Name: staining the cytoplasmic ca2+ with fluo-4/am in apple pulp
Uploaded: 2021-11-06T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Staining the Cytoplasmic Ca2+ with Fluo-4/AM in Apple Pulp at JoVE.com

Эта работа была поддержана Проектом по улучшению сельскохозяйственных сортов провинции Шаньдун (2019LZGC007) и инновационной командой по выращиванию фруктовых деревьев современной технологической системы сельскохозяйственной промышленности Шаньдуна (SDAIT-06-05).

1. Экстракция протопластов
<ol><li>Готовят основной раствор: 20 мМ CaCl2,5 мМ2-(N-морфолино)этансульфоновой кислоты и 0,4 М D-сорбита. ПРИМЕЧАНИЕ: РН основного раствора доводили до 5,8 с буфером 0,1 М Триса, фильтроввали через водорастворимые фильтры 0,22 мкм и хранили при 4°С.</li>
	<li>Приг...

<ol>
	<li>Hocking, B., Tyerman, S. D., Burton, R. A., Gilliham, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fruit+calcium:+Transport+and+physiology.">Fruit calcium: Transport and physiology.</a> Frontiers in Plant Science. 7, 569 (2016).</li><li>Li, J., Yang, H. -. q., Yan, T. -. l., Shu, H. -. r. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+indole+butyric+acid+on+the+transportation+of+stored+calcium+in+Malus+hupehensis+rhed.+Seedling.">Effect of indole butyric acid on the transportation of stored calcium in Malus hupehensis rhed. Seedling.</a> Agricultural Sciences in China. 5 (11), 834-838 (2006).</li><li>Gao, Q., Xiong, T., Li, X., Chen, W., Zhu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+and+calcium+sensors+in+fruit+development+and+ripening.">Calcium and calcium sensors in fruit development and ripening.</a> Scientia Horticulturae. 253, 412-421 (2019).</li><li>Barrett, D. M., Beaulieu, J. C., Shewfelt, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Color,+flavor,+texture,+and+nutritional+quality+of+fresh-cut+fruits+and+vegetables:+desirable+levels,+instrumental+and+sensory+measurement,+and+the+effects+of+processing.">Color, flavor, texture, and nutritional quality of fresh-cut fruits and vegetables: desirable levels, instrumental and sensory measurement, and the effects of processing.</a> Critical Reviews in Food Science and Nutrition. 50 (5), 369-389 (2010).</li><li>Deell, J. R., Khanizadeh, S., Saad, F., Ferree, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factors+affecting+apple+fruit+firmness--a+review.">Factors affecting apple fruit firmness--a review.</a> Journal- American Pomological Society. 55 (1), 8-27 (2001).</li><li>Johnston, J., Hewett, E., Hertog, M. A. T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postharvest+softening+of+apple+(Malus+domestica)+fruit:+A+review.">Postharvest softening of apple (Malus domestica) fruit: A review.</a> New Zealand Journal of Experimental Agriculture. 30 (3), 145-160 (2002).</li><li>Demidchik, V., Shabala, S., Isayenkov, S., Cuin, T. A., Pottosin, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+transport+across+plant+membranes:+mechanisms+and+functions.">Calcium transport across plant membranes: mechanisms and functions.</a> New Phytologist. 220 (1), 49-69 (2018).</li><li>Miqueloto, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+regulating+fruit+calcium+content+and+susceptibility+to+bitter+pit+in+cultivars+of+apple.">Mechanisms regulating fruit calcium content and susceptibility to bitter pit in cultivars of apple.</a> Acta horticulturae. 1194 (1194), 469-474 (2018).</li><li>Kou, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+CaCl2+dipping+and+pullulan+coating+on+the+development+of+brown+spot+on+'Huangguan'+pears+during+cold+storage.">Effects of CaCl2 dipping and pullulan coating on the development of brown spot on 'Huangguan' pears during cold storage.</a> Postharvest Biology and Technology. 99, 63-72 (2015).</li><li>Vinh, T. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+on+blossom-end+rot+incidence+in+two+tomato+cultivars+in+relation+to+calcium+nutrition+and+fruit+growth.">Comparative analysis on blossom-end rot incidence in two tomato cultivars in relation to calcium nutrition and fruit growth.