzymes of this ...

Characterization of Membrane Transporters by Heterologous Expression in E. coli and Production of Membrane Vesicles

Characterization of Membrane Transporters by Heterologous Expression in E. coli and Production of Membrane Vesicles

Karakterisering av membran transportörer genom heterologt uttryck i E. coli och produktion av membran blåsor

Several methods have been developed to functionally characterize novel membrane transporters. Polyamines are ubiquitous in all organisms, but polyamine ...

Transverse Sectioning of Mature Rice (Oryza sativa L.) Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Transverse Sectioning of Mature Rice Oryza sativa L. Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Tvärgående sektionering av moget ris (Oryza sativa L.) Kärnor för skanning av elektronmikroskopiavbildning med pipettespetsar som immobiliseringsstöd

Starch granules (SGs) exhibit different morphologies depending on the plant species, especially in the endosperm of the Poaceae family. Endosperm ...

Cell-Free Production of Proteoliposomes for Functional Analysis and Antibody Development Targeting Membrane Proteins

Cellfri produktion av proteoliposomer för funktionell analys och antikroppsutveckling riktad mot membranproteiner

Membrane proteins play essential roles in a variety of cellular processes and perform vital functions. Membrane proteins are medically important in drug ...