Name: in vivo two-photon imaging of megakaryocytes and proplatelets in the mouse skull bone marrow
Uploaded: 2021-07-28T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Two-photon Imaging of Megakaryocytes and Proplatelets in the Mouse Skull Bone Marrow at JoVE.com

Os autores gostariam de agradecer a Florian Gaertner (Instituto de Ciência e Tecnologia da Áustria, Klosterneuburg, Áustria) por seu conselho de especialistas em experimentos de microscopia de dois fótons na época em que estabelecemos a técnica no laboratório, e Yves Lutz no Centro de Imagens IGBMC /CBI (Illkirch, França) por sua experiência e ajuda com o microscópio de dois fótons. Agradecemos também a Jean-Yves Rinkel por sua ajuda técnica e Inês Guinard pelo desenho do esquema na Figura 1. Agradecemos à ARMESA (Association de Recherche et Développement en Médecine et Santé Publique) pelo apoio na aquisição do microscópio de dois fótons. A AB foi apoiada por bolsas de pós-doutorado da Etablissement Français du Sang (APR2016) e da Agence Nationale de la Recherche (ANR-18-CE14-0037-01).

Todos os experimentos em animais foram realizados de acordo com as normas europeias 2010/63/UE e o Comitê de Ética em Experimentos Animais da Universidade de Estrasburgo (Comité Régional d'Ethique en Matière d'Expérimentation Animale Strasbourg, Acordo de Instalações Animais N°: G67-482-10, acordo de projeto N°: 2018061211274514).
1. Preparação de camundongos e inserção de cateter na veia jugular
NOTA: Aqui, foram utilizados ratos repórteres mTmG de 5-7...