</a> The Horticulture Journal. 87 (1), 97-105 (2018).</li><li>Yamane, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Foliar+calcium+applications+for+controlling+fruit+disorders+and+storage+life+in+deciduous+fruit+trees.">Foliar calcium applications for controlling fruit disorders and storage life in deciduous fruit trees.</a> Japan Agricultural Research Quarterly. 48 (1), 29-33 (2014).</li><li>Grienberger, C., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+calcium+in+neurons.">Imaging calcium in neurons.</a> Neuron. 73 (5), 862-885 (2012).</li><li>Bootman, M. D., Rietdorf, K., Collins, T. J., Walker, S., Sanderson, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca2+-sensitive+fluorescent+dyes+and+intracellular+Ca2++imaging.">Ca2+-sensitive fluorescent dyes and intracellular Ca2+ imaging.</a> CSH Protocols. 2013 (2), 83 (2013).</li><li>Hirabayashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+practical+red+fluorescent+probe+for+cytoplasmic+calcium+ions+with+greatly+improved+cell-membrane+permeability.">Development of practical red fluorescent probe for cytoplasmic calcium ions with greatly improved cell-membrane permeability.</a> Cell Calcium. 60 (4), 256-265 (2016).</li><li>Krebs, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FRET-based+genetically+encoded+sensors+allow+high-resolution+live+cell+imaging+of+Ca(2)(+)+dynamics.">FRET-based genetically encoded sensors allow high-resolution live cell imaging of Ca(2)(+) dynamics.</a> Plant Journal. 69 (1), 181-192 (2012).</li><li>Zhao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+expanded+palette+of+genetically+encoded+Ca(2)(+)+indicators.">An expanded palette of genetically encoded Ca(2)(+) indicators.</a> Science. 333 (2), 1888-1891 (2011).</li><li>Gee, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+and+physiological+characterization+of+fluo-4+Ca2+-indicator+dyes.">Chemical and physiological characterization of fluo-4 Ca2+-indicator dyes.</a> Cell Calcium. 27 (2), 97-106 (2000).</li><li>Qu, H., Xing, W., Wu, F., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+inexpensive+method+of+loading+fluorescent+dye+into+pollen+tubes+and+root+hairs.">Rapid and inexpensive method of loading fluorescent dye into pollen tubes and root hairs.</a> PLoS One. 11, 0152320 (2016).</li><li>Suwi&#324;ska, A., Was&#261;g, P., Zakrzewski, P., Lenartowska, M., Lenartowski, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calreticulin+is+required+for+calcium+homeostasis+and+proper+pollen+tube+tip+growth+in+Petunia.">Calreticulin is required for calcium homeostasis and proper pollen tube tip growth in Petunia.</a> Planta. 245 (5), 909-926 (2017).</li><li>Sun, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NADK2+positively+modulates+abscisic+acid-induced+stomatal+closure+by+affecting+accumulation+of+H2O2,+Ca2++and+nitric+oxide+in+Arabidopsis+guard+cells.">NADK2 positively modulates abscisic acid-induced stomatal closure by affecting accumulation of H2O2, Ca2+ and nitric oxide in Arabidopsis guard cells.</a> Plant Science. 262, 81-90 (2017).</li><li>Niu, Y. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnesium+availability+regulates+the+development+of+root+hairs+in+Arabidopsis+thaliana+(L.)+Heynh.">Magnesium availability regulates the development of root hairs in Arabidopsis thaliana (L.) Heynh.</a> Plant Cell and Environment. 37 (12), 2795-2813 (2014).</li><li>Qiu, L., Wang, Y., Qu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loading+calcium+fluorescent+probes+into+protoplasts+to+detect+calcium+in+the+flesh+tissue+cells+of+Malus+domestica.">Loading calcium fluorescent probes into protoplasts to detect calcium in the flesh tissue cells of Malus domestica.</a> Horticulture Research. 7, 91 (2020).</li><li>Boyer, J., Liu, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apple+phytochemicals+and+their+health+benefits.">Apple phytochemicals and their health benefits.</a> Nutrition Journal. 3 (1), 5 (2004).