Name: production of recombinant prmt proteins using the baculovirus expression vector system
Uploaded: 2021-07-17T14:00:00
Duration: 8 min 57 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Production of Recombinant PRMT Proteins using the Baculovirus Expression Vector System at JoVE.com

Yazarlar, Dalia Barsyte-Lovejoy'a makale hakkında değerli geri bildirimler ve eleştirel yorumlar sunmak için zaman ayıran ve Baculovirus Expression Vector System'den ifade edilen PRMT protein ailesi ile çalışan tüm SGC meslektaşlarımıza teşekkür etmek istememektedir.
SGC, AbbVie, Bayer AG, Boehringer Ingelheim'dan fon alan kayıtlı bir yardım kuruluşudur (1097737 numarası), Genentech, Ontario Genomik Enstitüsü aracılığıyla Genom Kanada [OGI-196], Yenilikçi İlaç Girişimi 2 Ortak Girişimi aracılığıyla AB ve EFPIA [EUbOPEN hibesi 875510], Janssen, Merck KGaA (Kanada ve ABD'de EMD), Pfizer, Takeda ve Wellcome Trust [106169/ZZ14/Z].

<ol>
	<li>Guccione, E., Richard, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+regulation,+functions+and+relevance+of+arginine+methylation.">The regulation, functions and relevance of arginine methylation.</a> Nature Reviews in Molecular Cell Biology. 20 (10), 642-657 (2019).</li><li>Thandapani, P., O'Connor, T. R., Bailey, T. L., Richard, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+the+RGG/RG+motif.">Defining the RGG/RG motif.</a> Molecular Cell. 50 (5), 613-623 (2013).</li><li>Lorton, B. M., Shechter, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+consequences+of+arginine+methylation.">Cellular consequences of arginine methylation.</a> Cell and Molecular Life Sciences. 76 (15), 2933-2956 (2019).</li><li>Bedford, M. T., Clarke, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+arginine+methylation+in+mammals:+Who,+what,+and+why.">Protein arginine methylation in mammals: Who, what, and why.</a> Molecular Cell. 33 (1), 1-13 (2008).</li><li>Frankel, A., Brown, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+kinetic+data:+What+the+numbers+tell+us+about+PRMTs.">Evaluation of kinetic data: What the numbers tell us about PRMTs.</a> Biochimica Biophysica Acta Proteins Proteomics. 1867 (3), 306-316 (2018).</li><li>Li, A. S. M., Li, F., Eram, M. S., Bolotokova, A., Dela Se&#241;a, C. C., Vedadi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+probes+for+protein+arginine+methyltransferases.">Chemical probes for protein arginine methyltransferases.</a> Methods. 175, 30-43 (2020).</li><li>Savitsky, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+production+of+human+proteins+for+crystallization:+The+SGC+experience.">High-throughput production of human proteins for crystallization: The SGC experience.</a> Journal of Structural Biology. 172, 3-13 (2010).</li><li>Gileadi, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expressing+the+human+proteome+for+affinity+proteomics:+Optimizing+expression+of+soluble+protein+domains+and+in+vivo+biotinylation.">Expressing the human proteome for affinity proteomics: Optimizing expression of soluble protein domains and in vivo biotinylation.</a> New Biotechnology. 29 (5), 515-525 (2012).</li><li>Graslund, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+production+and+purification.">Protein production and purification.</a> Nature Methods. 5, 135 (2008).</li><li>Kost, T. A., Condreay, J. P., Jarvis, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Baculovirus+as+versatile+vectors+for+protein+expression+in+insect+and+mammalian+cells.">Baculovirus as versatile vectors for protein expression in insect and mammalian cells.</a> Nature Biotechnology. 23, 567-575 (2005).</li><li>Jarvis, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Baculovirus-insect+cell+expression+systems.">Baculovirus-insect cell expression systems.</a> Methods in Enzymology. 463, 191-222 (2009).</li><li>Shrestha, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Baculovirus+expression+vector+system:+an+emerging+host+for+high-throughput+eukaryotic+protein+expression.">Baculovirus expression vector system: an emerging host for high-throughput eukaryotic protein expression.</a> Methods in Molecular Biology. 439, 269-289 (2008).</li><li>Smith, G. E., Summers, M. D., Fraser, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+human+beta+interferon+in+insect+cells+infected+with+a+baculovirus+expression+vector.">Production of human beta interferon in insect cells infected with a baculovirus expression vector.</a> Molecular Cell Biology. 3, 2156-2165 (1983).</li><li>Invitrogen Life Technologies. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Invitrogen, Bac-to-Bac Baculovirus expression system. , (2010).</li><li>Luckow, V. A., Lee, S. C., Barry, G. F., Olins, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+generation+of+infectious+recombinant+baculoviruses+by+site-specific+transposon-mediated+insertion+of+foreign+genes+into+a+baculovirus+genome+propagated+in+Escherichia+coli.">Efficient generation of infectious recombinant baculoviruses by site-specific transposon-mediated insertion of foreign genes into a baculovirus genome propagated in Escherichia coli.</a> Journal of Virology. 67, 4566-4579 (1993).</li><li>Irons, S. L., Chambers, A. C., Lissina, O., King, L. A., Possee, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+Production+Using+the+Baculovirus+Expression+System.">Protein Production Using the Baculovirus Expression System.</a> Current Protocol in Protein Sciences. 91, 1-22 (2018).</li><li>Rieffel, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insect+cell+culture+in+reagent+bottles.">Insect cell culture in reagent bottles.</a> MethodsX. 1, 155-161 (2014).</li></ol>

Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyanda bulunun.