<ol>
	<li>Junt, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+visualization+of+thrombopoiesis+within+bone+marrow.">Dynamic visualization of thrombopoiesis within bone marrow.</a> Science. 317 (5845), 1767-1770 (2007).</li><li>Mazo, I. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoietic+progenitor+cell+rolling+in+bone+marrow+microvessels:+parallel+contributions+by+endothelial+selectins+and+vascular+cell+adhesion+molecule+1.">Hematopoietic progenitor cell rolling in bone marrow microvessels: parallel contributions by endothelial selectins and vascular cell adhesion molecule 1.</a> Journal of Experimenal Medicine. 188 (3), 465-474 (1998).</li><li>Bornert, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoskeletal-based+mechanisms+differently+regulate+in+vivo+and+in+vitro+proplatelet+formation.">Cytoskeletal-based mechanisms differently regulate in vivo and in vitro proplatelet formation.</a> Haematologica. , (2020).</li><li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sphingosine+kinase+2+(Sphk2)+regulates+platelet+biogenesis+by+providing+intracellular+sphingosine+1-phosphate+(S1P).">Sphingosine kinase 2 (Sphk2) regulates platelet biogenesis by providing intracellular sphingosine 1-phosphate (S1P).</a> Blood. 122 (5), 791-802 (2013).</li><li>Kowata, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelet+demand+modulates+the+type+of+intravascular+protrusion+of+megakaryocytes+in+bone+marrow.">Platelet demand modulates the type of intravascular protrusion of megakaryocytes in bone marrow.</a> Thrombosis and Haemostasis. 112 (4), 743-756 (2014).</li><li>Nishimura, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL-1alpha+induces+thrombopoiesis+through+megakaryocyte+rupture+in+response+to+acute+platelet+needs.">IL-1alpha induces thrombopoiesis through megakaryocyte rupture in response to acute platelet needs.</a> Journal of Cell Biology. 209 (3), 453-466 (2015).</li><li>Lefrancais, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+lung+is+a+site+of+platelet+biogenesis+and+a+reservoir+for+haematopoietic+progenitors.">The lung is a site of platelet biogenesis and a reservoir for haematopoietic progenitors.</a> Nature. 544 (7648), 105-109 (2017).</li><li>Potts, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+budding+is+a+major+mechanism+of+in+vivo+platelet+biogenesis.">Membrane budding is a major mechanism of in vivo platelet biogenesis.</a> Journal of Experimental Medicine. 217 (9), 20191206 (2020).</li><li>Scott, M. K., Akinduro, O., Lo Celso, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+4-dimensional+tracking+of+hematopoietic+stem+and+progenitor+cells+in+adult+mouse+calvarial+bone+marrow.">In vivo 4-dimensional tracking of hematopoietic stem and progenitor cells in adult mouse calvarial bone marrow.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (91), e51683 (2014).</li><li>Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+global+double-fluorescent+Cre+reporter+mouse.">A global double-fluorescent Cre reporter mouse.</a> Genesis. 45 (9), 593-605 (2007).</li><li>Tiedt, R., Schomber, T., Hao-Shen, H., Skoda, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pf4-Cre+transgenic+mice+allow+the+generation+of+lineage-restricted+gene+knockouts+for+studying+megakaryocyte+and+platelet+function+in+vivo.">Pf4-Cre transgenic mice allow the generation of lineage-restricted gene knockouts for studying megakaryocyte and platelet function in vivo.</a> Blood. 109 (4), 1503-1506 (2007).</li><li>Pertuy, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Broader+expression+of+the+mouse+platelet+factor+4-cre+transgene+beyond+the+megakaryocyte+lineage.">Broader expression of the mouse platelet factor 4-cre transgene beyond the megakaryocyte lineage.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. 13 (1), 115-125 (2015).</li><li>Calaminus, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lineage+tracing+of+Pf4-Cre+marks+hematopoietic+stem+cells+and+their+progeny.">Lineage tracing of Pf4-Cre marks hematopoietic stem cells and their progeny.</a> PLoS One. 7 (12), 51361 (2012).</li><li>Stegner, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thrombopoiesis+is+spatially+regulated+by+the+bone+marrow+vasculature.">Thrombopoiesis is spatially regulated by the bone marrow vasculature.</a> Nature Communications. 8 (1), 127 (2017).</li><li>Drew, P. J., Blinder, P., Cauwenberghs, G., Shih, A. Y., Kleinfeld, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+determination+of+particle+velocity+from+space-time+images+using+the+Radon+transform.">Rapid determination of particle velocity from space-time images using the Radon transform.</a> Journal of Computational Neuroscience. 29 (1-2), 5-11 (2010).</li><li>Nakagawa, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ketamine+suppresses+platelet+aggregation+possibly+by+suppressed+inositol+triphosphate+formation+and+subsequent+suppression+of+cytosolic+calcium+increase.">Ketamine suppresses platelet aggregation possibly by suppressed inositol triphosphate formation and subsequent suppression of cytosolic calcium increase.</a> Anesthesiology. 96 (5), 1147-1152 (2002).</li><li>Kim, S., Lin, L., Brown, G. A. J., Hosaka, K., Scott, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extended+time-lapse+in+vivo+imaging+of+tibia+bone+marrow+to+visualize+dynamic+hematopoietic+stem+cell+engraftment.">Extended time-lapse in vivo imaging of tibia bone marrow to visualize dynamic hematopoietic stem cell engraftment.</a> Leukemia. 31 (7), 1582-1592 (2017).</li><li>Kohler, A., Geiger, H., Gunzer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+hematopoietic+stem+cells+in+the+marrow+of+long+bones+in+vivo.">Imaging hematopoietic stem cells in the marrow of long bones in vivo.</a> Methods in Molecular Biology. 750, 215-224 (2011).</li><li>Lewandowski, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+cellular+imaging+pinpoints+the+role+of+reactive+oxygen+species+in+the+early+steps+of+adult+hematopoietic+reconstitution.">In vivo cellular imaging pinpoints the role of reactive oxygen species in the early steps of adult hematopoietic reconstitution.</a> Blood. 115 (3), 443-452 (2010).</li><li>Reismann, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Longitudinal+intravital+imaging+of+the+femoral+bone+marrow+reveals+plasticity+within+marrow+vasculature.">Longitudinal intravital imaging of the femoral bone marrow reveals plasticity within marrow vasculature.</a> Nature Communications. 8 (1), 2153 (2017).</li><li>Chen, Y., Maeda, A., Bu, J., DaCosta, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Femur+window+chamber+model+for+in+vivo+cell+tracking+in+the+murine+bone+marrow.">Femur window chamber model for in vivo cell tracking in the murine bone marrow.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (113), e542205 (2016).</li><li>Guesmi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual-color+deep-tissue+three-photon+microscopy+with+a+multiband+infrared+laser.">Dual-color deep-tissue three-photon microscopy with a multiband infrared laser.</a> Light Science &amp; Applications. 7, 12 (2018).</li><li>Wang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-photon+imaging+of+mouse+brain+structure+and+function+through+the+intact+skull.">Three-photon imaging of mouse brain structure and function through the intact skull.</a> Nature Methods. 15 (10), 789-792 (2018).</li><li>Kim, J., Bixel, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+multiphoton+imaging+of+the+bone+and+bone+marrow+environment.">Intravital multiphoton imaging of the bone and bone marrow environment.</a> Cytometry A. 97 (5), 496-503 (2020).</li></ol>

