Name: megakaryocyte culture in 3d methylcellulose-based hydrogel to improve cell maturation and study the impact of stiffness and confinement
Uploaded: 2021-08-26T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Megakaryocyte Culture in 3D Methylcellulose-Based Hydrogel to Improve Cell Maturation and Study the Impact of Stiffness and Confinement at JoVE.com

De auteurs willen Fabien Pertuy en Alicia Aguilar bedanken die deze techniek aanvankelijk in het laboratorium ontwikkelden, evenals Dominique Collin (Institut Charles Sadron - Strasbourg) die de visco-elastische eigenschappen van de methylcellulosehydrogel karakteriseerde. Dit werk werd ondersteund door ARMESA (Association de Recherche et Développement en Médecine et Santé Publique) en door een ARN-subsidie (ANR-18-CE14-0037 PlatForMechanics). Julie Boscher is een ontvanger van de Fondation pour la Recherche Médicale (FRM-subsidienummer FDT202012010422).

Alle experimenten moeten worden uitgevoerd in overeenstemming met de institutionele richtlijnen voor de verzorging en het gebruik van proefdieren. Alle protocollen die in de video worden getoond, zijn uitgevoerd in strikte overeenstemming met de Europese wetgeving en de aanbevelingen van de Review Board van het Etablissement Français du Sang (EFS). Een eerste versie van dit protocol werd oorspronkelijk gepubliceerd in 2018 in Methods in Molecular Biology 8.
OPMERKING: ...

<ol>
	<li>Doolin, M. T., Moriarty, R. A., Stroka, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanosensing+of+Mechanical+Confinement+by+Mesenchymal-Like+Cells.">Mechanosensing of Mechanical Confinement by Mesenchymal-Like Cells.</a> Frontiers in Physiology. 11, (2020).</li><li>Wang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+Stiffness+Modulates+Patient-Derived+Glioblastoma+Cell+Fates+in+Three-Dimensional+Hydrogels.">Matrix Stiffness Modulates Patient-Derived Glioblastoma Cell Fates in Three-Dimensional Hydrogels.</a> Tissue Engineering Part A. , (2020).</li><li>Doyle, A. D., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanosensing+via+cell-matrix+adhesions+in+3D+microenvironments.">Mechanosensing via cell-matrix adhesions in 3D microenvironments.</a> Experimental Cell Research. 343 (1), 60-66 (2016).</li><li>Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+Elasticity+Directs+Stem+Cell+Lineage+Specification.">Matrix Elasticity Directs Stem Cell Lineage Specification.</a> Cell. 126 (4), 677-689 (2006).</li><li>Choi, J. S., Harley, B. A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+combined+influence+of+substrate+elasticity+and+ligand+density+on+the+viability+and+biophysical+properties+of+hematopoietic+stem+and+progenitor+cells.">The combined influence of substrate elasticity and ligand density on the viability and biophysical properties of hematopoietic stem and progenitor cells.</a> Biomaterials. 33 (18), 4460-4468 (2012).</li><li>Shin, J. -. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contractile+forces+sustain+and+polarize+hematopoiesis+from+stem+and+progenitor+cells.">Contractile forces sustain and polarize hematopoiesis from stem and progenitor cells.</a> Cell stem cell. 14 (1), 81-93 (2014).</li><li>Boscher, J., Guinard, I., Eckly, A., Lanza, F., L&#233;on, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood+platelet+formation+at+a+glance.">Blood platelet formation at a glance.</a> Journal of cell science. 133 (20), (2020).</li><li>Aguilar, A., Boscher, J., Pertuy, F., Gachet, C., L&#233;on, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+culture+in+a+methylcellulose-based+hydrogel+to+study+the+impact+of+stiffness+on+megakaryocyte+differentiation.">Three-dimensional culture in a methylcellulose-based hydrogel to study the impact of stiffness on megakaryocyte differentiation.</a> Methods in Molecular Biology. 1812, 139-153 (2018).</li><li>Aguilar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Importance+of+environmental+stiffness+for+megakaryocyte+differentiation+and+proplatelet+formation.">Importance of environmental stiffness for megakaryocyte differentiation and proplatelet formation.</a> Blood. 128, 2022-2032 (2016).</li><li>Hitchcock, I. S., Kaushansky, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thrombopoietin+from+beginning+to+end.">Thrombopoietin from beginning to end.</a> British Journal of Haematology. 165 (2), 259-268 (2014).</li><li>Leiva, O., Leon, C., Kah Ng, S., Mangin, P., Gachet, C., Ravid, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+extracellular+matrix+stiffness+in+megakaryocyte+and+platelet+development+and+function.">The role of extracellular matrix stiffness in megakaryocyte and platelet development and function.</a> American Journal of Hematology. 93 (3), 430-441 (2018).</li><li>Jansen, L. E., Birch, N. P., Schiffman, J. D., Crosby, A. J., Peyton, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanics+of+intact+bone+marrow.">Mechanics of intact bone marrow.</a> Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. 50, 299-307 (2015).</li><li>Eckly, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abnormal+megakaryocyte+morphology+and+proplatelet+formation+in+mice+with+megakaryocyte-restricted+MYH9+inactivation.">Abnormal megakaryocyte morphology and proplatelet formation in mice with megakaryocyte-restricted MYH9 inactivation.</a> Blood. 113 (14), 3182-3189 (2009).</li><li>Eckly, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proplatelet+formation+deficit+and+megakaryocyte+death+contribute+to+thrombocytopenia+in+Myh9+knockout+mice.">Proplatelet formation deficit and megakaryocyte death contribute to thrombocytopenia in Myh9 knockout mice.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. 8 (10), 2243-2251 (2010).</li></ol>