Bevs'in böcek hücrelerindeki avantajlarından biri, fosforilasyon, miristosilasyon ve glikosilasyon gibi daha karmaşık modifikasyonları sağlamak için çeviri sonrası modifikasyon makinelerinin yeteneğine odaklanmaktadır. Memeli proteinlerinin yüksek verimli katlama ile birlikte, bu değişiklikler fizyolojik olarak ilgili aşağı akış deneyleri için uygun yüksek miktarda modifiye edilmiş ve katlanmış proteini kolaylaştırır16.
Burada, BACULOVIRUS ekspresyon platformunda BIRDEN fazla PRMT proteini ve büyük ölçekli PRMT protein üretiminin başarılı bir şekilde ifade taranması için kritik unsurları vurgulayan BEVS'in ayrıntılı protokollerini açıkladık: 1) Biyolojik malzemeleri 24 ila 96 arasında aktarmak için düzenli, ayarlanabilir ve programlanabilir çok kanallı pipetlerin kullanılması - bakteri DNA'sı ve virüs üretimi aşamalarında iyi hücre kültürü plakaları ve blokları; rekombinant virüslerin toplanması, rekombinant virüslerin viral hacimlerinin amplifikasyonu ve protein ekspresyon tarama bloklarının hazırlanması. 2) Rekombinant virüslerin üretimi için yüksek performanslı ve uygun maliyetli transfeksiyon reaktifleri. 3) Büyük ölçekli protein üretimi için baculovirüs ile enfekte böcek hücrelerinin (SCBIIC) süspansiyon kültürü. 4) Sf9 süspansiyon kültürünü korumak için yüksek dolgu hacmi 2.8 L Fernbach sallama şişelerinin ve büyük ölçekli protein üretimi için 2.5 L Tunair sallama şişelerinin ve 5 L reaktif şişelerinin kullanımı.
Dönüşüm ve transfection adımları için özel hususlar ve gerekçeler. Ticari bir protokol bir dönüşüm için 100 μL yetkin hücre kullanılmasını önerse de14, ticari DH10Bac E. coli yetkin hücrelerinin dönüşüm verimliliği 1 x 108 cfu / μg DNA kadar yüksektir, bu nedenle sadece 4 μL kullanırız. Bu, her dönüştürücünün bacmid DNA izolasyonu için izole edilmiş beyaz rekombinant koloniler elde etmesi için yeterlidir. 24 kuyu transfeksiyon plakasındaki yapışan Sf9 hücreleri, Serumsuz Böcek Ortamı'nın 0,5mL'sinde 2 x 10 5 /mL hücre yoğunluğunda tohumlandı. Bu hacim, kuyunun çalışma yüzeyinin eşit olarak kapsamasını sağlamak için yeterlidir. Aynı zamanda, transfeksiyon karışımını çok fazla seyreltmez, bu da transfeksiyon verimliliğini arttırır. Transfeksiyon reaktifleri Sf9 hücreleri için toksik değildir ve ortam değişimi gerekli değildir. Medya değişikliği yerine, hücre büyümesini kolaylaştırmak için transfeksiyon plakasına 4-5 saat sonra %10 (v/v) FBS içeren ek 1,5 mL ortam eklenir. Her iki transfeksiyon reaktifinin transfeksiyon verimliliği yüksektir. Yine de, X-tremeGene 9 ile, transfected hücrelerde enfeksiyon belirtileri (Şekil 2) JetPrime reaktifinden 10-12 saat daha erken görünür, bu nedenle protokollerdeki sonraki adımların çalışma programına bağlı olarak bu reaktifler arasında seçim yapıyoruz, bu da genel süreçte biraz esneklik sağlıyor.
Transfeksiyon plakasından toplanan ve P1 olarak etiketlenen ilk rekombinant virüslerin miktarı protein ekspresyon taraması için kullanılacak sınırlayıcı bir faktörse, protein testi ekspresyon taraması P2 virüsleri ile ayarlanabilir.
Küçük kültür hacimlerinden büyük kültür hacimlerine geçerken dikkat edilmesi gereken noktalar. Tarihsel olarak, optimal hücre büyümesinin Sf9 hücre bakımı ve ölçek büyütme üretimlerinin süspansiyon kültüründe yüksek bir hava alanı gerektirdiğine inanılmıştır. Bununla birlikte, 2014 yılında, kültür gemilerindeki yüksek hava alanının daha önce düşünülenden daha az kritik olduğu bildirildi17. Sallama platformunun yörünge atışına uygun şekilde ayarlanmış sallama hızı kullanılarak kurulan bir kültür gemisi, küçük hava kabarcıkları oluşturarak ve daha uzun süre koruyarak yüksek dolgu hacimli süspansiyon kültüründe bile yeterli oksijen transferi sağlayacaktır. Bu yaklaşımla, ticari olarak mevcut böcek hücreleri, yüksek hücre canlılığından ödün vermeden hücrelerin iki katına çıkması süresinin normal bir aralığında daha yüksek bir sallama hızında kültürlenebilir.
Böylece 6 yıl önce hücre bakımı sırasında sallanan bir şişede süspansiyon kültürü hacmini artırmaya başladık ve sallama koşullarını ayarlayıp izlerken protein üretimi için farklı bir kültür damarı türü tanıttık (Şekil 6). Bu kültür damarlarında en uygun koşulları sağlamak için, hücre canlılığı, boyutu ve şekli, toplama durumu ve hücrelerin enfekte edilebilirliği ile birlikte hücrenin iki katına çıkması gibi Sf9 hücre kültürü parametrelerini izledik.
Örneğin, Sf9 hücre bakımı için, 2.8 L Fernbach sallama şişelerinde, 27 ° C'de 150 rpm'de sallanan Sf9 süspansiyon hücrelerinin 0.8 L yerine 2 L'yi kültürlüyoruz ve hücre canlılığı çoğu zaman% 99'a yakındır, eşit şekilli sağlıklı bölme hücreleri ile. Ölçek büyütme üretimi için, 25 °C'lik daha düşük bir sıcaklıkta 145 rpm olarak yüksek hızda sallanan 5 L reaktif şişelerde 4 L hücre enfekte ediyoruz. Dahili sallama platformuna sahip en yaygın kullanılan inkübatörler 6 x 2,8 L sallama şişeleri veya 6 x 5 L reaktif şişeleri veya 10 x 2,5 L Tunair sallama şişelerini tutabilir. Bu nedenle, fernbach sallama şişelerini ve reaktif şişelerini damarların yüksek dolum hacmine karşı 1/3'e doldurursak, bir sallama platformunun kapasitesi 4,8 L'ye karşı 12 L'dir ve 2,8 L Fernbach sallama şişeleri ve 5 L reaktif şişeler kullanarak 10 L'ye karşı 24 L'dir (Şekil 6). Süspansiyon hücre kültürü bakımı ve yüksek dolum hacmine sahip kültür gemilerinde ölçek büyütme üretimi, üretim hacimlerindeki sınırlamaların üstesinden gelmemize ve büyük ölçekli bir platform benimsememize yardımcı oldu. Bu nedenle, bu, biyoreaktörlere erişimi olmayan ve/veya üretim boru hatlarında sınırlı alana sahip laboratuvarlar için son derece yararlıdır.
Bu protokol, uygun reçineler kullanılarak ve SGC tarafından yayınlanan PRMT4, 7, 9 ve His etiketli PRMT5-MEP50 kompleksi ve PRMT6'nın Bayrak etiketli tam uzunluktaki proteinleri için6. PRMT protein ailesi için bir BEVS protokolü tarif etsek de, aynı yaklaşım başka herhangi bir protein ailesine de uygulanabilir.

