Name: staining the cytoplasmic ca2+ with fluo-4/am in apple pulp
Uploaded: 2021-11-06T13:00:00
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Questo lavoro è stato supportato dal progetto di miglioramento delle varietà agricole della provincia di Shandong (2019LZGC007) e dal team di innovazione degli alberi da frutto del moderno sistema tecnologico dell'industria agricola dello Shandong (SDAIT-06-05).

1. Estrazione di protoplasti
<ol><li>Preparare la soluzione di base: 20 mM CaCl2, 5 mM 2-(N-morfolino)acido etanosolfonico e 0,4 M D-sorbitolo. NOTA: il pH della soluzione di base è stato regolato a 5,8 con tampone Tris da 0,1 M, filtrato attraverso filtri solubili in acqua da 0,22 μm e conservato a 4 °C.</li>
	<li>Preparare la soluzione enzimatica: Mescolare lo 0,3% (p/v) di Macerozima R-10 e lo 0,5% (p/v) di cellulasi R-10 con la soluzione di base.</li>
	<li>Aggiungere 0,5 mL di solu...

<ol>
	<li>Hocking, B., Tyerman, S. D., Burton, R. A., Gilliham, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fruit+calcium:+Transport+and+physiology.">Fruit calcium: Transport and physiology.</a> Frontiers in Plant Science. 7, 569 (2016).</li><li>Li, J., Yang, H. -. q., Yan, T. -. l., Shu, H. -. r. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+indole+butyric+acid+on+the+transportation+of+stored+calcium+in+Malus+hupehensis+rhed.+Seedling.">Effect of indole butyric acid on the transportation of stored calcium in Malus hupehensis rhed. Seedling.</a> Agricultural Sciences in China. 5 (11), 834-838 (2006).</li><li>Gao, Q., Xiong, T., Li, X., Chen, W., Zhu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+and+calcium+sensors+in+fruit+development+and+ripening.">Calcium and calcium sensors in fruit development and ripening.</a> Scientia Horticulturae. 253, 412-421 (2019).</li><li>Barrett, D. M., Beaulieu, J. C., Shewfelt, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Color,+flavor,+texture,+and+nutritional+quality+of+fresh-cut+fruits+and+vegetables:+desirable+levels,+instrumental+and+sensory+measurement,+and+the+effects+of+processing.">Color, flavor, texture, and nutritional quality of fresh-cut fruits and vegetables: desirable levels, instrumental and sensory measurement, and the effects of processing.</a> Critical Reviews in Food Science and Nutrition. 50 (5), 369-389 (2010).</li><li>Deell, J. R., Khanizadeh, S., Saad, F., Ferree, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factors+affecting+apple+fruit+firmness--a+review.">Factors affecting apple fruit firmness--a review.</a> Journal- American Pomological Society. 55 (1), 8-27 (2001).</li><li>Johnston, J., Hewett, E., Hertog, M. A. T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postharvest+softening+of+apple+(Malus+domestica)+fruit:+A+review.">Postharvest softening of apple (Malus domestica) fruit: A review.</a> New Zealand Journal of Experimental Agriculture. 30 (3), 145-160 (2002).</li><li>Demidchik, V., Shabala, S., Isayenkov, S., Cuin, T. A., Pottosin, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+transport+across+plant+membranes:+mechanisms+and+functions.">Calcium transport across plant membranes: mechanisms and functions.</a> New Phytologist. 220 (1), 49-69 (2018).</li><li>Miqueloto, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+regulating+fruit+calcium+content+and+susceptibility+to+bitter+pit+in+cultivars+of+apple.">Mechanisms regulating fruit calcium content and susceptibility to bitter pit in cultivars of apple.</a> Acta horticulturae. 1194 (1194), 469-474 (2018).</li><li>Kou, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+CaCl2+dipping+and+pullulan+coating+on+the+development+of+brown+spot+on+'Huangguan'+pears+during+cold+storage.">Effects of CaCl2 dipping and pullulan coating on the development of brown spot on 'Huangguan' pears during cold storage.</a> Postharvest Biology and Technology. 99, 63-72 (2015).</li><li>Vinh, T. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+on+blossom-end+rot+incidence+in+two+tomato+cultivars+in+relation+to+calcium+nutrition+and+fruit+growth.">Comparative analysis on blossom-end rot incidence in two tomato cultivars in relation to calcium nutrition and fruit growth.