Os mecanismos de formação de plaquetas são altamente dependentes do ambiente de medula óssea. Assim, a microscopia intravital tornou-se uma ferramenta importante no campo para visualizar o processo em tempo real. Camundongos com megacaiócitos fluorescentes podem ser obtidos cruzando camundongos expressando a recombinase cre em megacaiócitos com qualquer rato repórter floxed contendo um de expressão genética fluorescente condicional. Aqui, foram utilizados ratos repórteres mTmG (B6.129(Cg)-Gt(ROSA)26Sor...

As plaquetas são produzidas por células especializadas em megacaiócitos localizadas na medula óssea. A maneira precisa como os megacaiócitos liberam plaquetas na circulação há muito tempo não ficou clara devido ao desafio técnico em observar eventos em tempo real através do osso. A microscopia de dois fótons ajudou a superar esse desafio e levou a grandes avanços na compreensão do processo de formação de plaquetas. As primeiras observações in vivo de megacaito foram feitas por von Andrian e colegas em 2007, com a visualização de megacaiócitos fluorescentes através do crânio1. Isso foi possível porque a camada óssea no crânio frontoparietal de camundongos adultos jovens tem uma espessura de algumas dezenas de mícrons e é suficientemente transparente para permitir a visualização de células fluorescentes na medula óssea subjacente2.
Estudos subsequentes aplicaram este procedimento para avaliar a formação de proplatos em várias condições e decifrar os mecanismos subjacentes3,4,5,6. Esses estudos forneceram evidências definitivas de que os megacaiócitos ampliam dinamicamente as saliências, chamadas proplatelets, através da barreira endotelial dos vasos sinusoides(Figura 1). Essas propuladas são então liberadas como fragmentos longos que representam várias centenas de plaquetas em volume. As plaquetas serão formadas após a remodelação das propuladas na microcirculação de órgãos a jusante, notadamente nos pulmões7. Até o momento, no entanto, o processo preciso e os mecanismos moleculares permanecem sujeitos a debate. Por exemplo, o papel proposto das proteínas citoesqueletal no alongamento das proplatelets difere entre as condições in vitro e in vivo 3, e as diferenças na formação de proplatelets têm sido demonstradas sob condições inflamatórias6. Complicando ainda mais as coisas, um estudo recente contestou o conceito orientado por proplatelet e propôs que in vivo, plaquetas são essencialmente formadas através de um mecanismo de brotação de membrana no megacaiócito nível8.
Este artigo apresenta um protocolo para a observação de megacaiócitos e proplatelets na medula óssea do osso do crânio em camundongos vivos, usando um procedimento minimamente invasivo. Abordagens semelhantes foram descritas anteriormente para visualizar outras células de medula, notadamente células hematopoiéticas e progenitoras9. O foco aqui está na observação de megacaiócitos e plaquetas para detalhar alguns parâmetros que podem ser medidos, notadamente morfologias proplatelet e velocidade plaqueta. Este protocolo apresenta como inserir um cateter na veia jugular para injetar traços fluorescentes e drogas e observar através do osso do crânio. O osso calvário é exposto usando uma pequena cirurgia para que um anel seja colado ao osso. Este anel serve para imobilizar a cabeça e evitar movimentos devido à respiração e formar um copo cheio de soro fisiológico como o meio de imersão da lente. Esta técnica é bem adequada para i) observar em tempo real a geometria sinusoide e megacariócitos interagindo com a parede do vaso; ii) seguir os megacaitos no processo de formação de proplatelet, alongamento e liberação; e iii) medir os movimentos das plaquetas para monitorar o complexo fluxo sanguíneo sinusoide. Os dados obtidos usando este protocolo foram publicados recentemente3.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>GNU Octave software</td>
			<td>GNU Project</td>
			<td></td>
			<td>https://www.gnu.org/software/octave/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Histoacryl 5 x 0, 5 mL</td>
			<td>Braun</td>
			<td>1050052</td>
			<td>injectable solution of surgical glue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HyD hybrid detectors Leica Microsystems 4tunes</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>GNU project</td>
			<td></td>
			<td>Minimum version required</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imalgene/Ketamine 1000 fl/10 mL</td>
			<td>Boehring</td>
			<td>03661103003199</td>
			<td>eye protection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica SP8 MP DIVE microscope equipped with a 25x water objective, numerical aperture of 0.95</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td>simultaneous excitation of AlexaFluor-488 and Qtracker-655</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matlab</td>
			<td>MathWorks</td>
			<td></td>
			<td>https://www.mathworks.com/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ocrygel 10 g</td>
			<td>Laboratoires T.V.M.</td>
			<td>03700454505621</td>
			<td>Silicon dental paste blue and yellow</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Picodent twinsin speed</td>
			<td>Rotec</td>
			<td>13001002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qtracker 655 vascular label</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Q21021MP</td>
			<td>injectable solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Resonant scanner, 8 or 12 kHz</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rompun Xylazine 2% fl/25 mL</td>
			<td>Bayer</td>
			<td>04007221032311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superglue gel</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>to glue the ring to the bone</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surflo IV catheter - Blue 22 G</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>SR-OX2225C1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ti:Saph pulsing laser (Coherent) (femtosecond)</td>
			<td>Coherent</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo two-photon imaging of megakaryocytes and proplatelets in the mouse skull bone marrow