Protein arginin metiltransfenazlar (PRMT'ler) monometrik veya simetrik/asimetrik dimetil tarzında metillat arginin kalıntıları. Tekrarlayan RG/RGG/GRG dizileri çoğu PRMT tarafından çok tercih edilir ve çok çeşitli proteinlerde bulunur1,2. Histonlar veya transkripsiyon faktörleri ve birleştirme faktörleri gibi arginin metillenmiş proteinler transkripsiyon, birleştirme ve kromatin yapısını düzenler3,4. PRMT'lerin substrat ve kofaktör kullanımı, cirosu ve kinetiğinin çeşitli düzenlenmesi ve seçici inhibitörlerin üretimi hakkında artan bilgi, bu enzimlere ve komplekslerine mekanistik ışık tutmaktadır5,6. Ancak, tüm PRMT aile üyeleri aynı ölçüde çalışılmamıştır; örneğin, PRMT9'un PRMT ailesinin bir üyesi olduğu yeni keşfedildi1. Bu proteinler için yapı ve enzim fonksiyon çalışmaları yeterli, genellikle miligram, miktarlarda rekombinant proteinin mevcut olmasını gerektirir.
Escherichia coli (E. coli) prokaryotik ifade sistemi genellikle belirli bir protein7,8,9için birden fazla yapı kullanılarak ifade taraması için ilk tercihtir. Bununla birlikte, E. colibazlı ekspresyon, özellikle PRMT5 ve PRMT7 için belirttiğimiz gibi, aktif formlarında her zaman yeterli miktarda PRMT proteini ile sonuçlanmamıştır (aşağıya bakın). Böylece E. coli'de ifade edemeyen veya ökaryotik ekspresyon makineleri tarafından üretilmesi gereken PRMT'ler alternatif baculovirüs ekspresyon vektör sisteminde (BEVS) ekspresyon taramasına uygun vektörlere alt kavun haline getirildi. E. coli PRMT1, PRMT3 ve PRMT8 örneklerini in vitro tahliller ve kristalografi için yoğun olarak kullanırken, çift metiltransfenaz alanının MEP50 bağlayıcı ortağı gerektiren PRMT5 ve PRMT7 ve 9 gibi PRMT'ler gibi diğer PRMT'ler yeterli miktarda aktif protein elde etmek için böcek hücresi ekspresyonunu gerektirir. Genel olarak, PRMT4, 5, 6, 7 ve 9 için standartlaştırılmış orta verimli metiltransfenaz tahlilleri BEVS'i böcek hücrelerinde kullanmıştır6. Baculovirüs ekspresyon vektör sistemi (BEVS), biyokimyasal, biyofiziksel ve yapısal çalışmalar için gerekli olan çeviri sonrası modifikasyonları sağlayan ökaryotik ekspresyon makineleri gerektiren rekombinant proteinler üretmek için çok yönlü bir platformdur10,11,12. Birkaç BEVS, 1983'te protein ekspresyonu için bildirilen ilk baculovirüs kullanımından bu yana ticari olarak kullanılabilir halegelmiştir 13. Bu protokollerin çoğu, ifade plazmidinin böcek hücrelerine aktarılması için farklı stratejiler kullanmaktadır. Bunlar Bac-to-Bac, flashBAC, BaculoGOLD Bright, BacVector-3000, BacMagic, BacPAK, vb. Protokolümüz, BEVS'te en sık kullanılan sistem olan Bac-to-Bac sistemi14'edayanmaktadır, ilgi proteinini kodlayan geni / cDNA kodlamasını (POI, burada PRMT'ler) meydana özgü bir E. coli suşunda tutulan baculovirüs genomuna aktarmak için tasarlanmıştır15.
Kısaca, ilgi genini içeren plazmid transfer vektörü, rekombinant viral bacmid DNA'sı oluşturmak için DH10Bac E. coli yetkin hücrelerine dönüştürüldü. Daha sonra yandaş Sf9 hücrelerine bacmid DNA'sı bulaştı. Transfeksiyondan dört ila beş gün sonra, hücre kültürü ortamına salgılanan ilk rekombinant baculovirüsler kurtarıldı ve P1 virüsü olarak etiketlendi. P1 baculovirus stokları daha sonra virüs amplifikasyonu (yani P2 baculovirus stoklarının üretimi) ve protein ekspresyon taraması için kullanıldı. İfade tarama sonuçlarına dayanarak, proteinin en iyi ifade yapısı için P2 virüsleri tanımlanmış ve büyük ölçekli protein üretimi için baculovirüs ile enfekte böcek hücrelerinin (SCBIIS) süspansiyon kültürlerini oluşturmak için kullanılmıştır. Burada, istenen rekombinant proteinlerin yeterli miktarda elde etmek için daha zaman verimli, uygun maliyetli ve ölçeklenebilir bir metodoloji geliştirme stratejimizi desteklemek için reaktif ve kültür gemisi seçimlerimizin arkasındaki mantığı açıklıyoruz.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2.8L Nalgene&#160; Fernbach Culture Flask, Polycarbonate,</td>
			<td>Nalgene</td>
			<td>29171-854</td>
			<td>For large scale maintenance of suspension culture of Sf9 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-Well Blocks RB</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>19583</td>
			<td>For incubation of&#160; 4ml of suspension&#160; Sf9 cells&#160; for protein&#160; expression screening</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-20 Criterion TGX Gel 26W 15 ul</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>5671095</td>
			<td>For SDS-PAGe analysis of the purified proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50ml Reagent Reservoir</td>
			<td>Celltreat Scientific Products</td>
			<td>229290</td>
			<td>&#160;Reservoir used for diluted transfection reagent&#160; and Sf9 cells suspension</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well cap mat, for use with square well, 2 mL</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>381080</td>
			<td>Used to cover 96 well block</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well PCR plate</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30129300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto agar</td>
			<td>BD</td>
			<td>214010</td>
			<td>For LB-agar selection paltes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Airpore Tape Sheets</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>19571</td>
			<td>To cover 24 well blocks for protein expression screening</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Allega X-15R Centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>392932</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic Antimycotic (100x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15240112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacmid DNA</td>
			<td>in-house</td>
			<td>non-catalog item</td>
			<td>Bacmid DNA for baculovirus production</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bluo-Gal, 1g</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15519028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beckman JLA 8.1000</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Plates, 24-Well, with lid, flat bottom, sterile</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30722116</td>
			<td>Tissue&#160; culture treated plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Resuspension Solution 0.5&#160;L</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>LSKCRS500</td>
			<td>For Bacmid DNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell&#160;Lysis Solution 0.5&#160;L</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>LSKCLS500</td>
			<td>For Bacmid DNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CELLSTAR&#160; Tissue Culture Plates, 96 well</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>655180</td>
			<td>For transfection mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ClipTip 1250, filter reload, sterile</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>94420818</td>
			<td>Tips for&#160; programmable and adjustable multichannel pipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP Mix (25 mM each)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>R1121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E1-ClipTip&#160; Electronic Adjustable Tip Spacing Multichannel Equalizer Pipette, 15 to 1250 &#956;L</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>4672090BT</td>