</li><li>Takahashi, A., Camacho, P., Lechleiter, J. D., Herman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+intracellular+calcium.">Measurement of intracellular calcium.</a> Physiological Reviews. 79 (4), 1089-1125 (1999).</li><li>Qu, H., Shang, Z., Zhang, S., Liu, L., Wu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+hyperpolarization-activated+calcium+channels+in+apical+pollen+tubes+of+Pyrus+pyrifolia.">Identification of hyperpolarization-activated calcium channels in apical pollen tubes of Pyrus pyrifolia.</a> New Phytologist. 174 (3), 524-536 (2007).</li><li>Hadjantonakis, A. K., Pisano, E., Papaioannou, V. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tbx6+regulates+left/right+patterning+in+mouse+embryos+through+effects+on+nodal+cilia+and+perinodal+signaling.">Tbx6 regulates left/right patterning in mouse embryos through effects on nodal cilia and perinodal signaling.</a> PLoS One. 3 (6), 2511 (2008).</li><li>DeSimone, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+taste+receptor+cell+[Ca2+]i+modulate+chorda+tympani+responses+to+salty+and+sour+taste+stimuli.">Changes in taste receptor cell [Ca2+]i modulate chorda tympani responses to salty and sour taste stimuli.</a> Journal of Neurophysiology. 108 (12), 3206-3220 (2012).</li><li>Kao, J. P., Harootunian, A. T., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photochemically+generated+cytosolic+calcium+pulses+and+their+detection+by+fluo-3.">Photochemically generated cytosolic calcium pulses and their detection by fluo-3.</a> Journal of Biological Chemistry. 264 (14), 8179-8184 (1989).</li><li>Merritt, J. E., Mccarthy, S. A., Davies, M., Moores, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+fluo-3+to+measure+cytosolic+Ca2++in+platelets+and+neutrophils.+Loading+cells+with+the+dye,+calibration+of+traces,+measurements+in+the+presence+of+plasma,+and+buffering+of+cytosolic+Ca2.">Use of fluo-3 to measure cytosolic Ca2+ in platelets and neutrophils. Loading cells with the dye, calibration of traces, measurements in the presence of plasma, and buffering of cytosolic Ca2.</a> Biochemical Journal. 269 (2), 513-519 (1990).</li><li>Li, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparative+study+on+Ca+content+and+distribution+in+two+Gesneriaceae+species+reveals+distinctive+mechanisms+to+cope+with+high+rhizospheric+soluble+calcium.">A comparative study on Ca content and distribution in two Gesneriaceae species reveals distinctive mechanisms to cope with high rhizospheric soluble calcium.</a> Frontiers in Plant Science. 5 (5), 647 (2014).</li><li>Zhang, W., Rengel, Z., Kuo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+intracellular+Ca2++in+cells+of+intact+wheat+roots:+loading+of+acetoxymethyl+ester+of+Fluo-3+under+low+temperature.">Determination of intracellular Ca2+ in cells of intact wheat roots: loading of acetoxymethyl ester of Fluo-3 under low temperature.</a> Plant Journal. 15 (1), 147-151 (1998).</li><li>Qu, H., Jiang, X., Shi, Z., Liu, L., Zhang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+loading+ester+fluorescent+Ca2++and+pH+indicators+into+pollen+of+Pyrus+pyrifolia.">Fast loading ester fluorescent Ca2+ and pH indicators into pollen of Pyrus pyrifolia.</a> Journal of Plant Research. 125 (1), 185-195 (2012).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+actin+filaments+induces+mitochondrial+Ca2++release+to+the+cytoplasm+and+[Ca2+]c+changes+in+Arabidopsis.+root+hairs.">Disruption of actin filaments induces mitochondrial Ca2+ release to the cytoplasm and [Ca2+]c changes in Arabidopsis. root hairs.</a> BMC Plant Biology. 10, 53 (2010).</li><li>Fujimori, T., Jencks, W. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lanthanum+inhibits+steady-state+turnover+of+the+sarcoplasmic+reticulum+calcium+ATPase+by+replacing+magnesium+as+the+catalytic+ion.">Lanthanum inhibits steady-state turnover of the sarcoplasmic reticulum calcium ATPase by replacing magnesium as the catalytic ion.</a> Journal of Biological Chemistry. 265 (27), 16262-16270 (1990).</li></ol>