In het afgelopen decennium heeft mechanobiologie steeds meer belangstelling gewekt voor veel gebieden van de biologie. Het wordt nu algemeen erkend dat de mechanische omgeving rond de cellen een rol speelt in hun gedrag, met de nadruk op het belang om te bestuderen hoe megakaryocyten voelen en reageren op extracellulaire mechanische signalen. Het is een uitdaging om de stijfheid van het beenmergweefsel in situnauwkeurig te meten11, vooral als we het hematopoëtische rode merg beschouwen, ...

Cellen in het lichaam ervaren een complexe 3D-micro-omgeving en worden onderworpen aan het samenspel tussen chemische en mechanofysische signalen, waaronder stijfheid van het weefsel en opsluiting als gevolg van naburige cellen en omringende matrix 1,2,3. Het belang van stijfheid en opsluiting voor celgedrag is pas de laatste decennia erkend. In 2006 benadrukte het baanbrekende werk van Engler et al. 4 het belang van de mechanische omgeving voor celdifferentiatie. De auteurs toonden aan dat variatie in celsubstraatstijfheid resulteerde in de oriëntatie van stamcellen op verschillende differentiatielijnen. Sindsdien is de impact van mechanische signalen op het lot en gedrag van cellen steeds meer erkend en bestudeerd. Ondanks dat het een van de zachtste weefsels van het organisme is, heeft het beenmerg een 3D-structurele organisatie die is opgesloten in het bot. De mergstijfheid, hoewel technisch moeilijk precies te meten, wordt geschat tussen 15 en 300 Pa 5,6. In het stroma zijn cellen strak aan elkaar gekluisterd. Bovendien migreren de meesten van hen naar de sinusoïde bloedvaten om de bloedcirculatie binnen te komen. Deze omstandigheden creëren extra mechanische beperkingen op aangrenzende cellen, die zich aan deze krachten moeten aanpassen. Mechanische signalen vertegenwoordigen een belangrijke parameter waarvan de gevolgen voor megakaryocytendifferentiatie en proplateletvorming onlangs zijn onderzocht. Hoewel megakaryocyten in vitro kunnen differentiëren in traditionele vloeibare cultuur, bereiken ze niet de mate van rijping die in vivowordt waargenomen , deels vanwege de afwezigheid van de mechanische signalen uit de 3D-omgeving 7. Groeiende voorlopers ingebed in hydrogel brengt 3D mechanische signalen die ontbreken in een vloeibaar milieu.
Hydrogels worden al tientallen jaren op grote schaal gebruikt op hematologisch gebied, met name om cellen te laten groeien in kolonievormende assays om hematopoëtische voorlopers te kwantificeren. Dergelijke hydrogels zijn echter zelden gebruikt om de biologische impact van de 3D-mechanische omgeving op rijping en differentiatie van hematopoëtische cellen te onderzoeken. In de afgelopen jaren heeft ons laboratorium een 3D-kweekmodel ontwikkeld met behulp van een op methylcellulose gebaseerde hydrogel 8. Deze niet-reactieve fysieke gel is een nuttig hulpmiddel om de fysieke beperkingen van de inheemse megakaryocytenomgeving na te bootsen. Het wordt afgeleid van cellulose door vervanging van hydroxylresiduen (-OH) door methoxidegroepen (-OCH3). Zowel de mate van methylsubstitutie als de methylcelluloseconcentratie bepalen de hydrogelstijfheid zodra deze is vereld. Tijdens de ontwikkelingsfase van deze techniek werd aangetoond dat een Young's modulus in het bereik van 30 tot 60 Pa de optimale gelstijfheid is voor megakaryocytengroei 9.
Het volgende protocol beschrijft een methode om megakaryocytische voorlopercellen van muizen te laten groeien in een 3D-methylcellulosehydrogel. Het is eerder aangetoond dat in vergelijking met standaard vloeibare cultuur, deze hydrogelcultuur de mate van polyploïdisatie van megakaryocyten verhoogt, de rijping en intracellulaire organisatie verbetert en de capaciteit van megakaryocyten verhoogt om proplatelets uit te breiden zodra ze zijn geresuspendeerd in een vloeibaar medium 9. Dit manuscript beschrijft in detail het protocol voor de isolatie van beenmerg Lin−-cellen van muizen en hun inbedding in een methylcellulosehydrogel voor 3D-cultuur, evenals de kwantificering van hun vermogen om proplatelets te produceren en het herstel van de cellen voor verdere analyses.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>18-gauge needles</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1001735825</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>21-gauge needles</td>
			<td>BD Microlance</td>
			<td>301155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>23-gauge needles</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>AN*2332R1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25-gauge neeldes</td>
			<td>BD Microlance</td>
			<td>300400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-well culture dishes</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>144444</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL syringes</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>SS+05S1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytoclips</td>
			<td>Microm Microtech</td>
			<td>F/CLIPSH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytofunnels equiped with filter cards</td>
			<td>Microm Microtech</td>
			<td>F/JC304</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytospin centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Cytospin 4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dakopen</td>
			<td>Dako</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM 1x</td>
			<td>Gibco, Life Technologies</td>
			<td>41 966-029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>14190-094</td>
			<td>Sterile Dulbecco&#8217;s phosphate-buffered saline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasySep magnets</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>18000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasySep Mouse Hematopoietic Progenitor Cell isolation Kit</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>19856A</td>
			<td>biotinylated antibodies (CD5,CD11b, CD19, CD45R/B220, Ly6G/C(Gr-1), TER119,7&#8211;4) and streptavidin-coated magnetic beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15575-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Healthcare Life Science</td>
			<td>SH30071.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer lock 1 mL syringes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z551546-100EA</td>
			<td>or 309628 syringes from BD MEDICAL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer lock syringes connectors</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11891120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MC 3%</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>HSC001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polylysin coated slides</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>J2800AMNZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PSG 100x</td>
			<td>Gibco, Life Technologies</td>
			<td>1037-016</td>
			<td>10,000 units/mL penicillin, 10,000 &#956;g/mL streptomycin and 29.2 mg/mL glutamine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat serum</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>13551</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant hirudin</td>
			<td>Transg&#232;ne</td>
			<td>rHV2-Lys47</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human trombopoietin (rhTPO)</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>2822</td>
			<td>10,000 units/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round bottomed 10 mL plastique tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round bottomed 5 mL polystyrene tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

megakaryocyte culture in 3d methylcellulose-based hydrogel to improve cell maturation and study the impact of stiffness and confinement