			<td>Programmable and adjustable multichannel pipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E4&#160; XLS adjustable spacer 6-channel pipette, 20-300 &#956;L</td>
			<td>Ranin</td>
			<td>LTS EA6-300XLS</td>
			<td>Ranin adjustable multichannel pipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter microplate, 96-well, polypropylene, with 25 &#181;m ultra high molecular weight polyethylene membrane</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>201005-100</td>
			<td>For protein purification in expression screening</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Full-Baffle Flask Kit Tunair, 2.5L</td>
			<td>IBI Scientific</td>
			<td>SS-6003C</td>
			<td>For large scale protein production in suspension culture of SF9 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin 10x10ml</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>15750078</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat Inactivated Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Wisent Biocenter</td>
			<td>080-450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>I-Max Insect Media W/ L-Glutamine, 1 L</td>
			<td>Wisent Biocenter</td>
			<td>301-045-LL</td>
			<td>Serum free insect cells growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>InstantBlue, Ultrafast Protein Stain</td>
			<td>Expedeon Protein Solutions</td>
			<td>ISB1L-1L</td>
			<td>For protein gel (SDS-PAGE) staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iptg, Ultra Pure, Dioxane Free, Min 99.5%</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>IPT001.100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JetPRIME Transfection Reagent&#160; Provided with&#160; jetPRIME buffer</td>
			<td>POLYPLUS TRANSFECTION Inc</td>
			<td>114-01</td>
			<td>For Sf9 cells transfection to generate baculovirus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin Monosulfate</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>KAN201.100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lb Broth (Lennox), Powder Microbial Gro&#38;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L3022-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterblock 96 deep well 2.4mL</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>780285-FD</td>
			<td>Used in the transformation and expression screening procedures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Max Efficiency DH10Bac Competent Cells , 0.5ml</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>10361012</td>
			<td>Competent cells for bacmid DNA generation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mLINE 12-Channel Pipette, adjustable 30 - 300 uL</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>Sartorius 725240</td>
			<td>12 channel pipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neutralization Solution, 0.5&#160;L</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>LSKNS0500</td>
			<td>For bacmid DNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>New Brunswick&#160; Innova 44R, 120V, orbit 2.5 cm (1 in)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>M1282-0004</td>
			<td>Shaker incubator for incubaion of suspension of Sf9 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA Agarose</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>30250</td>
			<td>For protein purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>LS15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PYREX&#160; Delong Shaker Erlenmeyer Flask with Baffles, Corning&#160; 500ml</td>
			<td>Pyrex</td>
			<td>4444-500</td>
			<td>For&#160; suspension culture of Sf9 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PYREX Delong Shaker Erlenmeyer Flask with Baffles, Corning&#160; 125ml</td>
			<td>Pyrex</td>
			<td>4444-125</td>
			<td>For suspension culture of Sf9 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PYREX Delong Shaker Erlenmeyer Flask with Baffles, Corning&#160; 250ml</td>
			<td>Pyrex</td>
			<td>4444-250</td>
			<td>For suspension culture of Sf9 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RedSafe&#160;Nucleic&#160;Acid&#160;Staining&#160;Solution</td>
			<td>Froggabio</td>
			<td>21141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase A, 0.9&#160;mL</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>LSKPMRN30</td>
			<td>For suspension buffer for bacmid DNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roll &#38; Grow Spherical Glass Plating Beads</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>115000550</td>
			<td>For&#160; spread&#160; of bacterial&#160; cells across the surface of an agar plate.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RT-LTS-A-300&#956;L-768/8 (tips)</td>
			<td>Ranin</td>
			<td>30389253</td>
			<td>Tips for ranin multichannel pipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S.O.C. Medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15544034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serum, Cell Culture, Fetal Bovine Serum (Fbs), Hyclone, Characterized Canadian</td>
			<td>cytivalifesciences</td>
			<td>SH3039602</td>
			<td>Addition to the serum free medim for&#160; the transfected cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sf9 cells</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>12659017</td>
			<td>Insect cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sfx-Insect Cell Culture Media</td>
			<td>Cytiva (Formerly GE Healthcare Life Sciences)</td>
			<td>SH3027802</td>
			<td>Serum free insect cells growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tape Pad</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>19570</td>
			<td>Tape Pad</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taq DNA Polymerase with ThermoPol Buffer - 2,000 units</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0267L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetracycline Hcl</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>TET701.10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue 0.4% Solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15250061</td>
			<td>For&#160; assessment of cell viability</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VITLAB&#160; Reagent Bottles, PP with Screw Caps, PP, BrandTech, 5L</td>
			<td>VITLAB</td>
			<td>V100889</td>
			<td>For large scale protein production in suspension culture of Sf9 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR&#160; Digital Mini Incubator</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10055-006</td>
			<td>Incubator for adherent Sf9 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR&#160; Incubating Microplate Shaker</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97043-606</td>
			<td>Incubator for suspension culture of Sf9 cells in 24 well blocks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Petri Dishes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>CA73370-037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-tremeGene 9 DNA&#160; Transfection Reagent&#160; 1.0 M</td>
			<td>Roche</td>
			<td>6365787001</td>
			<td>For Sf9 cells transfection to generate recombinant baculovirus</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