As plaquetas são produzidas por megacaiócitos, células especializadas localizadas na medula óssea. A possibilidade de imagem de megacaiócitos em tempo real e seu ambiente nativo foi descrita há mais de 10 anos e lança uma nova luz sobre o processo de formação de plaquetas. Os megacariócitos estendem as saliências alongadas, chamadas proplatelets, através do revestimento endotelial dos vasos sinusoides. Este artigo apresenta um protocolo para imagem simultânea em tempo real fluorescentemente rotulado megacariócitos na medula óssea do crânio e vasos sinusoides. Esta técnica conta com uma pequena cirurgia que mantém o crânio intacto para limitar as reações inflamatórias. A cabeça do rato é imobilizada com um anel colado no crânio para evitar que os movimentos respirem.
Usando microscopia de dois fótons, megacariócitos podem ser visualizados por até algumas horas, permitindo a observação de saliências celulares e proplatelets no processo de alongamento dentro de vasos sinusoides. Isso permite a quantificação de vários parâmetros relacionados à morfologia das protrusões (largura, comprimento, presença de áreas de constrição) e seu comportamento de alongamento (velocidade, regularidade ou presença de pausas ou fases de retração). Esta técnica também permite o registro simultâneo de plaquetas circulantes em vasos sinusoides para determinar a velocidade plaqueta e a direção do fluxo sanguíneo. Este método é particularmente útil para estudar o papel dos genes de interesse na formação de plaquetas usando camundongos geneticamente modificados e também é favorável aos testes farmacológicos (estudar os mecanismos, avaliando drogas no tratamento de distúrbios de produção de plaquetas). Tornou-se uma ferramenta inestimável, especialmente para complementar estudos in vitro, pois agora se sabe que a formação in vivo e in vitro proplatelet depende de diferentes mecanismos. Foi demonstrado, por exemplo, que microtúbulos in vitro são necessários para alongamento proplatelet por si só. No entanto, in vivo, eles preferem servir como um andaime, o alongamento sendo promovido principalmente por forças de fluxo sanguíneo.

Usando este protocolo, o rastreador fluorescente, Qtracker-655, foi administrado por via intravenosa a vasos sinusoides de medula anastomosa na medula óssea do crânio e na direção de fluxo, como retratado pelas setas(Figura 4A, à esquerda). Utilizando camundongos mTmG, as plaquetas fluorescentes eGFP foram registradas acima de 20 s em cada ramo do navio, e sua velocidade foi medida usando o software ImageJ e GNU Octave(Figura 4A, à direita). Note a heterog...

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In Vivo Two-photon Imaging of Megakaryocytes and Proplatelets in the Mouse Skull Bone Marrow

Descrevemos aqui o método para imagem de megacaiócitos e proplatelets na medula do osso do crânio de ratos vivos usando microscopia de dois fótons.

In Vivo Imagem de dois fótons de megacariócitos e proplatelets na medula óssea do crânio do rato

Platelets are produced by megakaryocytes, specialized cells located in the bone marrow. The possibility to image megakaryocytes in real time and their ...

