Name: megakaryocyte culture in 3d methylcellulose-based hydrogel to improve cell maturation and study the impact of stiffness and confinement
Uploaded: 2021-08-26T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Megakaryocyte Culture in 3D Methylcellulose-Based Hydrogel to Improve Cell Maturation and Study the Impact of Stiffness and Confinement at JoVE.com

Forfatterne vil gerne takke Fabien Pertuy og Alicia Aguilar, der oprindeligt udviklede denne teknik i laboratoriet, samt Dominique Collin (Institut Charles Sadron - Strasbourg), der karakteriserede de viskoelastic egenskaber af methylcellulose hydrogel. Dette arbejde blev støttet af ARMESA (Association de Recherche et Développement en Médecine et Santé Publique) og af et ARN-tilskud (ANR-18-CE14-0037 PlatForMechanics). Julie Boscher er modtager af Fondation pour la Recherche Médicale (FRM-tilskudsnummer FDT202012010422).

Alle forsøg bør udføres i overensstemmelse med de institutionelle retningslinjer for pleje og anvendelse af forsøgsdyr. Alle protokoller, der vises i videoen, blev gennemført i nøje overensstemmelse med EU-retten og anbefalingerne fra Etablissement Français du Sangs 'Review Board). En første version af denne protokol blev oprindeligt offentliggjort i 2018 i Metoder i Molekylærbiologi 8.
BEMÆRK: Figur 1 giver et skematisk billede a...

<ol>
	<li>Doolin, M. T., Moriarty, R. A., Stroka, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanosensing+of+Mechanical+Confinement+by+Mesenchymal-Like+Cells.">Mechanosensing of Mechanical Confinement by Mesenchymal-Like Cells.</a> Frontiers in Physiology. 11, (2020).</li><li>Wang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+Stiffness+Modulates+Patient-Derived+Glioblastoma+Cell+Fates+in+Three-Dimensional+Hydrogels.">Matrix Stiffness Modulates Patient-Derived Glioblastoma Cell Fates in Three-Dimensional Hydrogels.</a> Tissue Engineering Part A. , (2020).</li><li>Doyle, A. D., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanosensing+via+cell-matrix+adhesions+in+3D+microenvironments.">Mechanosensing via cell-matrix adhesions in 3D microenvironments.</a> Experimental Cell Research. 343 (1), 60-66 (2016).</li><li>Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+Elasticity+Directs+Stem+Cell+Lineage+Specification.">Matrix Elasticity Directs Stem Cell Lineage Specification.</a> Cell. 126 (4), 677-689 (2006).</li><li>Choi, J. S., Harley, B. A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+combined+influence+of+substrate+elasticity+and+ligand+density+on+the+viability+and+biophysical+properties+of+hematopoietic+stem+and+progenitor+cells.">The combined influence of substrate elasticity and ligand density on the viability and biophysical properties of hematopoietic stem and progenitor cells.</a> Biomaterials. 33 (18), 4460-4468 (2012).</li><li>Shin, J. -. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contractile+forces+sustain+and+polarize+hematopoiesis+from+stem+and+progenitor+cells.">Contractile forces sustain and polarize hematopoiesis from stem and progenitor cells.</a> Cell stem cell. 14 (1), 81-93 (2014).</li><li>Boscher, J., Guinard, I., Eckly, A., Lanza, F., L&#233;on, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood+platelet+formation+at+a+glance.">Blood platelet formation at a glance.</a> Journal of cell science. 133 (20), (2020).</li><li>Aguilar, A., Boscher, J., Pertuy, F., Gachet, C., L&#233;on, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+culture+in+a+methylcellulose-based+hydrogel+to+study+the+impact+of+stiffness+on+megakaryocyte+differentiation.">Three-dimensional culture in a methylcellulose-based hydrogel to study the impact of stiffness on megakaryocyte differentiation.</a> Methods in Molecular Biology. 1812, 139-153 (2018).</li><li>Aguilar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Importance+of+environmental+stiffness+for+megakaryocyte+differentiation+and+proplatelet+formation.">Importance of environmental stiffness for megakaryocyte differentiation and proplatelet formation.</a> Blood. 128, 2022-2032 (2016).</li><li>Hitchcock, I. S., Kaushansky, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thrombopoietin+from+beginning+to+end.">Thrombopoietin from beginning to end.</a> British Journal of Haematology. 165 (2), 259-268 (2014).</li><li>Leiva, O., Leon, C., Kah Ng, S., Mangin, P., Gachet, C., Ravid, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+extracellular+matrix+stiffness+in+megakaryocyte+and+platelet+development+and+function.">The role of extracellular matrix stiffness in megakaryocyte and platelet development and function.</a> American Journal of Hematology. 93 (3), 430-441 (2018).</li><li>Jansen, L. E., Birch, N. P., Schiffman, J. D., Crosby, A. J., Peyton, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanics+of+intact+bone+marrow.">Mechanics of intact bone marrow.</a> Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. 50, 299-307 (2015).</li><li>Eckly, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abnormal+megakaryocyte+morphology+and+proplatelet+formation+in+mice+with+megakaryocyte-restricted+MYH9+inactivation.">Abnormal megakaryocyte morphology and proplatelet formation in mice with megakaryocyte-restricted MYH9 inactivation.</a> Blood. 113 (14), 3182-3189 (2009).</li><li>Eckly, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proplatelet+formation+deficit+and+megakaryocyte+death+contribute+to+thrombocytopenia+in+Myh9+knockout+mice.">Proplatelet formation deficit and megakaryocyte death contribute to thrombocytopenia in Myh9 knockout mice.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. 8 (10), 2243-2251 (2010).</li></ol>