production of recombinant prmt proteins using the baculovirus expression vector system

Protein arginin metiltransfenazlar (PRMTs) çok sayıda hücresel işlemde rol oynayan çok çeşitli proteinler üzerinde metillat arginin kalıntıları. PRMT'ler simetrik veya asimetrik olarak mono veya dimetilit arginin guanidino grupları olabilir. Bu proteinlerin enzmolojisi, miligram miktarlarda yüksek kaliteli rekombinant protein gerektiren karmaşık ve yoğun bir şekilde araştırılan bir alandır. Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus (AcMNPV) ve Spodoptera frugiperda 9 (Sf9) böcek hücrelerini kullanan baculovirus ekspresyon vektör sistemi (BEVS), PRMT 1, 2 ve 4 ile 9 arasında birçok PRMT'nin ekspresyon taraması ve üretimi için kullanılmıştır. Etki alanları ve kesilmiş parçaların yanı sıra tam uzunlukta proteinler de dahil olmak üzere bu proteinlerin birden fazla yapılarının ifadesini aynı anda taramak için, 24 ve 96 kuyu plakaları ve blokları ile birlikte ayarlanabilir ve programlanabilir çok kanallı pipetler kullanarak ölçeklenebilir yöntemler uyguladık. Genel olarak, bu yöntem ayarlamaları büyük ölçekli bir bakteri DNA'sı, rekombinant virüsler ve protein ekspresyon taramasının üretilmesini sağladı. Yüksek dolu hacimli Sf9 hücre süspansiyonu ile kültür gemilerinin kullanılması, tek parti büyük ölçekli protein üretimi için üretim boru hattındaki alan sınırlamalarının aşılmasına yardımcı oldu. Burada, biyokimyasal, biyofiziksel ve yapısal çalışmalar için fonksiyonel PRMT'lerin verimli ve uygun maliyetli ekspresyosu için ayrıntılı protokoller açıklıyoruz.