De 3D-omgeving die leidt tot zowel opsluiting als mechanische beperkingen wordt steeds meer erkend als een belangrijke determinant van celgedrag. Zo is 3D-cultuur ontwikkeld om de in vivo situatie beter te benaderen. Megakaryocyten onderscheiden zich van hematopoëtische stam- en voorlopercellen (HSPC's) in het beenmerg (BM). De BM is een van de zachtste weefsels van het lichaam, opgesloten in het bot. Omdat het bot slecht uitrekbaar is op celschaal, worden megakaryocyten tegelijkertijd onderworpen aan een zwakke stijfheid en hoge opsluiting. Dit protocol presenteert een methode voor het herstel van muizenlijnnegatieve (Lin-) HSPC's door immunomagnetische sortering en hun differentiatie in volwassen megakaryocyten in een 3D-medium bestaande uit methylcellulose. Methylcellulose is niet-reactief ten opzichte van megakaryocyten en de stijfheid ervan kan worden aangepast aan die van normaal beenmerg of worden verhoogd om een pathologisch fibrotisch merg na te bootsen. Het proces om de megakaryocyten te herstellen voor verdere celanalyses wordt ook gedetailleerd beschreven in het protocol. Hoewel proplateletuitbreiding wordt voorkomen binnen het 3D-milieu, wordt hieronder beschreven hoe de megakaryocyten in vloeibaar medium kunnen worden geresuspendeerd en hun vermogen om proplatelets uit te breiden te kwantificeren. Megakaryocyten gekweekt in 3D-hydrogel hebben een hogere capaciteit om proplatelets te vormen in vergelijking met die gekweekt in een vloeibaar milieu. Deze 3D-cultuur maakt het mogelijk om i) voorlopers te differentiëren naar megakaryocyten die een hogere rijpingstoestand bereiken, ii) om fenotypen te recapileren die in vivo kunnen worden waargenomen maar onopgemerkt blijven in klassieke vloeibare culturen, en iii) om transductieroutes te bestuderen die worden geïnduceerd door de mechanische signalen die door een 3D-omgeving worden geleverd.

Gegevens verkregen met behulp van dit protocol werden oorspronkelijk gepubliceerd in Blood in 20169.
Volgens het protocol werden de cellen gezaaid in vloeibaar of methylcellulose hydrogel medium. Cellen in vloeibaar medium zijn allemaal bezinkseld op de bodem van de put, in contact met het stijve plastic oppervlak en soms met andere cellen. Cellen ingebed in methylcellulosehydrogel worden daarentegen homogeen verdeeld in de gel en geïsoleerd uit naburige cellen (<stron...

Watch this Scientific Journal Video about Megakaryocyte Culture in 3D Methylcellulose-Based Hydrogel to Improve Cell Maturation and Study the Impact of Stiffness and Confinement at JoVE.com

Megakaryocyte Culture in 3D Methylcellulose-Based Hydrogel to Improve Cell Maturation and Study the Impact of Stiffness and Confinement

Inmiddels wordt erkend dat de driedimensionale omgeving van cellen een belangrijke rol kan spelen in hun gedrag, rijping en/of differentiatie. Dit protocol beschrijft een driedimensionaal celkweekmodel dat is ontworpen om de impact van fysieke insluiting en mechanische beperkingen op megakaryocyten te bestuderen.

Megakaryocytencultuur in 3D-hydrogel op basis van methylcellulose om de celrijping te verbeteren en de impact van stijfheid en opsluiting te bestuderen

The 3D environment leading to both confinement and mechanical constraints is increasingly recognized as an important determinant of cell behavior. 3D ...