В этом исследовании жизнеспособные протопласты были получены ферментативным гидролизом. Отметим, что для этого способа требуются свежие яблоки. Настоящий протокол позволяет быстро изолировать большое количество протопластов из мякоти плодов для использования в научных исследовани?...

Ca2+ играет важную роль в трансдукции сигналов растений иметаболизме 1,2. Кроме того, он регулирует признаки качества плодов3,4,включая твердость, содержание сахара и восприимчивость к физиологическим нарушениям при хранении5,6. Цитоплазматический Ca2+ играет важную роль в сигнальной трансдукции и регулирует рост и развитие растений7. Нарушение клеточного гомеостаза кальция может вызвать горькую косточку в яблоках8,заболевание коричневых пятн у груш9и пуповинную гниль у томатов10,влияющих на качество плодов и вызывающих серьезные экономические потери3,11. Кальциевая визуализация имеет достаточное пространственное и временное разрешение и является важным методом наблюдения динамики Ca2+ в живых клетках12,13.
В настоящее время существует два основных метода внутриклеточной визуализации кальция в живых клетках: один использует химические маломолекулярные флуоресцентные зонды14,а другой - датчик кодирования генов (GECI)15,16. Учитывая сложность создания стабильной трансгенной системы у фруктовых деревьев и более длительное развитие плодов, GECIS не подходит для флуоресцентной визуализации фруктов Ca2+.
Маломолекулярные флуоресцентные зонды, такие как Fluo-4/ AM, имеют особое преимущество: их форма эфира AM (проницаемое в клетки производное ацетоксиметилового эфира) может быть легко загружена массой в живые клетки без необходимости трансфекции, что делает его гибким, быстрым и нецитотоксичным17. Fluo-4/AM может быть успешно загружен в пыльцевую трубку Pyrus pyrifolia18 и Petunia,19, а также в защитные клетки20 и корневые волосы Arabidopsis21.
В настоящее время имеется мало сообщений о окрашивание кальциевой флуоресценцией клетокпульпы 22. Как важный минеральный элемент, кальций играет ключевую роль в росте и контроле качества плодов деревьев, таких как яблоки. Яблони признаны во всем мире важным экономическим видом, а яблоки считаются здоровой пищей23. В этом исследовании мы получили жизнеспособные протопласты из мякоти плодов яблок путем ферментативного гидролиза, а затем загрузили маломолекулярные флуоресцентные реагенты в цитоплазму для обнаружения Ca2+.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10&#215; phosphate-buffered saline</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>P1022</td>
			<td>PBS (phosphate buffered solution) is a phosphate buffer solution, which can provide a relatively stable ionic environment and pH buffering capacity. It is a buffer salt solution often used in biology for molecular cloning and cell culture. The pH is 7.4.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>M8010</td>
			<td>Biological buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2&#183;2H2O</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>C8370</td>
			<td>Calcium chloride dihydrate is a white or gray chemical, mostly in granular form.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellulase R-10</td>
			<td>Yakult Honsha</td>
			<td>MX7352</td>
			<td>Degrade plant cell walls.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-sorbitol</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>S8090</td>
			<td>It has good moisturizing properties, prevents drying, and prevents sugar, salt, etc. from crystallizing.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F-127</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>P6867</td>
			<td>Pluronic F-127 is a non-ionic, surfactant polyol (molecular weight of approximately 12500 Daltons), which has been found to be beneficial to promote the dissolution of water-insoluble dyes and other materials in physiological media.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FDA</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>F1303</td>
			<td>FDA is a cell-permeant esterase substrate that can serve as a viability probe that measures both enzymatic activity, which is require to activate its fluorescence, and cell-membrane integrity, which is required for intracellular retention of their fluorescent product.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluo-4/AM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>F14201</td>
			<td>The green fluorescent calcium indicator Fluo-4/AM is an improved version of the calcium indicator Fluo-3/AM. The Fluo-4/AM loads faster and is brighter at the same concentration. It can be well excited with a 488 nm argon ion laser.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>EVOS Auto 2</td>
			<td>Observe the fluorescence image.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Macerozyme R-10</td>
			<td>Yakult Honsha</td>
			<td>MX7351</td>
			<td>Degrade plant tissue to separate single cells.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>T8060</td>
			<td>It is widely used in the preparation of buffers in biochemistry and molecular biology experiments.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