BEVS protokolüne genel bir bakış Şekil 1'de özetlenmiştir. Yapısal Genomik Konsorsiyumu'nda (SGC, Toronto) nispeten yüksek ifade düzeyi7,9olan çözünür ve stabil proteinleri tanımlamak için başarı oranını artırmaya yönelik şirket içi stratejilere göre, tam uzunlukta, etki alanları ve kesilmiş parçalar da dahil olmak üzere PRMT'lerin birden fazla ifade yapısı oluşturulmuştır. İlgilenen okuyucular, SGC'nin bir ifade klonuna dahil edilen gen dizisinin segmenti olarak bir "parça", PFAM açıklamalı yapısal etki alanı olarak "etki alanı" ve bir ifade vektöründe klonlanmış parça olarak "oluşturma" olarak bir "parça" tasarlama tanımlarını ve metodolojisini gözden geçirmeye teşvik edilir, bunların hepsi daha önceki bir yayında ayrıntılı olarakaçıklanmıştır 7. Bu protokolde sunulan PRMT'lerin ifade yapıları, pFastBac1 vektörün bir türevi olan pFBOH-MHL vektörüne klonlanmış poliistidin etiketli proteinlerin üretimi içindir. Şekil 4'te,Sf9 hücrelerinde 4 mL üretimden sonra toplanan peletlerden arındırılmış PRMT1, 2, 4-9'un Etiketli çözünür yapılarının SDS-PAGE analizini sunuyoruz (adım 3.1.4). Tam uzunlukta (FL) PRMT1 ve PRMT9 bu jelde sunulmaz, çünkü FL PRMT1 E. coli'den üretilmiştir ve BEVS'ten üretilen FL PRMT9 Flag-tag6ile saflaştırılmıştır. PRMT1, FL PRMT4 ve tüm PRMT8 yapılarının kesilmiş yapıları nispeten yüksek bir verim gösterir, ancak protein elüatları birlikte saflaştırılmış kirleticilerin fraksiyonlarını içerir. Bu yapılar, saflaştırma protokollerinin daha fazla optimizasyonunu gerektirir. Bu nedenle, bu proteinlerin ölçek büyütme üretimlerinden saflığını artırmak için, inkübasyon aşamasında nikel boncuk miktarının netleştirilmiş bir lisatla azaltılması gibi ek yaklaşımlar gereklidir; yıkama tamponlarındaki iimidazol konsantrasyonlarının artması; TEV proteaz ile His-tag'in bölünmesi, ardından Ni-benzeşim reçinesi üzerine uygulama; ve boyut dışlama ve iyon değişimi kromatografisi gibi ek saflaştırma adımları. PRMT2 yapıları, güçlü bir kirletici bant eşliğinde diğer proteinlere ve tam uzunlukta PRMT2 proteinine kıyasla önemli ölçüde daha düşük verim göstermektedir. Ölçek büyütme üretimi ve IMAC ve boyut dışlama gibi iki saflaştırma adımı, FL proteini için birlikte arındırıcı kirleticinin kalıcı varlığı ile birlikte bu yapı için düşük bir ifade seviyesini doğruladı. Zorunlu bağlama ortağı MEP50 ile üretilen ve saflaştırılmış PRMT5 kompleksi için saf proteinler elde edilmiştir. PRMT9'un kesilmiş yapısı, diğer PRMT'lere kıyasla 1,5 mg/ L'ye yakın neredeyse iki veya üç kat daha düşük ifade seviyesine sahiptir. Bununla birlikte, bu yapının rekombinant viral stokları ölçek büyütme üretimi için kullanılmış, kristalleri dağıtma elde edilmiş ve yapı PRMT4, 6 ve 7 ile birlikte bu protein için çözülmüştür (Şekil 5).
Ölçek büyütme üretimleri için, karşılık gelen P2 virüsleri Sf9 böcek hücrelerinin süspansiyon kültürünü enfekte etmek için kullanıldı. Bu adım, süpernatanttaki enfekte hücreleri ve P3 virüslerini içeren baculovirüs ile enfekte olmuş hücrelerin 50/100/200 mL'sini oluşturur. Büyük ölçekli protein üretimi için, 150 rpm, 27 °C'de 2,8 L Fernbach sallama şişelerinin her birinde 2 L Sf9 hücresi kültürlendi (Şekil 6). Üretim gününde, 2 L Sf9 hücresi (hücre canlılığı >% 97) 2,5 L Tunair sallama şişelerinde veya 5 L reaktif şişelerde 4 L'de 4 x 106/mL hücre yoğunluğuna seyreltildi. Bu hücrelere doğrudan baculovirüs ile enfekte böcek hücrelerinin süspansiyon kültürünün 10-12 mL / L'si ile enfekte edildi ve 145 rpm'de 25 ° C'lik daha düşük bir sıcaklıkta kuluçkaya yatırıldı. Üretim grubunun doğrudan baculovirüs ile enfekte böcek hücrelerinin süspansiyon kültürü ile enfeksiyonu, enfekte hücrelerin ekstra kullanımı hariç olmak üzere virüs hacmi amplifikasyonunda zahmetli ve zaman alıcı adımları önemli ölçüde azalttı ve titer ve virüs bozulmasında azalmayı önledi. SF9 hücre kültürü bakımı ve ölçek büyütme üretimi, tek parti halinde büyük ölçekli bir protein üretimini benimsemek için yüksek dolum hacmine sahip kültür gemilerinde yapılmıştır (Şekil 6).
Baculovirus aracılı üretim platformundan üretilen tam uzunlukta PRMT 4, 5 (MEP50 ile karmaşık), 6, 7 ve 9 protein, SGC6'dakinetik karakterizasyon ve inhibitör bileşik taraması için kullanılmıştır. Kristal yapılar, çeşitli kimyasal problar ve inhibitörlerle PRMT 4, 6, 7 ve 9 proteinlerinin tam uzunlukta veya kesilmiş formları için Protein Veri Bankası'na (PDB) çözüldü ve biriktirildi. Bu PRMT'ler için ifade plazmidleri Addgene plazmid deposuna yatırıldı (Addgene, SGC'nin dağıtım ortağıdır, https://www.addgene.org/) ve araştırma topluluğunun kullanımına açıktır (Şekil 5).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62510/62510fig01.jpg"> Şekil 1: Baculovirüs ekspresyon sürecinin adımlarına şematik genel bakış Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62510/62510fig01large.jpg" target="_blank">lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62510/62510fig02.jpg"> Şekil 2: Baculovirus Enfekte ve enfekte olmayan Sf9 hücreleri. Enfeksiyon belirtileri, hücre çapında% 25-50 artış, genişlemiş hücre çekirdeği, düzgün bir şekilde yuvarlanmış şekil, çoğalma kaybı ve kültür çanağı yüzeyine yapışma ve hücre canlılığında azalma gibi böcek hücrelerindeki yapısal değişikliklerdir. Beyaz ölçek çubuğu 200 μm. Burada sunulan enfeksiyon belirtileri, hem transfeksiyon reaktifleri, Hem JetPrime hem de X-tremeGene 9 kullanılarak transfeksiyon hücreleri için aynıdır. Gösterilen özel örnek JetPrime transfection reaktifi içindir. (A) Kontrol olarak enfekte olmayan Sf9 hücreleri. (B) Baculovirüs ile enfekte Sf9 hücreleri. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62510/62510fig02large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62510/62510fig03.jpg"> Şekil 3: Test ekspresyon proteinlerinin hızlı saflaştırılması için bağlayıcı plaka montajı. Ayrıntılar için lütfen metne bakın, adımlar 3.2.1-2 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62510/62510fig03large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62510/62510fig04.jpg"> Şekil 4: Protein ekspresyon tarama sonuçları. Farklı PRMT'ler ve PRMT5-MEP50 kompleksi için karşılık gelen P1 rekombinant virüsleri ile enfekte Sf9 süspansiyon kültürünün 4 mL'sinde baculovirüs aracılı protein üretiminin protein ekspresyon tarama sonuçları. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62510/62510fig04large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62510/62510fig05.jpg"> Şekil 5: Toronto Yapısal Genomik Konsorsiyumu'nda (SGC) kristal yapı çalışmaları için kullanılan PRMT4, 6, 7 ve 9 için ifade yapılarının özeti. Kristal yapılar, çeşitli kimyasal problar ve inhibitörler ile PRMT 4, 6, 7 ve 9 proteinlerinin tam uzunluğu veya kesilmiş formları için Protein Veri Bankası'na (PDB) çözüldü ve biriktirildi. Bu PRMT'ler için ifade plazmidleri Addgene plazmid deposuna yatırıldı ve araştırma topluluğu tarafından kullanılabilir (Addgene, SGC'nin dağıtım ortağıdır, https://www.addgene.org/). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62510/62510fig05large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62510/62510fig06.jpg"> Şekil 6: Farklı kültür damarlarında Sf9 böcek hücresi bakımı ve protein üretimi: (A) Hücre bakımı ve protein üretimi için 2,8 L Fernbach şişesi. %72'lik dolum hacminin kullanımı, bir sallama platformunda aktarım hızını 2,5 kat artırır. (B) Tunair sallama şişeleri (bu resimde 10 şişeden sadece 9 şişe sunulmaktadır) ve % 80 dolum hacmine sahip reaktif şişeler, sallama platformunun üretim kapasitesini büyük ölçüde arttırır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62510/62510fig06large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Production of Recombinant PRMT Proteins using the Baculovirus Expression Vector System at JoVE.com

Production of Recombinant PRMT Proteins using the Baculovirus Expression Vector System

Baculovirüs ekspresyon vektör sistemi (BEVS), biyokimyasal, biyofiziksel ve yapısal çalışmalarda kullanılacak protein arginin metiltransfenazlarının (PRMT) ekspresyon taraması ve üretimi için sağlam bir platformdur. Milligram miktarda malzeme, ökaryotik bir ifade platformu gerektiren PRMT'lerin ve diğer ilgi proteinlerinin çoğunluğu için üretilebilir.

Baculovirüs Ekspresyon Vektör Sistemi Kullanılarak Rekombinant PRMT Proteinlerinin Üretimi

Protein arginine methyltransferases (PRMTs) methylate arginine residues on a wide variety of proteins that play roles in numerous cellular processes. ...

