Name: in vivo two-photon imaging of megakaryocytes and proplatelets in the mouse skull bone marrow
Uploaded: 2021-07-28T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Two-photon Imaging of Megakaryocytes and Proplatelets in the Mouse Skull Bone Marrow at JoVE.com

המחברים רוצים להודות לפלוריאן גרטנר (המכון למדע וטכנולוגיה אוסטריה, קלוסטרניובורג, אוסטריה) על עצתו המומחית לניסויי מיקרוסקופיה דו-פוטונית בזמן שהקמנו את הטכניקה במעבדה, ולאיב לוץ במרכז ההדמיה IGBMC / CBI (אילקירך, צרפת) על מומחיותו ועזרתו במיקרוסקופ הדו-פוטון. אנו מודים גם לז'אן-איב רינקל על עזרתו הטכנית ולאינס גינארד על ציור הסכימה באיור 1. אנו מודים ל- ARMESA (Association de Recherche et Développement en Médecine et Santé Publique) על תמיכתה ברכישת המיקרוסקופ הדו-פוטון. AB נתמך על ידי מלגות פוסט-דוקטורט מ- Etablissement Français du Sang (APR2016) ומ- Agence Nationale de la Recherche (ANR-18-CE14-0037-01).

כל הניסויים בבעלי חיים בוצעו בהתאם לתקנים האירופיים 2010/63/EU וועדת CREMEAS לאתיקה של ניסויים בבעלי חיים של אוניברסיטת שטרסבורג (Comité Régional d'Ethique en Matière d'Expérimentation Animale Strasbourg, הסכם מתקן לבעלי חיים N°: G67-482-10, הסכם פרויקט N° : 2018061211274514).
1. הכנת עכברים והכנסת קטטר בווריד הצוואר
<p class="jove_cont...