staining the cytoplasmic ca2+ with fluo-4/am in apple pulp

Цитозольный Ca2+ играет ключевую роль в развитии растений. Кальциевая визуализация является наиболее универсальным методом обнаружения динамических изменений Ca2+ в цитоплазме. В этом исследовании мы получили жизнеспособные протопласты клеток пульпы путем ферментативного гидролиза. Изолированные протопласты инкубировали с маломолекулярным флуоресцентным реагентом (Fluo-4/AM) в течение 30 мин при 37 °C. Флуоресцентные зонды успешно окрашивали цитозольный Ca2+, но не накапливались в вакуолях. La3+,блокатор каналов Ca2+, снижение интенсивности цитоплазматической флуоресценции. Эти результаты свидетельствуют о том, что Fluo-4/AM может быть использован для обнаружения изменений цитозольного Ca2+ в мякоти плода. Таким образом, мы представляем метод эффективного выделения протопластов из клеток мякоти плода и обнаружения Ca2+ путем загрузки маломолекулярного флуоресцентного реагента кальция в цитоплазму клеток пульпы.

Следуя описанному выше протоколу, мы использовали ферментативный метод для получения жизнеспособных протопластов из пульпы(рисунок 1). Некоторые протопласты имели вакуоли, в то время как другие этого не делали. В то время как протопласты не проявляли флуоресценции, ког?...

Watch this Scientific Journal Video about Staining the Cytoplasmic Ca2+ with Fluo-4/AM in Apple Pulp at JoVE.com

Staining the Cytoplasmic Ca2+ with Fluo-4/AM in Apple Pulp

Изолированные протопласты клеток яблочной мякоти нагружали флуоресцентным реагентом кальция для обнаружения цитоплазматической концентрации Ca2+.

Окрашивание цитоплазматического Ca2+ с fluo-4/AM в яблочной мякоти

Cytosolic Ca2+ plays a key role in plant development. Calcium imaging is the most versatile method to detect dynamic changes in Ca2+ in the cytoplasm. In ...