Bu protokolün genel amacı, S, baculovirus ekspresyon vektör sisteminin kapsama alanında orta destekli, uygun maliyetli modda biyokimyasal, biyofiziksel ve yapısal çalışmalar için proteinin miligram miktarını elde etmek için büyük ölçekli üretimde protein arginin metiltransfezelerinin birden fazla yapının ekspresyon taramasıdır. Dr. Alma Seitova aşağıdaki adımları sunacaktır. Katlanarak büyüyen SF9 hücrelerini serumsuz böcek ortamlarında mil başına 0,4 milyon nihai hücre yoğunluğuna seyreltin ve steril reaktif rezervuarına dökün.Seyreltilmiş SF9 hücrelerinin 24 kuyu plakasının her kuyusuna 0,5 mil tohumlamak için programlanabilir çok kanallı bir pipet kullanın. Bu hacim, kuyunun çalışma yüzeyinin eşit olarak kapsamasını sağlamak için yeterlidir. Aynı zamanda, transfeksiyon karışımını çok fazla seyreltmez, bu da transfeksiyon verimliliği sağlar.Plakanın bir kuyuyu sadece hücre olarak etiketle ve potansiyel enfeksiyon belirtilerini değerlendirmek için transfected ve transfected olmayan hücrenin karşılaştırılması için bir kontrol olarak kullanın. Hücrelerin hücre kültürü plakalarına bağlanmasına izin vermek için plakaları ihtiyaç duyulana kadar 27 derecede, yaklaşık bir saat kuluçkaya yaslayın. İyi karıştırılmış transfeksiyon reaktifini, desteklenmemiş böcek ortamında ve steril bir reaktif rezervuarında seyreltin ve 10 saniye boyunca hafifçe karıştırın.12 kanallı pipet kullanarak, seyreltilmiş işlem reaktifinin 102 mikrolitresini steril bir 96 MicroWell plakasına aktarın. Rekombinant bacmid DNA'sının mikrolitresi başına 0,2 mikrogramlık 10 mikrolitreyi 96 kuyu microWell plakasının ilgili kuyusuna aktarın ve plakayı yanlardan dokunarak hafifçe sallayarak karıştırın. Karmaşık bir oluşum için transfeksiyon karışımını 15 ila 20 dakika kuluçkaya bırakın.96 ve 24 kuyu plakası arasında aktarım için tasarlanmış ayarlanabilir altı kanallı pipet kullanarak, transfeksiyon karışımını transfeksiyon plakalarının karşılık gelen kuyularında damla açısından hücrelere bindirin ve 27 derecede dört saat kuluçkaya yatırın. Transfeksiyon karışımının hücrelerin monolayer üzerinde eşit dağılımını sağlamak için, kuluçka süresi boyunca plakaları birkaç kez hafifçe ileri geri sallayın. Transfeksiyon süresinden dört ila beş saat sonra, 1,5 mil serumsuz böcek ortamı ekleyin.Isı inaktive fetal sığır serumu ve% 1 antibiyotik ve antimycotic% 10 finali ile destekleyin. Hücreleri 27 derecelik bir inkübatörde 72 ila 96 saat kuluçkaya yatır. Mümkün olduğunda transfeksiyon plakalarını günde bir kez hafifçe sallayın.Transfeksiyon sonrası 72 ila 96 saatte transktaklı hücrelerde belirgin enfeksiyon belirtileri arayın. Transfeksiyondan dört ila beş gün sonra, transfeksiyon hücrelerinde ters mikroskop altındaki kontrol hücrelerine kıyasla enfeksiyon belirtileri belirgin olmalı ve hücre kültürü ortamına salgılanan ilk rekombinant baculovirüsler toplanmaya hazır olmalıdır. P1 virüslerinin toplanmasına, 24 kuyu bloğundaki süspansiyon hücrelerinin enfeksiyonunda taze tohumlu SF9 hücrelerinin enfeksiyonuna ve 150 mikrolitre P1 virüslerine izin vermek için programlanabilir bir elektronik çok kanallı kullanın.Toplu P1 viral stoklarının geri kalanını 15 dakika boyunca aşağı çevirin, enfekte SF9 hücrelerinin süspansiyon kültürüne sahip 24 kuyu bloğuna bir AirPore sayfası ile örtün. 24 kuyu bloğunu 27 derecede kuluçkaya yatırın ve 72 ila 96 saat boyunca 245 RPM'de sallanın. Planlanan üretim süresinden dört gün önce, katlanarak büyüyen SF9 hücrelerini, mil başına 2 milyonluk son hücre yoğunluğunda, %1 nihai antibiyotik ve antimycotic içeren serumsuz böcek medyasındaki şaşkınlıklarla Erlenmeyer cam sallama diş ipi olarak ikiye bölün.Bu adım, üretim partisindeki yeni hücrelerin enfeksiyonu için süpernatanttaki enfekte böcek hücrelerinin ve P2 virüslerinin süspansiyon kültürünü üretecektir. İlgili P2 virüslerini ekleyin ve hücre büyümesini yavaşlatmak için enfekte olmuş hücreleri 25 derece daha düşük sıcaklıkta kuluçkaya yatırın, bir inç vuruşla yörüngesel bir çalkalayıcıda 165 RPM'de sallayın. Planlanan üretim zamanından dört gün önce, Tohum iki litre katlanarak büyüyen SF9 hücreleri böcek serumu ücretsiz ortamda mil başına 1 milyon hücre yoğunluğuna, 2.8 litre Fernbach sallama şişesinde.Matarayı 27 derecede 150 RPM'de sallayarak sallayın. Katlanarak büyüyen dört litre SF9 hücresini ve böcek serumu içermeyen ortamı, mil başına 4 milyonluk son hücre yoğunluğuna büyük beş litre reaktif şişelere bölün.Baculovirüs enfekte böcek hücrelerinin süspansiyon kültüründen 10 ila 12 mil ekleyin. SF9 hücrelerinin enfekte kültürünü, 72 ila 96 saat boyunca 25 santigrat derece daha düşük bir sıcaklıkta 145 RPM sallayan bir çalkalayıcıda kuluçkaya yatırın. SF9 hücrelerinde baculovirüs hemen üretiminde PRMT ailesinin ekspresinden elde edilen birkaç rekombinant proteinin miligram miktarları, şekil beşte de görülebileceği gibi biyokimyasal biyofiziksel öğretim çalışmaları için kullanılmaktadır.SGC'de kristal yapılar, çeşitli kimyasal prob ve inhibitörlerle PRMT4, 6, 7 ve 9 proteinlerinin tam uzunluğu veya kesilmiş formları için protein veri bankasına yatırıldı. Bu PRMT'ler için ekspresyon plazmidleri SGC tarafından gen toplama eklemek için biriktirildi ve araştırma topluluğunun kullanımına sunuldu. Bu videoda, baculovirüs ekspresyon sistemindeki büyük ölçekli üretimde protein arginin metiltransfenazlarının çoklu yapılarının başarılı bir şekilde taranması için temel unsurları vurguladık.Düzenli ayarlanabilir ve programlanabilir çok kanallı pipetlerin kullanımı, tüm işlemlerini verimli olmaktan daha hızlı hale getirdi. Hücreler için yüksek performanslı ve daha az hücre toksik kullanımı, rekombinant virüslerin üretimi için transfeksiyon reaktifi daha uygun maliyetli ve bu hücre işleme transfeksiyon protokolüne yol açmıştır. Protein üretimi için büyük ölçekli partinin altı hücrede enfekte olan baculovirüs süspansiyon kültürü ile enfeksiyonu, hayati başlangıç amplifikasyonunda zaman alıcı adımda emekleri önemli ölçüde azalttı.Örneğin, bunu enfekte hücrelerin özel kültürüyle santrifüj etmektir. Bu tabii ki, virüs bozulmasında daha sıkı olmamak için enfekte hücrelerin ekstra kullanımı hariç tabii ki. Süspansiyon kültürü kültür hücre bakımı bu ölçekte kültür gemisinde üretim yüksek alan hacmi, üretim hacminin sınırlandırılmasının üstesinden gelmemize ve büyük ölçekli bir platform benimsememize yardımcı oldu.Bu, biyoreaktörlere erişimi olmayan veya üretim boru hattında sınırlı alana sahip laboratuvarlar için son derece yararlıdır. Her ne kadar protokolümüz protein arginin metiltransfenazes ailesinin proteinleri için tanımlanmış olsa da, biyokimyasal biyofizik öğretim çalışmaları için proteinlerinin yeterli miktarda elde edilmesi için ifade platformu gerektiren diğer protein ailesine de aynı yaklaşım uygulanabilir.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Recombinant Protein Expression, Crystallization, and Biophysical Studies of a Bacillus-conserved Nucleotide Pyrophosphorylase, BcMazG