<ol>
	<li>Junt, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+visualization+of+thrombopoiesis+within+bone+marrow.">Dynamic visualization of thrombopoiesis within bone marrow.</a> Science. 317 (5845), 1767-1770 (2007).</li><li>Mazo, I. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoietic+progenitor+cell+rolling+in+bone+marrow+microvessels:+parallel+contributions+by+endothelial+selectins+and+vascular+cell+adhesion+molecule+1.">Hematopoietic progenitor cell rolling in bone marrow microvessels: parallel contributions by endothelial selectins and vascular cell adhesion molecule 1.</a> Journal of Experimenal Medicine. 188 (3), 465-474 (1998).</li><li>Bornert, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoskeletal-based+mechanisms+differently+regulate+in+vivo+and+in+vitro+proplatelet+formation.">Cytoskeletal-based mechanisms differently regulate in vivo and in vitro proplatelet formation.</a> Haematologica. , (2020).</li><li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sphingosine+kinase+2+(Sphk2)+regulates+platelet+biogenesis+by+providing+intracellular+sphingosine+1-phosphate+(S1P).">Sphingosine kinase 2 (Sphk2) regulates platelet biogenesis by providing intracellular sphingosine 1-phosphate (S1P).</a> Blood. 122 (5), 791-802 (2013).</li><li>Kowata, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelet+demand+modulates+the+type+of+intravascular+protrusion+of+megakaryocytes+in+bone+marrow.">Platelet demand modulates the type of intravascular protrusion of megakaryocytes in bone marrow.</a> Thrombosis and Haemostasis. 112 (4), 743-756 (2014).</li><li>Nishimura, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL-1alpha+induces+thrombopoiesis+through+megakaryocyte+rupture+in+response+to+acute+platelet+needs.">IL-1alpha induces thrombopoiesis through megakaryocyte rupture in response to acute platelet needs.</a> Journal of Cell Biology. 209 (3), 453-466 (2015).</li><li>Lefrancais, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+lung+is+a+site+of+platelet+biogenesis+and+a+reservoir+for+haematopoietic+progenitors.">The lung is a site of platelet biogenesis and a reservoir for haematopoietic progenitors.</a> Nature. 544 (7648), 105-109 (2017).</li><li>Potts, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+budding+is+a+major+mechanism+of+in+vivo+platelet+biogenesis.">Membrane budding is a major mechanism of in vivo platelet biogenesis.</a> Journal of Experimental Medicine. 217 (9), 20191206 (2020).</li><li>Scott, M. K., Akinduro, O., Lo Celso, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+4-dimensional+tracking+of+hematopoietic+stem+and+progenitor+cells+in+adult+mouse+calvarial+bone+marrow.">In vivo 4-dimensional tracking of hematopoietic stem and progenitor cells in adult mouse calvarial bone marrow.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (91), e51683 (2014).</li><li>Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+global+double-fluorescent+Cre+reporter+mouse.">A global double-fluorescent Cre reporter mouse.</a> Genesis. 45 (9), 593-605 (2007).</li><li>Tiedt, R., Schomber, T., Hao-Shen, H., Skoda, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pf4-Cre+transgenic+mice+allow+the+generation+of+lineage-restricted+gene+knockouts+for+studying+megakaryocyte+and+platelet+function+in+vivo.">Pf4-Cre transgenic mice allow the generation of lineage-restricted gene knockouts for studying megakaryocyte and platelet function in vivo.</a> Blood. 109 (4), 1503-1506 (2007).</li><li>Pertuy, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Broader+expression+of+the+mouse+platelet+factor+4-cre+transgene+beyond+the+megakaryocyte+lineage.">Broader expression of the mouse platelet factor 4-cre transgene beyond the megakaryocyte lineage.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. 13 (1), 115-125 (2015).</li><li>Calaminus, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lineage+tracing+of+Pf4-Cre+marks+hematopoietic+stem+cells+and+their+progeny.">Lineage tracing of Pf4-Cre marks hematopoietic stem cells and their progeny.</a> PLoS One. 7 (12), 51361 (2012).</li><li>Stegner, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thrombopoiesis+is+spatially+regulated+by+the+bone+marrow+vasculature.">Thrombopoiesis is spatially regulated by the bone marrow vasculature.</a> Nature Communications. 8 (1), 127 (2017).</li><li>Drew, P. J., Blinder, P., Cauwenberghs, G., Shih, A. Y., Kleinfeld, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+determination+of+particle+velocity+from+space-time+images+using+the+Radon+transform.">Rapid determination of particle velocity from space-time images using the Radon transform.</a> Journal of Computational Neuroscience. 29 (1-2), 5-11 (2010).</li><li>Nakagawa, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ketamine+suppresses+platelet+aggregation+possibly+by+suppressed+inositol+triphosphate+formation+and+subsequent+suppression+of+cytosolic+calcium+increase.">Ketamine suppresses platelet aggregation possibly by suppressed inositol triphosphate formation and subsequent suppression of cytosolic calcium increase.</a> Anesthesiology. 96 (5), 1147-1152 (2002).</li><li>Kim, S., Lin, L., Brown, G. A. J., Hosaka, K., Scott, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extended+time-lapse+in+vivo+imaging+of+tibia+bone+marrow+to+visualize+dynamic+hematopoietic+stem+cell+engraftment.">Extended time-lapse in vivo imaging of tibia bone marrow to visualize dynamic hematopoietic stem cell engraftment.</a> Leukemia. 31 (7), 1582-1592 (2017).</li><li>Kohler, A., Geiger, H., Gunzer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+hematopoietic+stem+cells+in+the+marrow+of+long+bones+in+vivo.">Imaging hematopoietic stem cells in the marrow of long bones in vivo.</a> Methods in Molecular Biology. 750, 215-224 (2011).</li><li>Lewandowski, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+cellular+imaging+pinpoints+the+role+of+reactive+oxygen+species+in+the+early+steps+of+adult+hematopoietic+reconstitution.">In vivo cellular imaging pinpoints the role of reactive oxygen species in the early steps of adult hematopoietic reconstitution.</a> Blood. 115 (3), 443-452 (2010).</li><li>Reismann, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Longitudinal+intravital+imaging+of+the+femoral+bone+marrow+reveals+plasticity+within+marrow+vasculature.">Longitudinal intravital imaging of the femoral bone marrow reveals plasticity within marrow vasculature.</a> Nature Communications. 8 (1), 2153 (2017).</li><li>Chen, Y., Maeda, A., Bu, J., DaCosta, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Femur+window+chamber+model+for+in+vivo+cell+tracking+in+the+murine+bone+marrow.">Femur window chamber model for in vivo cell tracking in the murine bone marrow.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (113), e542205 (2016).</li><li>Guesmi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual-color+deep-tissue+three-photon+microscopy+with+a+multiband+infrared+laser.">Dual-color deep-tissue three-photon microscopy with a multiband infrared laser.</a> Light Science &amp; Applications. 7, 12 (2018).</li><li>Wang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-photon+imaging+of+mouse+brain+structure+and+function+through+the+intact+skull.">Three-photon imaging of mouse brain structure and function through the intact skull.</a> Nature Methods. 15 (10), 789-792 (2018).</li><li>Kim, J., Bixel, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+multiphoton+imaging+of+the+bone+and+bone+marrow+environment.">Intravital multiphoton imaging of the bone and bone marrow environment.</a> Cytometry A. 97 (5), 496-503 (2020).</li></ol>