I det foregående årti har mekanobiologi rejst mere og mere interesse for mange områder af biologi. Det er nu almindeligt anerkendt, at det mekaniske miljø omkring cellerne spiller en rolle i deres adfærd, understreger vigtigheden af at studere, hvordan megakaryocytter forstand og reagere på ekstracellulære mekaniske signaler. Det er udfordrende præcist at måle stivheden af knoglemarvsvævet in situ11, især hvis vi betragter den hæmatopoietiske røde marv, da den er placeret ind...

Celler i kroppen oplever et komplekst 3D-mikromiljø og udsættes for samspillet mellem kemiske og mekanofysiske signaler, herunder stivhed fra væv og indespærring på grund af tilstødende celler og omgivende matrix 1,2,3. Betydningen af stivhed og indespærring for celle adfærd er kun blevet anerkendt i de sidste årtier. I 2006 fremhævede det skelsættende værk fra Engler et al. 4 betydningen af det mekaniske miljø for celledifferentiering. Forfatterne viste, at variation i cellesubstrat stivhed resulterede i orientering af stamceller mod forskellige differentiering slægter. Siden da er virkningen af mekaniske signaler på celle skæbne og adfærd blevet mere og mere anerkendt og studeret. På trods af at det er et af organismens blødeste væv, har knoglemarven en 3D strukturel organisation, der er indespærret inde i knoglen. Marv stivhed, selv om teknisk vanskeligt at måle præcist, skønnes at ligge mellem 15 og 300 Pa 5,6. Inden for stroma, celler er tæt begrænset til hinanden. Derudover migrerer de fleste af dem mod bihulekarrene for at komme ind i blodcirkulationen. Disse betingelser skaber yderligere mekaniske begrænsninger på tilstødende celler, som skal tilpasse sig disse kræfter. Mekaniske signaler repræsenterer et vigtigt parameter, hvis konsekvenser for megakaryocyt differentiering og proplatelet dannelse er for nylig blevet undersøgt. Selvom megakaryocytter kan differentiere in vitro i traditionel flydende kultur, når de ikke den grad af modning observeret in vivo, til dels på grund af fraværet af de mekaniske signaler fra 3D-miljøet 7. Voksende forfædre indlejret i hydrogel bringer 3D mekaniske signaler, der mangler i flydende miljø.
Hydrogels har været meget udbredt i flere årtier i det hæmatologiske område, især at dyrke celler i koloni danner assays at kvantificere hæmatopoietic forfædre. Sådanne hydrogeler er imidlertid sjældent blevet brugt til at udforske de biologiske virkninger af det 3D mekaniske miljø på modning og differentiering af hæmatoopoietiske celler. I løbet af de sidste par år har vores laboratorium udviklet en 3D-kulturmodel ved hjælp af en methylcellulosebaseret hydrogel 8. Denne ikke-aktive fysiske gel er et nyttigt værktøj til at efterligne de fysiske begrænsninger i det indfødte megakaryocytmiljø. Den er afledt af cellulose ved udskiftning af hydroxylrester (-OH) med methoxidgrupper (-OCH3). Både graden af methylsubstitution og methylcellulosekoncentrationen bestemmer hydrogelstivheden, når den har jellified. Under udviklingsfasen af denne teknik blev det påvist, at en Youngs modulus i intervallet 30 til 60 Pa er den optimale gelstivhed til megakaryocytvækst 9.
Følgende protokol beskriver en metode til at dyrke mus megakaryocytiske forfædre i en 3D methylcellulose hydrogel. Det har tidligere vist sig, at sammenlignet med standard flydende kultur øger denne hydrogelkultur graden af megakaryocyt polyploidisering, forbedrer modningen og intracellulær organisation og øger megakaryocytternes kapacitet til at udvide proplatelets, når de er suspenderet igen i et flydende medium 9. Dette manuskript beskriver i detaljer protokollen for isolering af musebenmarv Lin- celler og deres indlejring i en methylcellulose hydrogel til 3D-kultur samt kvantificeringen af deres evne til at producere proplatelets og inddrivelse af cellerne til yderligere analyser.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>18-gauge needles</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1001735825</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>21-gauge needles</td>