Как важный минеральный элемент, кальций играет ключевую роль в росте и контроле качества плодов деревьев, таких как яблоко, он может регулировать жесткость, содержание сахара, срок хранения и физиологическое расстройство во время хранения. Визуализация кальция является наиболее западным методом обнаружения динамических изменений ионов кальция в цитоплазме. Маломолекулярные флуоресцентные индикаторы, такие как флуо-4/AM, обладают селективностью, специфичной для ионов кальция, и могут быть неинвазивно загружены путем этерификационной инкубации, которая является гибкой, быстрой и нецитотоксичной.Этот протокол введет метод загрузки маломолекулярного химического флуоресцентного реагента fluo-4/AM в протопласты растений. Экстракция протопласта Добавьте 0,5 миллилитра раствора фермента в 1,5-миллилитровую центрифужную трубку. Выберите здоровое и спелое яблоко, затем нарежьте мякоть в 10 раз 5 раз по 1 кубический миллилитр.Поместите кусочки мякоти в ферментативный раствор, затем закройте трубку. Инкубировать трубку при 28 градусах в течение одного часа. Забит при 70 об/мин в темноте.После этого промыть кусочки мякоти, аспирировать весь ферментативный раствор и затем добавить 0,5 миллилитра основного раствора. Центрифуга со скоростью 300 г в течение 2 мин. Суспензию протопластов можно получить путем аспирации нижнего раствора.Окрашивание маломолекулярного химического флуоресцентного реагента. Приготовьте раствор для загрузки флуо-4/AM с 2 миллимолярными флуо-4/AM, 20%этил127 и 10X фосфат-буферным физиологическим раствором в соотношении один к одному к двум. Добавьте 1 микролитр нагрузочного раствора флуо-4/AM к 99 микролитрам суспензии протопласта.Конечная концентрация флуоресцентных красителей составляет 5 микромолярной. Перемешайте раствор, затем закройте трубку. В то же время железо лантана является кальцием или уникальностью мелкомолекулярного химического флуоресцентного агента.Добавьте еще один микролитр или еще 10 микролитр железа лантана, а затем один микролитр нагрузочного раствора флуо-4/AM до 98 микролитровой суспензии протопластов. Конечная концентрация железа лантана составляет 100 микромолярной. Перемешайте раствор, затем закройте трубку.Инкубировать при 37 градусах в течение 30 минут в темноте. После этого центрифугируют со скоростью 300 G в течение двух минут. Аспирировать до 17 микролитров раствора и добавить 17 микролитр основного раствора.Инкубируют суспензию протопласта при 37 градусах в течение 30 минут до полного после этого аспирируют 50 микролитров суспензии протопластов и капают на горку. Наблюдать под флуоресцентной микроскопом. Выберите 20-кратное увеличение и канал GFP для наблюдения.Равномерно отрегулируйте яркость до 0,5. Критическим этапом в этом предложенном способе является промывка пятна в протопластах и инкубирование их в течение 30 минут. Недостаточная промывка вызывает чрезмерную флуоресценцию во время наблюдения, а инкубация позволяет лучше загрузить зонд в цитоплазму.Протопопласты Анализ жизнеспособности Берут 99 микролитров суспензии протопластов после инкубации при 37 градусах в течение 30 минут. Добавьте 1 мл в раствор FD к суспензии протопластов. Перемешайте раствор, несколько раз пипетируя вверх и вниз, а затем закройте трубку.Оставайтесь при комнатной температуре в течение пяти минут в темноте. Подготовьте слайды и наблюдайте за ними на флуоресцентной микроскопе с каналом GFP. Представляем вам результаты На следующем рисунке один.Мы используем ферментативный метод, все получение протопластов из пульпы. У некоторых протопластов была вакуоль, в то время как у других ее не было. Протопласты окрашивали ФД в течение пяти минут и показывали флуоресценцию в цитоплазме, указывая на то, что высокая температура, 37 градусов не влияет на жизнеспособность или протопласты Рисунок второй.Протопласты не проявляли флуоресценции в одном из индикаторов флуоресценции кальциевых желез или не загружались в них. Чем в флуо-4/АМ загружали в протопласт, цитопласт, но не вакуоль становился флуоресцентным. Лантановые железа, которые эффективно блокируют кальциевые каналы клеточной мембраны, были добавлены к нагрузке Fluo-4/AM Protoplast.При конечной концентрации 100 микромолярный железо лантана значительно снижает интенсивность флуоресценции кальция. Эти результаты также продемонстрировали, что флуо-4 / AM эффективно остаются в железах кальция в цитопласте и показывают динамические изменения в содержании кальциевых желез. Результаты fluo-4/AM были проанализированы с использованием одобренного IMH плюс 6.0 программного флюо-4/AM окрашивания с добавлением лантановых желез значительно снижало значение цветения цитоплазматических кальциевых желез.В этом видео все протопласты были получены ферментативным гидролизом. Мы успешно загрузили флуоресцентные зонды в протопласты при 37 градусах. Более того, метод не повлиял на жизнеспособность протопластов.Вкратце, метод, описанный здесь в натуральной форме, подробно. Динамические изменения цитоплазматических ионов кальция в клетках яблочной мякоти тем самым обеспечивают 10 равных опор для дальнейшей цели исследований, связанных с кальцием.

Research

JoVE Journal

Biology

Staining the Cytoplasmic Ca2+ with Fluo-4/AM in Apple Pulp

Focal Ca2+ Transient Detection in Smooth Muscle

Focal Ca2+ Transient Detection in Smooth Muscle

Фокусное Ca 2 + Переходные Обнаружение в гладкой мускулатуре

Ca2+ imaging of smooth muscle provides insight into cellular mechanisms that may not result in changes of membrane potential, such as the release of Ca2+ ...