המנגנונים של היווצרות טסיות דם תלויים מאוד בסביבת מח העצם. לפיכך, מיקרוסקופיה תוך-וינטלית הפכה לכלי חשוב בתחום כדי לדמיין את התהליך בזמן אמת. עכברים עם מגה-קריוציטים פלואורסצנטיים ניתן להשיג על ידי חציית עכברים המבטאים את Cre רקומבינאז במגקריוציטים עם כל עכברי כתב פלוקס המכילים קלטת ביטוי ...

טסיות דם מיוצרות על ידי תאים מיוחדים megakaryocytes הממוקם במח העצם. הדרך המדויקת שבה מגהקריוציטים משחררים טסיות דם במחזור כבר מזמן לא ברורה בשל האתגר הטכני בהתבוננות באירועים בזמן אמת דרך העצם. מיקרוסקופיה דו-פוטונית סייעה להתגבר על אתגר זה והובילה להתקדמות משמעותית בהבנת תהליך היווצרות טסיות הדם. התצפיות הראשונות ב- vivo megakaryocyte נעשו על ידי פון אנדריאן ועמיתיו בשנת 2007, עם הדמיה של מגה-קריוציטים פלואורסצנטיים דרך הגולגולת1. זה היה אפשרי כי שכבת העצם בגולגולת הקדמית של עכברים צעירים יש עובי של כמה עשרות מיקרון והוא שקוף מספיק כדי לאפשר הדמיה של תאים פלואורסצנטיים במח העצם הבסיסי2.
מחקרים שלאחר מכן יישמו הליך זה כדי להעריך היווצרות proplatelet בתנאים שונים ולפענח את המנגנונים הבסיסיים3,4,5,6. מחקרים אלה סיפקו ראיות חותכות לכך שמקריוציטים מרחפים באופן דינמי בליטות, הנקראות מפיץ, דרך המחסום האנדיותל של כלי הסינוסואידים (איור 1). מרחיבים אלה משתחררים לאחר מכן כמו שברים ארוכים המייצגים כמה מאות טסיות בנפח. טסיות הדם ייווצרו לאחר שיפוץ של ההתפשטות במיקרו-מחזור של איברים במורד הזרם, במיוחד בריאות7. עם זאת, עד כה, התהליך המדויק והמנגנונים המולקולריים עדיין נתונים לדיון. לדוגמה, התפקיד המוצע של חלבונים שלד ציטו בהארכת פרופלטלטים שונה בין במבחנה לבין in vivo תנאים3, והבדלים בהיווצרות פרופלטלט הוכחו בתנאים דלקתיים6. מסבך את הדברים עוד יותר, מחקר שנערך לאחרונה ערער על הרעיון מונע פרופלטלט והציע כי ב vivo, טסיות נוצרות למעשה באמצעות מנגנון ניצני ממברנה ברמה megakaryocyte8.
מאמר זה מציג פרוטוקול לתצפית של megakaryocytes ו proplatelets במח העצם מעצם הגולגולת בעכברים חיים, באמצעות הליך זעיר פולשני. גישות דומות תוארו בעבר כדי לדמיין תאי מח עצם אחרים, במיוחד גזע hematopoietic ותאי אבות9. ההתמקדות כאן היא על תצפית של megakaryocytes וטסיות כדי לפרט כמה פרמטרים שניתן למדוד, במיוחד מורפולוגיות proplate ומהירות טסיות דם. פרוטוקול זה מציג כיצד להכניס קטטר לתוך הווריד הצווארי כדי להזריק מעקבים פלואורסצנטיים וסמים ולהתבונן דרך עצם הגולגולת. עצם השוק חשוף באמצעות ניתוח קטין, כך טבעת מודבקת לעצם. טבעת זו משמשת כדי לשתק את הראש ולמנוע תנועות עקב נשימה וליצור מלאה מלוחים כאמצעי טבילה של העדשה. טכניקה זו מתאימה היטב i) להתבונן בזמן אמת גיאומטריה סינוסואידי megakaryocytes אינטראקציה עם קיר כלי; ii) לעקוב אחר megakaryocytes בתהליך של היווצרות proplatelet, התארכות, ושחרור; ו- iii) למדוד תנועות טסיות דם כדי לפקח על זרימת הדם הסינוסואידית המורכבת. נתונים שהושגו באמצעות פרוטוקול זה פורסמו לאחרונה3.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>GNU Octave software</td>
			<td>GNU Project</td>
			<td></td>
			<td>https://www.gnu.org/software/octave/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Histoacryl 5 x 0, 5 mL</td>
			<td>Braun</td>
			<td>1050052</td>
			<td>injectable solution of surgical glue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HyD hybrid detectors Leica Microsystems 4tunes</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>GNU project</td>
			<td></td>
			<td>Minimum version required</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imalgene/Ketamine 1000 fl/10 mL</td>
			<td>Boehring</td>
			<td>03661103003199</td>
			<td>eye protection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica SP8 MP DIVE microscope equipped with a 25x water objective, numerical aperture of 0.95</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td>simultaneous excitation of AlexaFluor-488 and Qtracker-655</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matlab</td>
			<td>MathWorks</td>
			<td></td>
			<td>https://www.mathworks.com/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ocrygel 10 g</td>
			<td>Laboratoires T.V.M.</td>
			<td>03700454505621</td>
			<td>Silicon dental paste blue and yellow</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Picodent twinsin speed</td>
			<td>Rotec</td>
			<td>13001002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qtracker 655 vascular label</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Q21021MP</td>
			<td>injectable solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Resonant scanner, 8 or 12 kHz</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rompun Xylazine 2% fl/25 mL</td>
			<td>Bayer</td>
			<td>04007221032311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superglue gel</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>to glue the ring to the bone</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surflo IV catheter - Blue 22 G</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>SR-OX2225C1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ti:Saph pulsing laser (Coherent) (femtosecond)</td>
			<td>Coherent</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo two-photon imaging of megakaryocytes and proplatelets in the mouse skull bone marrow