			<td>BD Microlance</td>
			<td>301155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>23-gauge needles</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>AN*2332R1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25-gauge neeldes</td>
			<td>BD Microlance</td>
			<td>300400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-well culture dishes</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>144444</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL syringes</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>SS+05S1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytoclips</td>
			<td>Microm Microtech</td>
			<td>F/CLIPSH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytofunnels equiped with filter cards</td>
			<td>Microm Microtech</td>
			<td>F/JC304</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytospin centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Cytospin 4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dakopen</td>
			<td>Dako</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM 1x</td>
			<td>Gibco, Life Technologies</td>
			<td>41 966-029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>14190-094</td>
			<td>Sterile Dulbecco&#8217;s phosphate-buffered saline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasySep magnets</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>18000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasySep Mouse Hematopoietic Progenitor Cell isolation Kit</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>19856A</td>
			<td>biotinylated antibodies (CD5,CD11b, CD19, CD45R/B220, Ly6G/C(Gr-1), TER119,7&#8211;4) and streptavidin-coated magnetic beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15575-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Healthcare Life Science</td>
			<td>SH30071.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer lock 1 mL syringes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z551546-100EA</td>
			<td>or 309628 syringes from BD MEDICAL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer lock syringes connectors</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11891120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MC 3%</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>HSC001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polylysin coated slides</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>J2800AMNZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PSG 100x</td>
			<td>Gibco, Life Technologies</td>
			<td>1037-016</td>
			<td>10,000 units/mL penicillin, 10,000 &#956;g/mL streptomycin and 29.2 mg/mL glutamine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat serum</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>13551</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant hirudin</td>
			<td>Transg&#232;ne</td>
			<td>rHV2-Lys47</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human trombopoietin (rhTPO)</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>2822</td>
			<td>10,000 units/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round bottomed 10 mL plastique tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round bottomed 5 mL polystyrene tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

megakaryocyte culture in 3d methylcellulose-based hydrogel to improve cell maturation and study the impact of stiffness and confinement

