현재 의 섬모 분석 방법은 노동 집약적이며 오류와 편견에 취약합니다. 우리의 접근 방식은 잠재적인 오류를 완화하면서 시간과 노력을 간소화하고자 합니다. 이 기술이 제공하는 주요 장점은 엄격성과 재현성 및 정량적 이미지 분석이 증가한다는 것입니다.
접근의 이 모형은 섬모 분석과 관련있을 뿐 아니라, 그밖 세포기관 및 cytoskeletal 단백질을 취급하는 그 포함하여 많은 세포 생물학 질문에 광범위하게 적용될 수 있습니다. 먼저 교육 데이터 집합을 열고 메뉴에서 파일을 선택하고 내보내기 가져오기를 클릭하고 파일 시퀀스에서 ND 파일 만들기를 선택합니다. 학습 데이터 집합이 포함된 폴더를 선택하고 대화 상자 창 중앙에서 파일 목록이 열립니다.
드롭다운 메뉴에서 하나 이상의 옵션을 사용하여 파일 구성을 수동으로 정의합니다. 선택한 각 옵션 아래에 해당 숫자 값을 입력하고 옵션을 선택하지 않는 경우 를 선택하지 않습니다. 변환을 클릭하여 ND 문서를 엽니다.
이미지를 보정하려면 이미지의 왼쪽 아래 모서리에 있는 보정되지 않은 옵션을 마우스 오른쪽으로 클릭합니다. 보정 문서를 클릭한 다음 픽셀 크기를 클릭하고 값을 입력하고 확인을 클릭합니다. 뷰 분석 컨트롤을 선택하고, 이진 도구 모음을 열고, 열린 모든 프레임에서 개별 섬모 구조를 정확하게 추적하여 손 식별 을 위해 자동 감지 또는 그리기 개체를 선택합니다.
AI 교육을 위해 nis를 선택합니다. ai, 기차 세그먼트를 클릭합니다. ai는 기차 세그먼트를 엽니 다.
ai box 를 선택한 다음 학습에 사용할 소스 채널을 선택합니다. AI를 훈련하기 위해 적절한 그라운드진실 바이너리를 선택합니다. 이진 크기 및 분포에 따라 AI를 학습하기 위해 필요한 반복 수를 선택한 다음 대상 폴더를 선택하여 학습된 AI 파일을 저장하고 기차를 클릭하여 소프트웨어를 학습합니다. 이 프로세스는 몇 시간이 걸립니다.
샘플을 변환하여 전에 설명한 것과 같이 섬모의 실험적 공초점 이미지를 엽니다. ND2 파일에 대한 TIF 파일입니다. 팝업 창에서 첫 번째 드롭다운 메뉴에서 멀티 포인트를 선택하고 총 이미지 수에 해당하는 값을 입력합니다.
두 번째 드롭다운 상자에서 파장을 선택하고 값을 폴더의 총 채널 수로 변경합니다. 이 소프트웨어는 자동으로 팝업 창의 오른쪽 끝에있는 파장 선택 창의 잠금을 해제합니다. 파장 선택 창에서 색상 드롭다운 메뉴를 사용하여 각 채널의 색상을 선택합니다.
각 채널에 이름 열 아래에 다른 이름을 제공합니다. 모든 정보가 업데이트되면 변환을 클릭합니다. 앞에서 설명한 대로 이미지를 보정합니다.
실험 데이터 집합의 픽셀 크기가 학습 데이터 집합의 픽셀 크기와 일치하는지 확인합니다. 이전 단계에서 숙련된 AI를 사용하여 첫 번째 채널에서 섬모를 식별합니다. 니스를 엽니다.
메뉴에서 ai, 세그먼트를 선택합니다. ai는 소스 채널에서 AC3를 선택합니다. 그런 다음 소스 채널에서 MCHR1을 선택하여 두 번째 채널의 섬모를 식별합니다.
이 소프트웨어는 라벨이 붙은 섬모에 바이너리를 그립니다. 다음 이미지를 잘못 식별한 바이너리에 대해 확인합니다. 이진 도구 모음에서 개체 삭제를 선택하여 잘못 식별된 바이너리를 수동으로 삭제합니다.
섬모가 확인되고 세분화되면 일반 분석 세 도구를 사용하여 길이 및 강도와 같은 다른 섬모 매개 변수를 분석합니다. 메뉴에서 이미지를 선택하고 새 GA3 레시피를 클릭합니다. 중앙에 빈 공간이 있는 새 창이 열립니다.