טסיות מיוצרות על ידי megakaryocytes, תאים מיוחדים הממוקמים במח העצם. האפשרות לדמיין megakaryocytes בזמן אמת ואת הסביבה הטבעית שלהם תוארה לפני יותר מ -10 שנים ושופכת אור חדש על תהליך היווצרות טסיות הדם. Megakaryocytes להאריך בליטות מוארכות, הנקראות proplatelets, דרך רירית אנדותל של כלי סינוסואיד. מאמר זה מציג פרוטוקול לתמונה בו זמנית בזמן אמת שכותרתו מגהקריוציטים במח העצם של הגולגולת ובכלי הסינוסואידים. טכניקה זו מסתמכת על ניתוח קטן השומר על הגולגולת שלמה כדי להגביל את התגובות הדלקתיות. ראש העכבר משותק עם טבעת המודבקת לגולגולת כדי למנוע מתנועות לנשום.
באמצעות מיקרוסקופיה דו פוטונית, ניתן לדמיין מגהקריוציטים עד כמה שעות, ומאפשר תצפית של בליטות תאים והתפשטות בתהליך התארכות בתוך כלי הסינוסואידים. זה מאפשר כימות של מספר פרמטרים הקשורים למורפולוגיה של בליטות (רוחב, אורך, נוכחות של אזורי התכווצות) והתנהגות התארכותם (מהירות, סדירות או נוכחות של הפסקות או שלבי נסיגה). טכניקה זו מאפשרת גם הקלטה סימולטנית של טסיות דם במחזור בכלי הסינוסואידים כדי לקבוע את מהירות טסיות הדם ואת כיוון זרימת הדם. שיטה זו שימושית במיוחד כדי לחקור את תפקידם של גנים מעניינים בהיווצרות טסיות דם באמצעות עכברים מהונדסים גנטית והיא גם נוחה לבדיקות פרמקולוגיות (חקר המנגנונים, הערכת תרופות בטיפול בהפרעות ייצור טסיות דם). זה הפך להיות כלי לא יסולא בפז, במיוחד כדי להשלים את המחקרים במבחנה כפי שהוא ידוע כיום כי היווצרות vivo ו אין ויטרו proplatelet להסתמך על מנגנונים שונים. הוכח, למשל, כי מיקרוטובולות במבחנה נדרשות להתארכות פרופלטלט כשלעצמה. עם זאת, ב vivo, הם מעדיפים לשמש פיגום, התארכות להיות מקודם בעיקר על ידי כוחות זרימת הדם.