Dit protocol maakt in vitro evaluatie mogelijk van de impact van opsluiting en medium stijfheid waaraan inheemse megakaryocyten worden blootgesteld in het beenmerg op hun gedrag en rijping. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is een vereenvoudigd model dat cel-cel- en celmatrixinteracties elimineert en zich richt op de mechanische aspecten. Goede laboratoriumpraktijken en steriele arbeidsomstandigheden moeten strikt in acht worden genomen.Inderdaad, zelfs een lichte besmetting van de hydrogel kan een dramatische impact hebben op de differentiatie van megakaryocyten. Om een enkele bron van hydrogelcelkweek te verkrijgen, begint u met het ontdooien van twee aliquots van één milliliter van 3% methylcellulose bij kamertemperatuur en bedekt u vervolgens een Luer-slotspuit van één milliliter met de methylcellulose door eerst één milliliter te trekken en vervolgens alles te verdrijven. Trek vervolgens met dezelfde spuit en naald 333 microliter methylcellulose uit een verse aliquot.Nadat u de naald zorgvuldig hebt verwijderd, gebruikt u een gesteriliseerde tang om een Luer-slotconnector op het uiteinde van de spuit te schroeven en bevestigt u vervolgens een tweede niet-gecoate Luer-slotspuit van één milliliter aan de connector. Verdeel de methylcellulose gelijkmatig over de twee spuiten en zet ze apart. Resuspend vervolgens de eerder geïsoleerde muizenlijn negatieve hematopoietische stam- en voorlopercellen in het geconcentreerde kweekmedium met een dichtheid van één keer 10 tot de zes cellen per 167 microliter.Koppel een van de spuiten los van de connector en pipetteer 167 microliter van de celsuspensie rechtstreeks in de connector terwijl u tegelijkertijd de zuiger van de spuit langzaam trekt om ruimte te maken voor de celsuspensie. Nadat u alle celsuspensie in de connector hebt toegevoegd, trekt u de zuiger verder om de suspensie uit de connector te trekken en sluit u de tweede spuit voorzichtig opnieuw aan, waarbij u ervoor zorgt dat er geen suspensie in de schroefdraad verloren gaat. Om het methylcellulosemedium te homogeniseren met de celsuspensie, beweegt u de zuigers langzaam 10 keer heen en weer tussen de twee spuiten, trekt u vervolgens het totale volume in één spuit en koppelt u de twee spuiten los, waarbij de connector op de lege blijft.Leeg de inhoud van de spuit in een put van een plaat met vier putten en incubeer de plaat op 37 graden onder 5% koolstofdioxide. Om proplatelets te analyseren, breng op dag drie van de kweek zorgvuldig alle cellen van één put over in een buis van 15 milliliter met 10 milliliter DMEM met 1% PSG. Resuspend de cellen door voorzichtig te pipetteren om de methylcellulose volledig te verdunnen en centrifugeer de buis vervolgens gedurende vijf minuten bij 300 keer G bij kamertemperatuur.Nadat u het supernatant hebt weggegooid, resuspendeert u de celkorrel in één milliliter volledig kweekmedium en zaait u de cellen opnieuw met 500 microliter per put van een plaat met vier putten. Incubeer de plaat bij 37 graden Celsius onder 5% koolstofdioxide. De volgende dag verwerft