</a> The Horticulture Journal. 87 (1), 97-105 (2018).</li><li>Yamane, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Foliar+calcium+applications+for+controlling+fruit+disorders+and+storage+life+in+deciduous+fruit+trees.">Foliar calcium applications for controlling fruit disorders and storage life in deciduous fruit trees.</a> Japan Agricultural Research Quarterly. 48 (1), 29-33 (2014).</li><li>Grienberger, C., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+calcium+in+neurons.">Imaging calcium in neurons.</a> Neuron. 73 (5), 862-885 (2012).</li><li>Bootman, M. D., Rietdorf, K., Collins, T. J., Walker, S., Sanderson, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca2+-sensitive+fluorescent+dyes+and+intracellular+Ca2++imaging.">Ca2+-sensitive fluorescent dyes and intracellular Ca2+ imaging.</a> CSH Protocols. 2013 (2), 83 (2013).</li><li>Hirabayashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+practical+red+fluorescent+probe+for+cytoplasmic+calcium+ions+with+greatly+improved+cell-membrane+permeability.">Development of practical red fluorescent probe for cytoplasmic calcium ions with greatly improved cell-membrane permeability.</a> Cell Calcium. 60 (4), 256-265 (2016).</li><li>Krebs, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FRET-based+genetically+encoded+sensors+allow+high-resolution+live+cell+imaging+of+Ca(2)(+)+dynamics.">FRET-based genetically encoded sensors allow high-resolution live cell imaging of Ca(2)(+) dynamics.</a> Plant Journal. 69 (1), 181-192 (2012).</li><li>Zhao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+expanded+palette+of+genetically+encoded+Ca(2)(+)+indicators.">An expanded palette of genetically encoded Ca(2)(+) indicators.</a> Science. 333 (2), 1888-1891 (2011).</li><li>Gee, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+and+physiological+characterization+of+fluo-4+Ca2+-indicator+dyes.">Chemical and physiological characterization of fluo-4 Ca2+-indicator dyes.</a> Cell Calcium. 27 (2), 97-106 (2000).</li><li>Qu, H., Xing, W., Wu, F., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+inexpensive+method+of+loading+fluorescent+dye+into+pollen+tubes+and+root+hairs.">Rapid and inexpensive method of loading fluorescent dye into pollen tubes and root hairs.</a> PLoS One. 11, 0152320 (2016).</li><li>Suwi&#324;ska, A., Was&#261;g, P., Zakrzewski, P., Lenartowska, M., Lenartowski, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calreticulin+is+required+for+calcium+homeostasis+and+proper+pollen+tube+tip+growth+in+Petunia.">Calreticulin is required for calcium homeostasis and proper pollen tube tip growth in Petunia.</a> Planta. 245 (5), 909-926 (2017).</li><li>Sun, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NADK2+positively+modulates+abscisic+acid-induced+stomatal+closure+by+affecting+accumulation+of+H2O2,+Ca2++and+nitric+oxide+in+Arabidopsis+guard+cells.">NADK2 positively modulates abscisic acid-induced stomatal closure by affecting accumulation of H2O2, Ca2+ and nitric oxide in Arabidopsis guard cells.</a> Plant Science. 262, 81-90 (2017).</li><li>Niu, Y. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnesium+availability+regulates+the+development+of+root+hairs+in+Arabidopsis+thaliana+(L.)+Heynh.">Magnesium availability regulates the development of root hairs in Arabidopsis thaliana (L.) Heynh.</a> Plant Cell and Environment. 37 (12), 2795-2813 (2014).</li><li>Qiu, L., Wang, Y., Qu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loading+calcium+fluorescent+probes+into+protoplasts+to+detect+calcium+in+the+flesh+tissue+cells+of+Malus+domestica.">Loading calcium fluorescent probes into protoplasts to detect calcium in the flesh tissue cells of Malus domestica.</a> Horticulture Research. 7, 91 (2020).</li><li>Boyer, J., Liu, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apple+phytochemicals+and+their+health+benefits.">Apple phytochemicals and their health benefits.</a> Nutrition Journal. 