Este método permite a visualização em tempo real de diferentes eventos, ocorrendo na medula óssea do rato do crânio, como megacariócitos, estendendo proplatelets dentro dos vasos sinusoides. A principal vantagem dessa técnica é uma pequena cirurgia necessária para minimizar a reação inflamatória, permitindo uma visualização in vivo de eventos em condições quase de fábrica. Para começar, transporte o rato para a sala de imagens.Ligue o microscópio e o computador e configure os parâmetros necessários. Uma vez que o mouse tenha colocado completamente anestesiado o mouse em uma placa aquecida, aquecido a 37 graus Celsius para todas as manipulações seguintes, raspe a cabeça e a garganta do mouse e aplique o gel nos olhos para evitar o ressecamento. Coloque o mouse de costas e conserte as pernas anteriores com fita cirúrgica para esticar a garganta.Depois de desinfetar a garganta, faça uma incisão de 0,7 a 1 centímetro sobre a veia jugular direita ou esquerda usando uma tesoura e estique o tecido conjuntivo adjacente para expor a veia malabarista externa em cima do músculo peitoral. Encha o cateter com soro fisiológico quente e estéril. Penetre o cateter através do músculo peitoral e, em seguida, insira o cateter na veia.Retire suavemente a agulha, conecte a seringa com os rastreadores fluorescentes e injete o volume morto do cateter. Coloque uma gota de cola cirúrgica para estabilizar o cateter. Retorne cuidadosamente o mouse para uma posição propensa.Desinfete o couro cabeludo com 70% de etanol com uma toalha de papel enquanto remove os cabelos soltos. Use tesouras finas estéreis e pinças para fazer uma incisão em forma de T na linha média até um centímetro entre as orelhas no couro cabeludo para expor o calvario. Exponha o crânio com pinças, depois use tesouras e pinças para remover cuidadosamente o periósteo.Use um cotonete estéril encharcado e fisiológico para remover todo o periósteo e quaisquer detritos ou cabelos que possam alterar a imagem. Enxágüe o crânio com soro fisiológico para remover quaisquer vestígios sanguíneos e seque rapidamente o osso com um cotonete. Aplique o gel de cola no anel, coloque o anel no osso exposto e mantenha-o por alguns segundos para permitir que o anel se apegue firmemente ao crânio.Umedeça levemente o crânio com um cotonete de algodão salino. Prepare a pasta dentária de Silício misturando cuidadosamente os componentes azul e amarelo em uma proporção de um para um. Sele o anel aplicando a pasta dentária para evitar vazamentos durante a imagem.Remova cuidadosamente qualquer pasta dentária ou cola que possa ter entrado no anel. Em seguida, encha o anel com soro fisiológico para verificar o vazamento. Coloque o mouse no suporte e coloque uma compressa dobrada sob a cabeça do animal para levantar a cabeça e evitar o descolamento do anel do crânio quando ligado ao suporte.Dane-se o anel no suporte do bloco. Coloque o suporte e o conjunto do mouse na câmara de microscópio aquecido. Defina os comprimentos de onda laser apropriados para os quatro quatros escolhidos e a recuperação das luzes emitidas.Utilizando o cateter inter malabarista injete 50 microliters de 0,2 solução micromolar do rastreador fluorescente para rotular a vasculatura. Coloque o estágio do microscópio com o suporte e o mouse sob o objetivo do microscópio. Certifique-se de que o anel está sempre cheio de soro fisiológico e recarrenchá-lo, se necessário, e imergir o objetivo e soro fisiológico.Use epifluorescência para localizar os vasos de medula óssea e observar os megacaiócitos alinhados ao longo dos vasos sinusoides. Para aquisições longas, configure uma aquisição 3D espaço-tempo com uma imagem de 384 por 384 pixels usando um scanner de ressonância Hertz de oito quilos e modo bidirecional. Use a linha média com boa resolução, em seguida, escolha o tamanho otimizado de etapa Z e configure o intervalo de tempo necessário antes de iniciar a aquisição.Para aquisições curtas e rápidas, escolha um espaço, tipo de aquisição de tempo e minimize o tamanho da imagem. Se necessário, ajuste a imagem para a nave girando o campo de imagem. Use a maior velocidade de varredura disponível e digitalização bidirecional.Minimize a média da linha para encontrar o compromisso ideal entre definição de imagem e rapidez da aquisição. Adquira apenas um plano Z e minimize o intervalo de tempo para aquisição. Para medir a velocidade plaqueta de 10 a 20 segundos de aquisição deve ser suficiente.O rastreador fluorescente foi administrado por via intravenosa à imagem dos vasos sinusoides de medula anastomosa na medula óssea do crânio, com a direção de fluxo representada pela seta. A velocidade da plaqueta fluorescente foi registrada em cada ramo do vaso, e a variação foi observada. Os vasos sinusoides apresentam fluxos complexos devido aos anastomoses, com a presença de refluxo de fluxo e até estase.Setas indicavam a direção oposta do fluxo na bifurcação. A velocidade da plaqueta também foi medida para os ramos da embarcação esquerda e direita indicaram irregularidade ao longo do tempo em cada ramo da embarcação com fases de aceleração, estase e desaceleração. Diferentes morfologias de proplatelets foram observadas, incluindo proplatelets com margens irregulares, em seguida, en proplatelets longos e proplatelets grossas e curtas.Quando os megacaiócitos estenderam as propuladas nas áreas de fluxos complexos, os propulados lançam de um ramo de navio para o outro, de acordo com a direção de fluxo. Ao parar o fluxo sanguíneo, as propuladas relaxaram e o camundongo inesperadamente sofreu parada cardíaca, indicando a importância das forças hidrodinâmicas no alongamento proplatelet. A largura e o comprimento dos proplatelets também foram medidos com largura média de 5,2 micrômetros e observou-se um comprimento máximo médio de aproximadamente 185 micrômetros.Traçar o comprimento proplatelet em função do tempo permite a visualização do comportamento dos proplatelets durante fases de alongamento, estase ou até mesmo retração. Observou-se a velocidade média de alongamento de aproximadamente 10 micrômetros por minuto. A instalação do cateter permitiu a injeção de medicamentos para estudar os efeitos na formação de proplatelets ou outros eventos de interesse em tempo real.