u met behulp van een Brightfield-microscoop met een 20X-objectief willekeurig 10 beelden per put, zorgt u ervoor dat er niet te veel cellen in het gezichtsveld zijn en worden ten minste vijf megakaryocyten per veld vastgelegd.Tel met ImageJ het totale aantal megakaryocyten en die uitstrekkende proplatelets in elke afbeelding om het aandeel megakaryocyten te berekenen dat proplatelets verlengt. Om de cellen te fixeren voor toekomstige analyses, voegt u de fixerende oplossing toe aan de methylcellulose zonder de gel te verstoren. Na het wachten op een geschikte tijd, afhankelijk van het gebruikte fixatief, gebruikt u een P1000-pipet om het fixeermiddel en de gel voorzichtig te pipetteren totdat de methylcellulose homogeen is verdund.En breng met dezelfde pipetpunt alle inhoud van de put over in een buis van 15 milliliter met 10 milliliter DPBS en homogeniseert door te mengen. Centrifugeer het mengsel. Gooi het supernatant weg en resuspend de megakaryocytkorrel in een medium dat geschikt is voor de gewenste analyse.Op dag drie van de kweek zijn megakaryocyten in het vloeibare medium op de bodem van de put gesedimenteerd en staan ze in contact met het stijve plastic oppervlak en andere cellen. Daarentegen zijn cellen ingebed in de methylcellulosehydrogel homogeen verdeeld en geïsoleerd van naburige cellen. Een analyse van de gemiddelde diameter van megakaryocyten onder verschillende kweekomstandigheden toont aan dat 2% methylcellulose de gemiddelde megakaryocytendiameter iets verhoogt in vergelijking met de vloeibare cultuur.Het verhogen van de methylcelluloseconcentratie met 0,5% schaadt echter de differentiatie van megakaryocyten, zoals aangegeven door een kleinere gemiddelde diameter. In representatieve transmissie-elektronenmicroscopiebeelden lijken de intracytoplasmatische membranen in megakaryocyten die in vivo in het beenmerg zijn gedifferentieerd, nauw te zijn tegengesteld aan afgebakende cytoplasmatische gebieden. In vloeibare cultuur hebben de membranen meestal een klein rond ovaal uiterlijk of langwerpige blaasjes zonder afbakening van cytoplasmatische territoria.Daarentegen heeft de 2%methylcellulosecultuur nauw tegengestelde membranen met afbakenende cytoplasmatische gebieden die lijken op de in situ structuur. Op dag vier van de kweek vertonen megakaryocyten die eerder in hydrogel zijn gekweekt een verhoogde proplaatjesvorming in vergelijking met die gekweekt in vloeibaar medium. Het gemiddelde aandeel megakaryocytenverlengende proplatelets is meestal ongeveer 15 tot 20% met een vloeibare prekweek vergeleken met 35 tot 40% met een methylcellulose hydrogel pre-cultuur.Bij het proberen van deze procedure is het belangrijk om de juiste volumes zeer nauwkeurig te pipetten, omdat een kleine verandering in de uiteindelijke methylcelluloseconcentratie de mediastijfheid aanzienlijk kan wijzigen. Na celrijping in de hydrogel kunnen megakaryocyten worden teruggewonnen voor ploïdie- en celmarkeranalyse door flowcytometrie of worden gefixeerd voor elektronenmicroscopie of immunostaining van eiwit van belang.