באמצעות פרוטוקול זה, נותב הפלואורסצנטי, Qtracker-655, נוהל תוך ורידי כדי לדמיין כלי סינוס מוח anastomosed במח העצם הגולגולת ואת כיוון הזרימה כפי שמתואר על ידי החצים (איור 4A,משמאל). באמצעות עכברי mTmG, טסיות דם פלואורסצנטיות eGFP נרשמו מעל 20 s בכל ענף כלי, ומהירותם נמדדה באמצעות תוכנת ImageJ ו- GN...

Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Two-photon Imaging of Megakaryocytes and Proplatelets in the Mouse Skull Bone Marrow at JoVE.com

In Vivo Two-photon Imaging of Megakaryocytes and Proplatelets in the Mouse Skull Bone Marrow

אנו מתארים כאן את השיטה להדמיית מגהקריוציטים ופרופלטלטים במח העצם הגולגולתית של עכברים חיים באמצעות מיקרוסקופיה דו-פוטונית.

ב-Vivo הדמיה דו-פוטונית של מגהקריוציטים ופרופלטלטים במח העצם של גולגולת העכבר

Platelets are produced by megakaryocytes, specialized cells located in the bone marrow. The possibility to image megakaryocytes in real time and their ...

שיטה זו מאפשרת הדמיה בזמן אמת של אירועים שונים, המתרחשים במח העצם של עכבר הגולגולת, כגון megakaryocytes, הרחבת פרופלטלטים בתוך כלי הסינוסואידים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא ניתוח קטין הדרוש למזעור התגובה הדלקתית, המאפשר הדמיה in vivo של אירועים בתנאי המפעל כמעט. כדי להתחיל, להעביר את העכבר לחדר ההדמיה.הפעל את המיקרוסקופ והמחשב והגדר את הפרמטרים הנדרשים. לאחר העכבר יש לגמרי esthetized למקם את העכבר על צלחת מחוממת, מחומם ל 37 מעלות צלזיוס עבור כל המניפולציות הבאות, לגלח את הראש והגרון של העכבר ולהחיל את הג'ל על העיניים כדי למנוע יובש. מניחים את העכבר על גבו ומתקנים את הרגליים האחוריות עם סרט ניתוחי כדי למתוח את הגרון.לאחר חיטוי הגרון, לעשות 0.7 עד 1 ס"מ חתכו על וריד הצוואר ימין או שמאל באמצעות מספריים ולמתוח את רקמת החיבור הסמוכה כדי לחשוף את וריד להטוטן החיצוני על גבי שריר החזה. ממלאים את הצנתר עם תמיסת מלח פיזיולוגית חמה וסטרילית. לחדור את הצנתר דרך שריר החזה ולאחר מכן להכניס את הקטטר לתוך הווריד.הסר בעדינות את המחט, חבר את המזרק עם העוקבים הפלואורסצנטיים והזריק את הנפח המת של הצנתר. מניחים טיפה של דבק כירורגי כדי לייצב את הקטטר. החזר בזהירות את העכבר לעמדה נוטה.לחטא את הקרקפת עם 70% אתנול עם מגבת נייר תוך הסרת השיער הרפוי. השתמש מספריים דקים סטריליים פינצטה כדי להפוך חתכים בצורת T בקו האמצע עד סנטימטר אחד בין האוזניים על הקרקפת כדי לחשוף את calvarium. לחשוף את הגולגולת עם פינצטה, ולאחר מכן להשתמש במספריים ופינצטה כדי להסיר בזהירות את periosteum.השתמש ספוגית כותנה סטרילית ספוגה תמיסת מלח פיזיולוגית כדי להסיר את כל periosteum וכל פסולת או שיער אשר יכול לשנות את ההדמיה. לשטוף את הגולגולת עם מלוחים כדי להסיר כל עקבות דם ולייבש במהירות את העצם עם צמר גפן. החל את ג'ל הדבק על הטבעת, מניחים את הטבעת על העצם החשופה ושומרים עליה במשך כמה שניות כדי לאפשר לטבעת להיצמד בחוזקה לגולגולת.