3D-miljøet, der fører til både indespærring og mekaniske begrænsninger, anerkendes i stigende grad som en vigtig faktor for celleadfærd. 3D-kulturen er således blevet udviklet for bedre at kunne nærme sig in vivo-situationen. Megakaryocytter skelner fra hæmatoopoietiske stamceller og stamfaderceller (HSPCs) i knoglemarven (BM). BM er en af de blødeste væv i kroppen, indespærret inde i knoglen. Knoglen er dårligt udvides på celleskalaen, megakaryocytter er samtidig udsat for en svag stivhed og høj indespærring. Denne protokol præsenterer en metode til inddrivelse af museperage negative (Lin-) HSPCs ved immunmagnetisk sortering og deres differentiering i modne megakaryocytter i et 3D-medium bestående af methylcellulose. Methylcellulose er ikke reaktivt over for megakaryocytter, og dens stivhed kan justeres til den normale knoglemarv eller øges for at efterligne en patologisk fibrotisk marv. Processen med at gendanne megakaryocytterne til yderligere celleanalyser er også beskrevet i protokollen. Selvom proplateletforlængelse forhindres i 3D-miljøet, er det beskrevet nedenfor, hvordan man genanvender megakaryocytterne i flydende medium og kvantificerer deres evne til at udvide proplatelets. Megakaryocytter dyrket i 3D hydrogel har en højere kapacitet til at danne proplatelets sammenlignet med dem, der dyrkes i et flydende miljø. Denne 3D-kultur gør det muligt i) at differentiere forfædre mod megakaryocytter nå en højere modning tilstand, ii) at generobre fænotyper, der kan observeres in vivo, men gå ubemærket hen i klassiske flydende kulturer, og iii) at studere transduktion veje induceret af de mekaniske signaler, som en 3D-miljø.

Data, der er opnået ved hjælp af denne protokol, blev oprindeligt offentliggjort i Blood i 20169.
Ifølge protokollen blev cellerne sået i enten flydende eller methylcellulose hydrogel medium. Celler i flydende medium har alle sedimenteret i bunden af brønden, i kontakt med den stive plastoverflade og engang med andre celler. I modsætning hertil fordeles celler indlejret i methylcellulose hydrogel homogent i gelen og isoleres fra naboceller (Fi...

Watch this Scientific Journal Video about Megakaryocyte Culture in 3D Methylcellulose-Based Hydrogel to Improve Cell Maturation and Study the Impact of Stiffness and Confinement at JoVE.com

Megakaryocyte Culture in 3D Methylcellulose-Based Hydrogel to Improve Cell Maturation and Study the Impact of Stiffness and Confinement

Det er nu anerkendt, at de tre-dimensionelle miljø af celler kan spille en vigtig rolle i deres adfærd, modning og / eller differentiering. Denne protokol beskriver en tredimensionel cellekulturmodel designet til at studere virkningen af fysisk indeslutning og mekaniske begrænsninger på megakaryocytter.

Megakaryocyt Kultur i 3D Methylcellulose-baserede Hydrogel at forbedre cellemodning og studere virkningen af stivhed og indespærring

The 3D environment leading to both confinement and mechanical constraints is increasingly recognized as an important determinant of cell behavior. 3D ...