3 (1), 5 (2004).</li><li>Takahashi, A., Camacho, P., Lechleiter, J. D., Herman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+intracellular+calcium.">Measurement of intracellular calcium.</a> Physiological Reviews. 79 (4), 1089-1125 (1999).</li><li>Qu, H., Shang, Z., Zhang, S., Liu, L., Wu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+hyperpolarization-activated+calcium+channels+in+apical+pollen+tubes+of+Pyrus+pyrifolia.">Identification of hyperpolarization-activated calcium channels in apical pollen tubes of Pyrus pyrifolia.</a> New Phytologist. 174 (3), 524-536 (2007).</li><li>Hadjantonakis, A. K., Pisano, E., Papaioannou, V. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tbx6+regulates+left/right+patterning+in+mouse+embryos+through+effects+on+nodal+cilia+and+perinodal+signaling.">Tbx6 regulates left/right patterning in mouse embryos through effects on nodal cilia and perinodal signaling.</a> PLoS One. 3 (6), 2511 (2008).</li><li>DeSimone, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+taste+receptor+cell+[Ca2+]i+modulate+chorda+tympani+responses+to+salty+and+sour+taste+stimuli.">Changes in taste receptor cell [Ca2+]i modulate chorda tympani responses to salty and sour taste stimuli.</a> Journal of Neurophysiology. 108 (12), 3206-3220 (2012).</li><li>Kao, J. P., Harootunian, A. T., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photochemically+generated+cytosolic+calcium+pulses+and+their+detection+by+fluo-3.">Photochemically generated cytosolic calcium pulses and their detection by fluo-3.</a> Journal of Biological Chemistry. 264 (14), 8179-8184 (1989).</li><li>Merritt, J. E., Mccarthy, S. A., Davies, M., Moores, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+fluo-3+to+measure+cytosolic+Ca2++in+platelets+and+neutrophils.+Loading+cells+with+the+dye,+calibration+of+traces,+measurements+in+the+presence+of+plasma,+and+buffering+of+cytosolic+Ca2.">Use of fluo-3 to measure cytosolic Ca2+ in platelets and neutrophils. Loading cells with the dye, calibration of traces, measurements in the presence of plasma, and buffering of cytosolic Ca2.</a> Biochemical Journal. 269 (2), 513-519 (1990).</li><li>Li, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparative+study+on+Ca+content+and+distribution+in+two+Gesneriaceae+species+reveals+distinctive+mechanisms+to+cope+with+high+rhizospheric+soluble+calcium.">A comparative study on Ca content and distribution in two Gesneriaceae species reveals distinctive mechanisms to cope with high rhizospheric soluble calcium.</a> Frontiers in Plant Science. 5 (5), 647 (2014).</li><li>Zhang, W., Rengel, Z., Kuo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+intracellular+Ca2++in+cells+of+intact+wheat+roots:+loading+of+acetoxymethyl+ester+of+Fluo-3+under+low+temperature.">Determination of intracellular Ca2+ in cells of intact wheat roots: loading of acetoxymethyl ester of Fluo-3 under low temperature.</a> Plant Journal. 15 (1), 147-151 (1998).</li><li>Qu, H., Jiang, X., Shi, Z., Liu, L., Zhang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+loading+ester+fluorescent+Ca2++and+pH+indicators+into+pollen+of+Pyrus+pyrifolia.">Fast loading ester fluorescent Ca2+ and pH indicators into pollen of Pyrus pyrifolia.</a> Journal of Plant Research. 125 (1), 185-195 (2012).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+actin+filaments+induces+mitochondrial+Ca2++release+to+the+cytoplasm+and+[Ca2+]c+changes+in+Arabidopsis.+root+hairs.">Disruption of actin filaments induces mitochondrial Ca2+ release to the cytoplasm and [Ca2+]c changes in Arabidopsis. root hairs.</a> BMC Plant Biology. 10, 53 (2010).</li><li>Fujimori, T., Jencks, W. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lanthanum+inhibits+steady-state+turnover+of+the+sarcoplasmic+reticulum+calcium+ATPase+by+replacing+magnesium+as+the+catalytic+ion.">Lanthanum inhibits steady-state turnover of the sarcoplasmic reticulum calcium ATPase by replacing magnesium as the catalytic ion.</a> Journal of Biological Chemistry. 265 (27), 16262-16270 (1990).</li></ol>