GA3는 AI에 따라 적절하게 표시된 바이너리를 자동으로 감지하고 해당 노드를 포함합니다. GA3는 또한 이미지의 채널을 자동으로 감지하고 채널 아래에 탭을 표시합니다. AI는 프레임의 오브젝트처럼 모든 섬모를 분할하고 프레임 가장자리를 따라 불완전한 섬모를 감지합니다.
이를 제거하려면 바이너리 처리를 선택하고 개체를 제거한 다음 터치 테두리 노드를 빈 공간으로 드래그한 다음 노드를 적절한 바이너리에 연결합니다. 섬모 길이를 측정하려면 측정 오브젝트 크기를 선택한 다음 길이를 선택합니다. 매개 변수를 중앙에 드래그 앤 드롭하고 적절한 이진 노드에 연결합니다.
섬모 강도를 측정하려면 일부 개체 강도를 선택합니다. 매개 변수를 중앙에 드래그 앤 드롭하고 적절한 이진 노드 및 관심 채널에 연결합니다. 측정 메뉴에서 개체 비율계로 이동하여 Mander의 계수를 선택하여 개별 섬모 내에서 두 채널의 중복을 측정하여 GA3에서 지역화 경로를 설정합니다.
빈 공간에서 맨더의 계수 노드를 드래그앤드롭하고 적절한 바이너리 및 채널에 연결합니다. 데이터 관리 메뉴를 열어 측정값과 단일 테이블을 EnEn합니다. 기본 범주에서 ApEn 열을 선택한 다음 지금 실행을 클릭하여 섬모를 측정합니다.
모든 측정값은 단일 출력 테이블에 나타납니다. 대표적인 이미지는 훈련된 AI가 IMCD 세포, 1차 시상하계 배양 및 해마 배양의 이미지에서 체외에서 제대로 섬모를 확인했지만 사이토카인 브리지와 같은 다른 비섬모성 구조는 없음을 보여줍니다. 섬모의 길이는 IMCD 세포에서 0.5 내지 4.5 마이크로미터, 시상 하및 해마 배양에서 2 내지 12 마이크로미터 사이였다.
AI는 아크루아테 핵, 정맥핵 및 각막 암모의 한 부위의 이미지에서 생체내에서 AC3 라벨이 부착된 섬모의 길이를 측정했습니다. 분석에 따르면, 생체 내의 시상 하 부 섬모는 흰색과 갈색 막대에서 볼 수 있듯이 1에서 15 마이크로 미터까지 다양했습니다. 섬모와 각막 암모니스 지역은 회색 막대에서 볼 수 있듯이 1에서 10 마이크로미터까지 다양했습니다.
흥미롭게도, 섬모 MCHR1의 강도는 아크에이트 핵에서보다 심방 핵에서 더 강했다. AC3에 대한 MCHR1의 강도는 중복을 측정하기 위해 플롯되었다. 일부 섬모는 AC3 또는 MCHR1에 대 한 긍정적인 동안 섬모의 대부분은 두 마커에 대 한 긍정적인 했다.
AC3 내에서 MTHR1의 군산화를 정량화하기 위해 Mander의 중첩 계수를 측정하고 아크퀴아테 핵보다 심혈핵의 중첩이 크게 증가했습니다. 섬모의 길이를 따라 강도를 측정하기 위해, 섬모 극성은 기초 바디 마커로 Centrin2-GFP를 사용하여 정의되었습니다. 이것은 ARL13B-M 체리 양성 분모의 끝과 섬모의 기초를 구별 할 수 있었습니다.
Cilia의 길이를 따라 ARL13B 강도의 변화는 ARL13B 강도가 왼쪽에 보이는 아크추아테 핵의 실륨 의 끝보다 기지에서 더 높은 곳뿐만 아니라 PVN, 오른쪽에 볼 수 있듯이 관찰되었다. 이 접근 방식을 사용하여 데이터를 분석할 때 실험 데이터 집합의 품질과 해상도가 AI를 학습하는 데 사용되는 데이터와 일치하는지 확인하는 것이 중요합니다. 이 방법의 주요 유틸리티는 AI에 의해 섬모를 감지 한 후, 사용자는 소프트웨어 내에 통합 된 분석 워크플로우를 사용자 정의하여 분석되는 속성에 대해 크리에이티브 할 수 있습니다.