Denne protokol giver mulighed for in vitro evaluering af virkningen af indespærring og medium stivhed, som indfødte megakaryocytter udsættes for i knoglemarven på deres adfærd og modning. Den største fordel ved denne teknik er en forenklet model, der eliminerer cellecelle- og cellematrixinteraktioner og fokuserer på de mekaniske aspekter. God laboratoriepraksis og sterile arbejdsvilkår skal overholdes nøje.Faktisk kan selv en lille forurening af hydrogelen have en dramatisk indvirkning på megakaryocyt differentiering. For at opnå en enkelt brønd af hydrogel celle kultur, begynde med optøning to en milliliter aliquots af 3% methylcellulose ved stuetemperatur, derefter pels en en milliliter Luer låsesprøjte med methylcellulose ved først at trække en milliliter og derefter udvise det hele. Dernæst ved hjælp af den samme sprøjte og nål, trække 333 mikroliter af methylcellulose fra en frisk aliquot.Når nålen forsigtigt er fjernet, skal du bruge steriliserede sammenkæbere til at skrue et Luer-låsestik på enden af sprøjten, og fastgør derefter en anden ikke-belagt en milliliter Luer-låsesprøjte til stikket. Fordel ligeledes methylcellulose mellem de to sprøjter og sæt dem til side. Dernæst genbruge den tidligere isolerede muse afstamning negative hæmatoopoietic stamceller og stamfader celler i den koncentrerede kultur medium ved en tæthed på en gange 10 til de seks celler pr 167 mikroliters.Afbryd en af sprøjterne fra stikket, og pipetten 167 mikroliter af celleaffjedringen er direkte i stikket, samtidig med at sprøjtestemplet trækkes langsomt for at gøre plads til celleaffjedringen. Når du har tilføjet al celleaffjedringen i stikket, skal du trække stemplet yderligere for at trække affjedringen tilbage fra stikket og forsigtigt tilslutte den anden sprøjte, idet du sørger for ikke at miste nogen suspension i skruetråden. For at homogenisere methylcellulosemediet med celleaffjedringen skal stemplet langsomt flyttes frem og tilbage mellem de to sprøjter 10 gange, derefter trække det samlede volumen i en sprøjte og afbryde de to sprøjter, så stikket efterlades på det tomme.Tøm indholdet af sprøjten i en brønd af en fire-brønds plade og inkuber pladen ved 37 grader under 5% kuldioxid. For at analysere proplatelets, på dag tre af kultur, omhyggeligt overføre alle celler fra en brønd i en 15 milliliter rør, der indeholder 10 milliliter AF DMEM med 1% PSG. Resuspend cellerne ved forsigtigt pipettering at fortynde methylcellulose helt, derefter centrifugere røret i fem minutter ved 300 gange G ved stuetemperatur.Efter at have kasseret supernatanten skal cellepillen genbruges i en milliliter komplet kulturmedium og re-frø cellerne ved 500 mikroliter pr. brønd af en fire-brønds plade. Inkuber pladen ved 37 grader Celsius under 5% kuldioxid. Den følgende dag, ved hjælp af en Brightfield mikroskop med en 20X mål, tilfældigt erhverve 10 billeder pr godt, og sørg for ikke at have for mange celler i synsfeltet og indfange mindst fem megakaryocytter per felt.Ved hjælp af ImageJ tælle det samlede antal megakaryocytter og dem, der udvider proplatelets i hvert billede til at beregne andelen af megakaryocytter udvide proplatelets. For at fastgøre cellerne til fremtidige analyser skal du tilføje den fiksative opløsning oven på methylcellulose uden at forstyrre gelen. Efter at have ventet på et passende tidspunkt afhængigt af det anvendte fiksativ, skal du bruge en P1000 pipette til forsigtigt at pipette fiksativ og gel, indtil methylcellulose er blevet homogent fortyndet.Og ved hjælp af den samme pipettespids overføres alt indholdet af brønden til et 15 milliliterrør, der indeholder 10 milliliter DPBS og homogeniseres ved blanding. Centrifuge blandingen. Kassér supernatanten og genbrug megakaryocyt pellet i et medium, der passer til den ønskede analyse.På kulturdag tre har megakaryocytter i det flydende medium sedimenteret i bunden af brønden og er i kontakt med den stive plastoverflade såvel som andre celler. I modsætning hertil er celler indlejret i methylcellulose hydrogel homogent fordelt og isoleret fra tilstødende celler. En analyse af megakaryocytternes gennemsnitlige diameter under forskellige kulturforhold viser, at 2% methylcellulose øger den gennemsnitlige megakaryocytdiameter en smule sammenlignet med væskekulturen.Men at øge methylcellulosekoncentrationen med 0,5% forringer megakaryocyt differentiering som angivet med en mindre middeldiameter. I repræsentative transmission elektronmikroskopi billeder, de intracytoplasmaiske membraner i megakaryocytter differentieret in vivo i knoglemarven synes at være tæt imod med afgrænsede cytoplasmaiske territorier. I flydende kultur har membranerne for det meste et lille rundt ovalt udseende eller aflange vesikler uden afgrænsning af cytoplasmaiske territorier.I modsætning hertil har 2%methylcellulosekulturen nøje modsat membraner med afgrænsende cytoplasmaiske territorier, der ligner in situ-strukturen. Ved dag fire af kultur, megakaryocytter tidligere dyrkes i hydrogel viser øget proplatelet dannelse i forhold til dem, der dyrkes i flydende medium. Den gennemsnitlige andel af megakaryocyt udvide proplatelets er normalt omkring 15 til 20% med en flydende præ-kultur i forhold til 35 til 40% med en methylcellulose hydrogel prækultur.Når du forsøger denne procedure, er det vigtigt at pipette de relevante mængder meget præcist som en mindre ændring i den endelige methylcellulose koncentration kan væsentligt ændre mediernes stivhed. Efter cellemodning i hydrogel kan megakaryocytter genvindes til ploidi- og cellemarkøranalyse ved flowcytometri eller fastgjort til elektronmikroskopi eller immunstaining af protein af interesse.