In questo studio, protoplasti vitali sono stati ottenuti mediante idrolisi enzimatica. Si noti che questo metodo richiede mele fresche. Il presente protocollo consente il rapido isolamento di un gran numero di protoplasti dalla polpa di frutta per l'uso in studi di ricerca. L'applicabilità di questo metodo non è limitata a 'Fuji'; anche i protoplasti della polpa di mela di 'Dounan' e 'Honey Crisp' possono essere estratti attraverso lo stesso protocollo (Figura supplementare S4). La soluzione di protopl...

Ca2+ svolge un ruolo importante nella trasduzione del segnale vegetale e nel metabolismo1,2. Inoltre, regola i tratti di qualità della frutta3,4, tra cui durezza, contenuto di zucchero e suscettibilità a disturbi fisiologici durante la conservazione5,6. Il Ca2+ citoplasmatico svolge un ruolo importante nella trasduzione del segnale e regola la crescita e lo sviluppo delle piante7. Il disturbo dell'omeostasi cellulare del calcio può indurre la fossa amara nelle mele8, la malattia delle macchie marroni nelle pere9e il marciume ombelicale nei pomodori10, influenzando la qualità della frutta e causando gravi perdite economiche3,11. L'imaging del calcio ha una risoluzione spaziale e temporale sufficiente ed è un metodo importante per osservare la dinamica di Ca2+ nelle cellule viventi12,13.
Allo stato attuale, ci sono due metodi principali per l'imaging intracellulare del calcio nelle cellule vive: uno impiega sonde fluorescenti chimiche a piccole molecole14e l'altro è il sensore di codifica genica (GECI)15,16. Data la difficoltà di stabilire un sistema transgenico stabile negli alberi da frutto e uno sviluppo più lungo dei frutti, GECIS non è adatto per l'imaging a fluorescenza Ca2+ della frutta.
Le sonde fluorescenti a piccole molecole come Fluo-4 / AM hanno un vantaggio particolare: la loro forma di estere AM (derivato dell'estere acetoximetilico permeabile alle cellule) può essere facilmente caricata in massa nelle cellule viventi senza la necessità di trasfezione, il che la rende flessibile, rapida e non citotossica17. Fluo-4 / AM potrebbe essere caricato con successo nel tubo pollinico di Pyrus pyrifolia18 e Petunia,19 così come nelle cellule di guardia20 e nei capelli radicali di Arabidopsis21.
Allo stato attuale, ci sono pochi rapporti sulla colorazione a fluorescenza di calcio delle cellule della polpa22. Come importante elemento minerale, il calcio svolge un ruolo chiave nella crescita e nel controllo di qualità dei frutti degli alberi come le mele. I meli sono riconosciuti a livello mondiale come un'importante specie economica e le mele sono considerate un alimento sano23. In questo studio, abbiamo ottenuto protoplasti vitali dalla polpa del frutto della mela attraverso l'idrolisi enzimatica e poi caricato reagenti fluorescenti a piccole molecole nel citoplasma per rilevare Ca2 +.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10&#215; phosphate-buffered saline</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>P1022</td>
			<td>PBS (phosphate buffered solution) is a phosphate buffer solution, which can provide a relatively stable ionic environment and pH buffering capacity. It is a buffer salt solution often used in biology for molecular cloning and cell culture. The pH is 7.4.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>M8010</td>
			<td>Biological buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2&#183;2H2O</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>C8370</td>
			<td>Calcium chloride dihydrate is a white or gray chemical, mostly in granular form.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellulase R-10</td>
			<td>Yakult Honsha</td>
			<td>MX7352</td>
			<td>Degrade plant cell walls.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-sorbitol</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>S8090</td>
			<td>It has good moisturizing properties, prevents drying, and prevents sugar, salt, etc. from crystallizing.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F-127</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>P6867</td>
			<td>Pluronic F-127 is a non-ionic, surfactant polyol (molecular weight of approximately 12500 Daltons), which has been found to be beneficial to promote the dissolution of water-insoluble dyes and other materials in physiological media.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FDA</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>F1303</td>
			<td>FDA is a cell-permeant esterase substrate that can serve as a viability probe that measures both enzymatic activity, which is require to activate its fluorescence, and cell-membrane integrity, which is required for intracellular retention of their fluorescent product.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluo-4/AM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>F14201</td>
			<td>The green fluorescent calcium indicator Fluo-4/AM is an improved version of the calcium indicator Fluo-3/AM. The Fluo-4/AM loads faster and is brighter at the same concentration. It can be well excited with a 488 nm argon ion laser.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>EVOS Auto 2</td>
			<td>Observe the fluorescence image.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Macerozyme R-10</td>
			<td>Yakult Honsha</td>
			<td>MX7351</td>
			<td>Degrade plant tissue to separate single cells.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>T8060</td>
			<td>It is widely used in the preparation of buffers in biochemistry and molecular biology experiments.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