Research

JoVE Journal

Biology

In Vivo Two-photon Imaging of Megakaryocytes and Proplatelets in the Mouse Skull Bone Marrow

Generation of Bone Marrow Derived Murine Dendritic Cells for Use in 2-photon Imaging

Geração de Medula Óssea Derivado Células Dendríticas murino para uso em dois fótons de imagem

Several methods for the preparation of murine dendritic cells can be found in the literature. Here, we present a method that produces greater than 85% ...

Biologia

Homing of Hematopoietic Cells to the Bone Marrow

Homing das células hematopoiéticas da medula óssea

Homing is the phenomenon whereby transplanted hematopoietic cells are able to travel to and engraft or establish residence in the bone marrow.  Various ...

Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos

Dois fótons axotomia e lapso de tempo de imagem confocal em embriões de peixe-zebra ao vivo

Zebrafish have long been utilized to study the cellular and molecular mechanisms of development by time-lapse imaging of the living transparent embryo.  ...

Two-Photon-Based Photoactivation in Live Zebrafish Embryos

Two-Photon-Based fotoativação no Live Embriões Zebrafish

Photoactivation of target compounds in a living organism has proven a valuable approach to investigate various biological processes such as embryonic ...

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

In vivo de imagens e tratamentos terapêuticos em um modelo de camundongo ortotópico de câncer de ovário

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models.  This paper describes the development of an orthotopic mouse model ...

In vivo Quantification of G Protein Coupled Receptor Interactions using Spectrally Resolved Two-photon Microscopy

In vivo Quantification of G Protein Coupled Receptor Interactions using Spectrally Resolved Two-photon Microscopy

Em Quantificação in vivo de proteínas G Interações Receptor Acoplado usando espectral Resolvido Microscopia de dois fótons

The study of protein interactions in living cells is an important area of research because the information accumulated both benefits industrial ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo Rastreamento 4-Dimensional de tronco hematopoéticas e células progenitoras em adultos mouse na calota craniana de Medula Óssea

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Osteoclast Derivation from Mouse Bone Marrow

Osteoclastos Derivação do mouse Medula Óssea

Osteoclasts are highly specialized cells that are derived from the monocyte/macrophage lineage of the bone marrow. Their unique ability to resorb both the ...

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

Medindo a rigidez<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Mouse aortas Usando Microscopia de Força Atômica

Arterial stiffening is a significant risk factor and biomarker for cardiovascular disease and a hallmark of aging. Atomic force microscopy (AFM) is a ...

Expression of Fluorescent Fusion Proteins in Murine Bone Marrow-derived Dendritic Cells and Macrophages

Expressão de proteínas da fusão fluorescente em murino derivadas da medula óssea as células dendríticas e macrófagos

Dendritic cells and macrophages are crucial cells that form the first line of defense against pathogens. They also play important roles in the initiation ...