Recombinant Protein Expression, Crystallization, and Biophysical Studies of a Bacillus-conserved Nucleotide Pyrophosphorylase, BcMazG

Birliğin Rekombinant Protein Ekspresyonu, Kristalleştirilmesi ve Biyofiziksel Araştırmaları<em&gt; Bacillus</em&gt; - Konserve Nükleotid Pyrophosphorylase, BcMazG

To overcome safety restrictions and regulations when studying genes and proteins from true pathogens, their homologues can be studied. Bacillus anthracis ...

Transient Expression in Nicotiana Benthamiana Leaves for Triterpene Production at a Preparative Scale

Transient Expression in Nicotiana Benthamiana Leaves for Triterpene Production at a Preparative Scale

Partiye Hazırlık bir ölçekte triterpen üretim için geçici Nicotiana Benthamiana ifadede bırakır

The triterpenes are one of the largest and most structurally diverse families of plant natural products. Many triterpene derivatives have been shown to ...

Modifying Baculovirus Expression Vectors to Produce Secreted Plant Proteins in Insect Cells

Bitki proteinleri böcek hücrelerinde salgılanan Baculovirus ifade vektörel çizimler oluşturmak için değiştirme

It has been a challenge for scientists to express recombinant secretory eukaryotic proteins for structural and biochemical studies. The ...

Large-scale Production of Recombinant RNAs on a Circular Scaffold Using a Viroid-derived System in Escherichia coli

Large-scale Production of Recombinant RNAs on a Circular Scaffold Using a Viroid-derived System in Escherichia coli

Escherichia coli içinde Viroid kaynaklı bir sistemi kullanarak dairesel bir iskele üzerinde rekombinant RNA'ların büyük ölçekli üretim

With increasing interest in RNA biology and the use of RNA molecules in sophisticated biotechnological applications, the methods to produce large amounts ...

Use of Recombinant Fusion Proteins in a Fluorescent Protease Assay Platform and Their In-gel Renaturation

Rekombinant füzyon protein flüoresan proteaz tahlil Platform ve onların jel Renaturation kullanımı

Proteases are intensively studied enzymes due to their essential roles in several biological pathways of living organisms and in pathogenesis; therefore, ...

Localization of SUMO-modified Proteins Using Fluorescent Sumo-trapping Proteins

Floresan Sumo-bindirme proteinleri kullanarak SUMO-modifiye proteinlerin lokalizasyonu

Here we are presenting a novel method to study the sumoylation of proteins and their sub-cellular localization in mammalian cells and nematode oocytes. ...

Expression, Purification, Crystallization, and Enzyme Assays of Fumarylacetoacetate Hydrolase Domain-Containing Proteins

Fumarylacetoasetat Hydrolase etki alanı Içeren proteinleri ifade, arıtma, kristalizasyon ve enzim Asdimleri

Fumarylacetoacetate hydrolase (FAH) domain-containing proteins (FAHD) are identified members of the FAH superfamily in eukaryotes. Enzymes of this ...

Characterization of Membrane Transporters by Heterologous Expression in E. coli and Production of Membrane Vesicles

Characterization of Membrane Transporters by Heterologous Expression in E. coli and Production of Membrane Vesicles

E. coli'de Heterolog Ekspresyon ile Membran Taşıyıcılarının Karakterizasyonu ve Membran Veziküllerinin Üretimi

Several methods have been developed to functionally characterize novel membrane transporters. Polyamines are ubiquitous in all organisms, but polyamine ...

Transverse Sectioning of Mature Rice (Oryza sativa L.) Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Transverse Sectioning of Mature Rice Oryza sativa L. Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Olgun Pirincin Enine Kesiti (Oryza sativa L.) Hareketsizleştirme Desteği Olarak Pipet İpuçlarını Kullanarak Elektron Mikroskopi Görüntülemesini Taramak için Çekirdekler

Starch granules (SGs) exhibit different morphologies depending on the plant species, especially in the endosperm of the Poaceae family. Endosperm ...

Cell-Free Production of Proteoliposomes for Functional Analysis and Antibody Development Targeting Membrane Proteins

Membran Proteinlerini Hedefleyen Fonksiyonel Analiz ve Antikor Gelişimi için Proteolipozomların Hücresiz Üretimi

Membrane proteins play essential roles in a variety of cellular processes and perform vital functions. Membrane proteins are medically important in drug ...