staining the cytoplasmic ca2+ with fluo-4/am in apple pulp

Cytosolic Ca2+ svolge un ruolo chiave nello sviluppo delle piante. L'imaging del calcio è il metodo più versatile per rilevare i cambiamenti dinamici nel Ca2+ nel citoplasma. In questo studio, abbiamo ottenuto protoplasti vitali di cellule pulpare mediante idrolisi enzimatica. I protoplasti isolati sono stati incubati con il reagente fluorescente a piccola molecola (Fluo-4/AM) per 30 minuti a 37 °C. Le sonde fluorescenti hanno colorato con successo il catosolico Ca2+ ma non si sono accumulate nei vacuoli. La3+,un bloccante dei canali Ca2+, ha diminuito l'intensità della fluorescenza citoplasmatica. Questi risultati suggeriscono che Fluo-4 / AM può essere utilizzato per rilevare cambiamenti nel Ca2 + citosolico nella polpa del frutto. In sintesi, presentiamo un metodo per isolare efficacemente i protoplasti dalle cellule carnise del frutto e rilevare Ca2+ caricando un reagente fluorescente di calcio a piccola molecola nel citoplasma delle cellule della polpa.

Seguendo il protocollo sopra descritto, abbiamo utilizzato il metodo enzimatico per ottenere protoplasti vitali dalla polpa (Figura 1). Alcuni protoplasti avevano vacuoli, mentre altri no. Mentre i protoplasti non hanno mostrato fluorescenza quando l'indicatore fluorescente Ca2 + non è stato caricato in essi. Quando Fluo-4/AM è stato caricato nei protoplasti, il citoplasma, ma non il vacuolo, è diventato fluorescente (Figura 2). Questo risultato ha...

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Staining the Cytoplasmic Ca2+ with Fluo-4/AM in Apple Pulp

Protoplasti isolati di cellule di polpa di mela sono stati caricati con un reagente fluorescente di calcio per rilevare la concentrazione citoplasmatica di Ca2+.

Colorazione del Citoplasmatico Ca2+ con Fluo-4/AM in Polpa di Mela

Cytosolic Ca2+ plays a key role in plant development. Calcium imaging is the most versatile method to detect dynamic changes in Ca2+ in the cytoplasm. In ...