להלח קלות את הגולגולת עם צמר גפן מלוח. הכן את הדבק הדנטלי סיליקון על ידי ערבוב זהיר של הרכיבים הכחולים והצהובים ביחס של אחד לאחד. לאטום את הטבעת על ידי החלת הדבק הדנטלי כדי למנוע דליפה במהלך הדמיה.הסר בזהירות כל הדבק שיניים או דבק שאולי נכנס לטבעת. ואז למלא את הטבעת עם תמיסת מלח כדי לבדוק את הדליפה. מניחים את העכבר על התמיכה ומניחים דחיסה מקופלת מתחת לראש החיה כדי להרים את הראש ולמנוע ניתוק של הטבעת מהגולגולת כאשר הוא מחובר למחזיק.לעזאזל עם הטבעת על מחזיק הבלוק. מקם את התמיכה ואת הרכבת העכבר בתא המיקרוסקופ המחומם. הגדר את אורכי הגל לייזר המתאימים לארבע הרביעיות שנבחרו והתאוששות של האורות הנפלטים.באמצעות קטטר להטוטנים בין להטוטנים להזריק 50 microliters של 0.2 פתרון micromolar של נותב פלורסנט לתייג את כלי ההדבקה. מקם את שלב המיקרוסקופ עם התמיכה והעכבר תחת מטרת המיקרוסקופ. ודא כי הטבעת תמיד מלאה מלוחים ולמלא אותו במידת הצורך, ולטבול את המטרה מלוחה.השתמש באפיפלואורסצנטיות כדי לאתר את כלי מח העצם ולהתבונן במגקריוציטים מיושרים לאורך כלי הסינוסואידים. לרכישות ארוכות, הגדירו רכישה תלת-ממדית של מרחב-זמן עם תמונה של 384 על 384 פיקסלים באמצעות סורק תהודה של שמונה קילו הרץ ומצב דו-כיווני. השתמש בממוצע שורה ברזולוציה טובה ולאחר מכן בחר את גודל שלב Z הממוטב והגדר את מרווח הזמן הדרוש לפני תחילת הרכישה.עבור רכישות קצרות ומהירות, בחר מרחב, סוג רכישת זמן ומזער את גודל התמונה. במידת הצורך, התאם את התמונה לכלי השיט על-ידי סיבוב שדה ההדמיה. השתמש במהירות הסריקה הזמינה הגבוהה ביותר ובסרייקה דו-כיוונית.מזער את הקו בממוצע כדי למצוא את הפשרה האופטימלית בין הגדרת תמונה ומהירות הרכישה. לרכוש תוכנית Z אחת בלבד ולמזער את מרווח הזמן לרכישה. למדידת מהירות טסיות הדם 10 עד 20 שניות של רכישה צריך להיות מספיק.נותב הפלואורסצנטי נוהל תוך ורידי כדי לדמיין את כלי הסינוסואידים של מח העצם בגולגולת, עם כיוון הזרימה המתואר על ידי החץ. מהירות טסיות הדם הפלואורסצנטית נרשמה בכל ענף כלי שיט, ונצפתה שונות. כלי הסינוסואיד מציגים זרמים מורכבים עקב האנסטומיוזים, עם נוכחות של זרימת זרימה ואפילו קיפאון.החצים הצביעו על כיוון הזרימה ההפוך בהיפוריקט. מהירות טסיות הדם נמדדה גם עבור ענפי כלי דם שמאליים וימנים הצביעו על אי סדירות לאורך זמן בכל ענף כלי שיט עם שלבי תאוצה, קיפאון והאטה. מורפולוגיות שונות של פרופלטלטים נצפו, כולל מפיץ עם שוליים לא סדירים, ואז en מרחיבים ארוכים ו proplatelets עבה וקצר.כאשר megakaryocytes הרחיב את הנפצים באזורים של זרימות מורכבות, ההתפשטות הוזרמה מענף כלי אחד לשני, בהתאם לכיוון הזרימה. עם עצירת זרימת הדם, הנפיצים נרגעו והעכבר עבר דום לב באופן בלתי צפוי, הצביע על החשיבות של כוחות הידרודינמיים בהארכת ההרחבה. הרוחב והאורך של המפיץ נמדדו גם ברוחב ממוצע של 5.2 מיקרומטר ואורך מקסימלי ממוצע של כ 185 מיקרומטר נצפו.התוויית אורך ההתפשטות כפונקציה של הזמן מאפשרת הדמיה של ההתנהגות של מפיץ במהלך שלבי התארכות, קיפאון, או אפילו נסיגה. מהירות התארכות ממוצעת של כ -10 מיקרומטר לדקה נצפתה. התקנת הצנתר, אפשרה הזרקת תרופות כדי לחקור את ההשפעות על היווצרות proplatelet או אירועים אחרים של עניין בזמן אמת.