Research

JoVE Journal

Biology

Testing Visual Sensitivity to the Speed and Direction of Motion in Lizards

Het testen van visuele gevoeligheid voor de snelheid en richting van de beweging in Lizards

Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of ...

Endothelial Cell Co-culture Mediates Maturation of Human Embryonic Stem Cell to Pancreatic Insulin Producing Cells in a Directed Differentiation Approach

Endotheelcel Co-cultuur Bemiddelt Rijping van menselijke embryonale stamcellen te Pancreatic insuline producerende cellen in een Geregisseerd Differentiatie aanpak

Embryonic stem cells (ESC) have two main characteristics: they can be indefinitely propagated in vitro in an undifferentiated state and they are ...

Do-It-Yourself Device for Recovery of Cryopreserved Samples Accidentally Dropped into Cryogenic Storage Tanks

Doe-het-zelf-Inrichting voor Herstel van gecryopreserveerde monsters per ongeluk laat vallen in cryogene opslagtanks

Liquid nitrogen is colorless, odorless, extremely cold (-196 &deg;C) liquid kept under pressure. It is commonly used as a cryogenic fluid for long term ...

An Ex vivo Culture System to Study Thyroid Development

An Ex vivo Culture System to Study Thyroid Development

Een<em&gt; Ex vivo</em&gt; Cultuur Systeem om Schildklier Development Study

The thyroid is a bilobated endocrine gland localized at the base of the neck, producing the thyroid hormones T3, T4, and calcitonin. T3 and T4 are ...

Sequential Application of Glass Coverslips to Assess the Compressive Stiffness of the Mouse Lens: Strain and Morphometric Analyses

Sequentiële Toepassing van dekglaasjes naar de Samenpersende stijfheid van de Muis Lens Assess: Strain en Morfometrische Analyses

The eye lens is a transparent organ that refracts and focuses light to form a clear image on the retina. In humans, ciliary muscles contract to deform the ...

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

Meten van de stijfheid van<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Mouse aorta&#39;s met behulp van Atomic Force Microscopy

Arterial stiffening is a significant risk factor and biomarker for cardiovascular disease and a hallmark of aging. Atomic force microscopy (AFM) is a ...

Isolation and 3D Collagen Sandwich Culture of Primary Mouse Hepatocytes to Study the Role of Cytoskeleton in Bile Canalicular Formation In Vitro

Isolatie en 3D collageen sandwich cultuur van primaire muis hepatocyten te bestuderen van de rol van Cytoskeleton in Gal Canalicular vorming in vitro

Hepatocytes are the central cells of the liver responsible for its metabolic function. As such, they form a uniquely polarized epithelium, in which two or ...

An Adipocyte Cell Culture Model to Study the Impact of Protein and Micro-RNA Modulation on Adipocyte Function

Een adipocytencelkweekmodel om de impact van eiwit- en micro-RNA-modulatie op de adipocytenfunctie te bestuderen

Alteration of adipocyte function contributes to the pathogenesis of metabolic diseases including Type 2 diabetes and insulin resistance. This highlights ...

Large-Scale Preparation of Synovial Fluid Mesenchymal Stem Cell-Derived Exosomes by 3D Bioreactor Culture

Grootschalige bereiding van synoviale vloeistof Mesenchymale stamcel-afgeleide exosomen door 3D Bioreactor Cultuur

Exosomes secreted by mesenchymal stem cells (MSCs) have been suggested as promising candidates for cartilage injuries and osteoarthritis treatment. ...