In vivo Ca2+- Imaging of Mushroom Body Neurons During Olfactory Learning in the Honey Bee

In vivo Ca2+- Imaging of Mushroom Body Neurons During Olfactory Learning in the Honey Bee

В естественных условиях Са 2 + - Съемка Гриб Нейроны тела во время обучения в обонятельной Honey Bee

The in vivo and semi-in vivo preparation for Calcium imaging has been developed in our lab by Joerges, K&uuml;ttner and Galizia over ten years ago, to ...

Techniques for Imaging Ca2+ Signaling in Human Sperm

Techniques for Imaging Ca2+ Signaling in Human Sperm

Методы для работы с изображениями Ca 2 + Сигнализация в человеческой спермы

Fluorescence microscopy of cells loaded with fluorescent, Ca2+-sensitive dyes is used for measurement of spatial and temporal aspects of Ca2+ signaling in ...

Live Cell Calcium Imaging Combined with siRNA Mediated Gene Silencing Identifies Ca2+ Leak Channels in the ER Membrane and their Regulatory Mechanisms

Live Cell Calcium Imaging Combined with siRNA Mediated Gene Silencing Identifies Ca2+ Leak Channels in the ER Membrane and their Regulatory Mechanisms

Живая изображений Кальций сотовый В сочетании с миРНК Отключение гена опосредованного Идентифицирует Ca 2 + Утечка каналов в мембране ЭР и их регулирующих механизмов

In mammalian cells, the endoplasmic reticulum (ER) plays a key role in protein biogenesis as well as in calcium signalling1. The heterotrimeric Sec61 ...

Activation of Apoptosis by Cytoplasmic Microinjection of Cytochrome c

Activation of Apoptosis by Cytoplasmic Microinjection of Cytochrome c

Активация апоптоза Цитоплазматическая Микроинъекция цитохрома С</em

Apoptosis, or programmed cell death, is a conserved and highly regulated pathway by which cells die1.  Apoptosis can be triggered when cells encounter a ...

Visualizing Cytoplasmic Flow During Single-cell Wound Healing in Stentor coeruleus

Visualizing Cytoplasmic Flow During Single-cell Wound Healing in Stentor coeruleus

Although wound-healing is often addressed at the level of whole tissues, in many cases individual cells are able to heal wounds within themselves, ...

Automated Analysis of Dynamic Ca2+ Signals in Image Sequences

Automated Analysis of Dynamic Ca2+ Signals in Image Sequences

Автоматизированный анализ динамических Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Сигналы в последовательности изображений

Intracellular Ca2+ signals are commonly studied with fluorescent Ca2+ indicator dyes and microscopy techniques. However, quantitative analysis of Ca2+ ...

Stimulation of Cytoplasmic DNA Sensing Pathways In Vitro and In Vivo

Stimulation of Cytoplasmic DNA Sensing Pathways In Vitro and In Vivo

Стимуляция цитоплазматической ДНК зондирования Пути<em&gt; In Vitro</em&gt; И<em&gt; В Vivo</em

In order to efficiently stimulate an innate immune response, DNA must be of sufficient length and purity. We present a method where double stranded DNA ...

Imaging Local Ca2+ Signals in Cultured Mammalian Cells

Imaging Local Ca2+ Signals in Cultured Mammalian Cells

Изображений Локальный ЦС<sup&gt; 2+</sup&gt; Сигналы в культуре клетках млекопитающих

Cytosolic Ca2+ ions regulate numerous aspects of cellular activity in almost all cell types, controlling processes as wide-ranging as gene transcription, ...

Methods to Classify Cytoplasmic Foci as Mammalian Stress Granules

Методы классификации цитоплазматических фокусов в качестве гранул стресса млекопитающих

Cells are often challenged by sudden environmental changes. Stress Granules (SGs), cytoplasmic ribonucleoprotein complexes that form in cells exposed to ...