Research

JoVE Journal

Biology

In Vivo Two-photon Imaging of Megakaryocytes and Proplatelets in the Mouse Skull Bone Marrow

Generation of Bone Marrow Derived Murine Dendritic Cells for Use in 2-photon Imaging

הדור של מח עצם נגזר תאים דנדריטים Murine לשימוש 2-פוטון הדמיה

Several methods for the preparation of murine dendritic cells can be found in the literature. Here, we present a method that produces greater than 85% ...

Homing of Hematopoietic Cells to the Bone Marrow

ביות של תאים hematopoietic אל מח העצם

Homing is the phenomenon whereby transplanted hematopoietic cells are able to travel to and engraft or establish residence in the bone marrow.  Various ...

Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos

שני הפוטונים axotomy ואת זמן לשגות הדמיה confocal עוברי דג הזברה לחיות

Zebrafish have long been utilized to study the cellular and molecular mechanisms of development by time-lapse imaging of the living transparent embryo.  ...

Two-Photon-Based Photoactivation in Live Zebrafish Embryos

שני הפוטונים מבוסס Photoactivation עוברי דג הזברה לחיות

Photoactivation of target compounds in a living organism has proven a valuable approach to investigate various biological processes such as embryonic ...

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

בשנת vivo ההדמיה לטיפולים במודל עכבר orthotopic של סרטן השחלות

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models.  This paper describes the development of an orthotopic mouse model ...

In vivo Quantification of G Protein Coupled Receptor Interactions using Spectrally Resolved Two-photon Microscopy

In vivo Quantification of G Protein Coupled Receptor Interactions using Spectrally Resolved Two-photon Microscopy

ב כימות vivo של G מצמידים חלבון קולטן אינטראקציות באמצעות נפתר Spectrally שני פוטון מיקרוסקופית

The study of protein interactions in living cells is an important area of research because the information accumulated both benefits industrial ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

במעקב 4 ממדי Vivo של תאי גזע ואבות היווצרות דם במבוגרי עכבר calvarial מח עצם

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Osteoclast Derivation from Mouse Bone Marrow

גזירה האוסטאוקלסטים מעכבר מח עצם

Osteoclasts are highly specialized cells that are derived from the monocyte/macrophage lineage of the bone marrow. Their unique ability to resorb both the ...

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

מדידת הקשיחות של<em&gt; Ex Vivo</em&gt; עכבר Aortas באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי

Arterial stiffening is a significant risk factor and biomarker for cardiovascular disease and a hallmark of aging. Atomic force microscopy (AFM) is a ...

Expression of Fluorescent Fusion Proteins in Murine Bone Marrow-derived Dendritic Cells and Macrophages

ביטוי של חלבונים פיוז'ן פלואורסצנט תאים דנדריטים הנגזרות מח עצם מאתר ו מקרופאגים

Dendritic cells and macrophages are crucial cells that form the first line of defense against pathogens. They also play important roles in the initiation ...