Come importante elemento minerale, il calcio svolge un ruolo chiave nella crescita e nel controllo di qualità dei frutti degli alberi come la mela, può regolare la durezza, il contenuto di zucchero, il periodo di conservazione e il disturbo fisiologico durante la conservazione. L'imaging del calcio è il metodo più occidentale per rilevare i cambiamenti dinamici negli ioni calcio nel citoplasma. Gli indicatori fluorescenti a piccole molecole, come fluo-4 / AM hanno una selettività specifica dello ione calcio e possono essere caricati in modo non invasivo mediante incubazione dell'esterificazione, che è flessibile, rapida e non citotossica.Questo protocollo introdurrà un metodo per caricare il reagente fluorescente chimico a piccole molecole fluo-4/AM nei protoplasti vegetali. Estrazione di protoplasti Aggiungere 0,5 millilitro di soluzione enzimatica in un tubo centrifugo da 1,5 millilitro. Scegli una mela sana e matura, quindi affetta la polpa in 10 volte 5 volte 1 millilitro cubo.Posizionare i pezzi di polpa in soluzione enzimatica, quindi chiudere il tubo. Incubare il tubo a 28 gradi per un'ora. Baraccato a 70 giri al buio.Successivamente, lavare i pezzi di polpa, aspirare tutta la soluzione enzimatica e quindi aggiungere una soluzione di base da 0,5 millilitro. Centrifugare ad una velocità di 300 g per 2 minuti. La sospensione di Protoplasts può essere ottenuta aspirando la soluzione inferiore.Colorazione del reagente di fluorescenza chimica a piccola molecola. Preparare la soluzione di carico fluo-4/AM con un fluo-4/AM da 2 millimolari, il 20% di etile127 e la soluzione salina tamponata con fosfato 10X in un rapporto uno a uno a due. Aggiungere 1 soluzione di carico di microlitro di fluo-4/AM a 99 microlitteri protoplasto sospensione.La concentrazione finale di coloranti fluorescenti è di 5 micromolari. Mescolare la soluzione, quindi chiudere il tubo. Allo stesso tempo, ferro lantanio il calcio o l'unicità del piccolo agente fluorescente chimico molecolare.Aggiungere un microlitro o 10 microlitri in più di ferro lantanio e poi una soluzione di carico di microlitro di fluo-4/AM a 98 microlitri protoplasti sospensione. La concentrazione finale di ferro lantanio è di 100 micromolari. Mescolare la soluzione, quindi chiudere il tubo.Incubare a 37 gradi per 30 minuti al buio. Successivamente, centrifugare alla velocità di 300 G per due minuti. Aspirare fino a 17 microlitri e aggiungere una soluzione di base da 17 microlitri.Incubare la sospensione del protoplasto a 37 gradi per 30 minuti a completamente Dopodiché, aspirare la sospensione di protoplasti da 50 microlitri e gocciolare su un vetrino. Osservare al microscopio a fluorescenza. Selezionare il 20x l'ingrandimento e il canale GFP da osservare.Regolare uniformemente la luminosità a 0,5. Un passo fondamentale in questo metodo proposto è quello di lavare la macchia nei protoplasti e incubarli per 30 minuti. Un lavaggio insufficiente provoca un eccessivo sostegno sulla fluorescenza durante l'osservazione e l'incubazione consente un migliore carico o la sonda nel citoplasma.Protoplasts Viability Assay Prendere 99 microliter protoplasts sospensione dopo l'incubazione a 37 gradi per 30 minuti. Aggiungere 1 ml alla soluzione FD alla sospensione di protoplasti. Mescolare la soluzione pipettando su e giù più volte e quindi chiudere il tubo.Rimanere a temperatura ambiente per cinque minuti al buio. Preparare i vetrini e osservarli al microscopio a fluorescenza con canale GFP. Vi presentiamo i risultati Seguendo la prima figura.Usiamo il metodo enzimatico tutti ottenendo protoplasti dalla polpa. Alcuni protoplasti avevano un vacuolo mentre altri no. I protoplasti sono stati colorati con FD per cinque minuti e mostrano la fioritura nel citoplasma indicando che l'alta temperatura, 37 gradi non influisce sulla vitalità o sui protoplasti Figura due.I protoplasti non hanno mostrato fluorescenza in uno degli indicatori di fluorescenza dei ferri di calcio o non sono caricati in essi. Che in fluo-4 / AM è stato caricato nel protoplasto, il citoplasto, ma non un vacuolo è diventato fluorescente. I ferri di lantanio che bloccano efficacemente i canali del calcio sono la membrana cellulare sono stati aggiunti al carico fluo-4 / AM di Protoplast.Alla concentrazione finale di 100 ferri di lantanio micromolari riducono significativamente l'intensità della fluorescenza del calcio. Questi risultati hanno ulteriormente dimostrato che il fluo-4 / AM rimane efficacemente nei ferri di calcio nel citoplasto e mostra cambiamenti dinamici nel contenuto di ferro di calcio. Figura tre I risultati fluo-4/AM sono stati analizzati utilizzando la colorazione fluo-4/AM del software IMH approved plus 6.0 con aggiunta di ferri lantanio che ha ridotto significativamente il valore di florescenza dei ferri da calcio citoplasmatici.In questo video, tutti i protoplasti sono stati ottenuti per idrolisi enzimatica. Abbiamo caricato con successo le sonde fluorescenti in un protoplasto a 37 gradi. Inoltre, il metodo non ha influenzato la vitalità dei protoplasti.In sintesi, il metodo qui descritto in natura dettagliato. I cambiamenti dinamici negli ioni calcio citoplasmatico nelle cellule della polpa di mela forniscono così 10 supporti uguali per l'ulteriore scopo di studi relativi al calcio.

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