Research

JoVE Journal

Biology

Testing Visual Sensitivity to the Speed and Direction of Motion in Lizards

Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of ...

Endothelial Cell Co-culture Mediates Maturation of Human Embryonic Stem Cell to Pancreatic Insulin Producing Cells in a Directed Differentiation Approach

Endotel Cell Co-kultur formidler Modning af humane embryonale stamceller til pancreas-insulin-producerende celler i en rettet Differentiering Approach

Embryonic stem cells (ESC) have two main characteristics: they can be indefinitely propagated in vitro in an undifferentiated state and they are ...

Do-It-Yourself Device for Recovery of Cryopreserved Samples Accidentally Dropped into Cryogenic Storage Tanks

Gør-det-selv enhed for inddrivelse af Kryopræserverede Prøver uheld faldt i Kryogene lagertanke

Liquid nitrogen is colorless, odorless, extremely cold (-196 &deg;C) liquid kept under pressure. It is commonly used as a cryogenic fluid for long term ...

An Ex vivo Culture System to Study Thyroid Development

An Ex vivo Culture System to Study Thyroid Development

En<em&gt; Ex vivo</em&gt; Kultur System til Studieinformationen Thyroid Development

The thyroid is a bilobated endocrine gland localized at the base of the neck, producing the thyroid hormones T3, T4, and calcitonin. T3 and T4 are ...

Sequential Application of Glass Coverslips to Assess the Compressive Stiffness of the Mouse Lens: Strain and Morphometric Analyses

Sekventiel Anvendelse af dækglas at Vurdere Trykstyrke Stivhed af Mouse Linse: Strain og morfometrisk Analyser

The eye lens is a transparent organ that refracts and focuses light to form a clear image on the retina. In humans, ciliary muscles contract to deform the ...

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

Måling stivheden af<em&gt; Ex vivo</em&gt; Mus Aortas Brug Atomic force mikroskopi

Arterial stiffening is a significant risk factor and biomarker for cardiovascular disease and a hallmark of aging. Atomic force microscopy (AFM) is a ...

Isolation and 3D Collagen Sandwich Culture of Primary Mouse Hepatocytes to Study the Role of Cytoskeleton in Bile Canalicular Formation In Vitro

Isolation og 3D kollagen sandwich kultur af primære mus hepatocytter at studere rollen af cytoskelet i galde Canalicular dannelse in vitro

Hepatocytes are the central cells of the liver responsible for its metabolic function. As such, they form a uniquely polarized epithelium, in which two or ...

An Adipocyte Cell Culture Model to Study the Impact of Protein and Micro-RNA Modulation on Adipocyte Function

En adipocytcellekulturmodel til undersøgelse af protein- og mikro-RNA-gradueringens indvirkning på adipocytfunktionen

Alteration of adipocyte function contributes to the pathogenesis of metabolic diseases including Type 2 diabetes and insulin resistance. This highlights ...

Large-Scale Preparation of Synovial Fluid Mesenchymal Stem Cell-Derived Exosomes by 3D Bioreactor Culture

Storskala forberedelse af synovialvæske mesenkymale stamcelleafledte exosomer ved 3D bioreaktorkultur

Exosomes secreted by mesenchymal stem cells (MSCs) have been suggested as promising candidates for cartilage injuries and osteoarthritis treatment. ...