Name: uptake of fluorescent labeled small extracellular vesicles in vitro and in spinal cord
Uploaded: 2021-05-23T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Uptake of Fluorescent Labeled Small Extracellular Vesicles In Vitro and in Spinal Cord at JoVE.com

Questo studio è stato supportato da sovvenzioni del NIH NINDS R01NS102836 e del Pennsylvania Department of Health Commonwealth Universal Research Enhancement (CURE) assegnato a Seena K. Ajit. Ringraziamo il Dr. Bradley Nash per la lettura critica del manoscritto.

NOTA: Tutte le procedure sono state eseguite in conformità con la Guida NIH per la cura e l'uso di animali da laboratorio e approvate dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali del Drexel University College of Medicine. I topi CD-1 gravidi a tempo sono stati utilizzati per la coltura astrocitica e tutte le dighe sono state ricevute 15 giorni dopo l'impregnazione. I topi C57BL/6 di dieci-dodici settimane sono stati utilizzati per esperimenti di assorbimento in vivo.
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C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+extracellular+vesicles+contain+miRNAs+and+are+released+as+early+biomarkers+for+cardiac+injury.">Circulating extracellular vesicles contain miRNAs and are released as early biomarkers for cardiac injury.</a> Journal of Cardiovascular Translational Research. 9 (4), 291-301 (2016).</li><li>Montecalvo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+transfer+of+functional+microRNAs+between+mouse+dendritic+cells+via+exosomes.">Mechanism of transfer of functional microRNAs between mouse dendritic cells via exosomes.</a> Blood. 119 (3), 756-766 (2012).</li><li>Escrevente, C., Keller, S., Altevogt, P., Costa, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+and+uptake+of+exosomes+by+ovarian+cancer+cells.">Interaction and uptake of exosomes by ovarian cancer cells.</a> BMC Cancer. 11, 108 (2011).</li><li>Cho, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+exosomes+and+ferritin+protein+nanocages+for+the+delivery+of+membrane+protein+therapeutics.">Comparison of exosomes and ferritin protein nanocages for the delivery of membrane protein therapeutics.</a> Journal of Controlled Release. 279, 326-335 (2018).</li><li>Mantel, P. 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In questo protocollo, abbiamo mostrato l'etichettatura dei sEV con coloranti PKH e la visualizzazione del loro assorbimento nel midollo spinale. I coloranti fluorescenti lipofili PKH sono ampiamente utilizzati per l'etichettatura delle cellule mediante citometria a flusso e microscopia fluorescente3,5,6,12,24,25. A causa dell...

Le piccole vescicole extracellulari (sEV) sono vescicole nanodimensionate derivate dalla membrana con un intervallo di dimensioni di 50-150 nm. Hanno origine da corpi multi-vescicolari (MVB) e vengono rilasciati dalle cellule dopo la fusione degli MVB con la membrana plasmatica. Gli sEV contengono miRNA, mRNA, proteine e lipidi bioattivi e queste molecole vengono trasferite tra le cellule sotto forma di comunicazione cellula-cellula. Le sEV possono essere internalizzate dalle cellule riceventi attraverso una varietà di vie endocitiche e questa cattura di sEV da parte delle cellule riceventi è mediata dal riconoscimento delle molecole di superficie sia sugli EV che sulle cellule bersaglio1.
I sEV hanno guadagnato interesse grazie alla loro capacità di innescare cambiamenti molecolari e fenotipici nelle cellule accettori, alla loro utilità come agente terapeutico e al loro potenziale come vettori di molecole di carico o agenti farmacologici. A causa delle loro piccole dimensioni, l'imaging e il tracciamento dei sEV possono essere impegnativi, specialmente per gli studi in vivo e le impostazioni cliniche. Pertanto, sono stati sviluppati molti metodi per etichettare e immaginare i sEV per aiutare la loro biodistribuzione e tracciamento in vitro e in vivo2.
La tecnica più comune per studiare la biodistribuzione sEV e le interazioni delle cellule bersaglio prevede l'etichettatura con molecole di colorante fluorescente3,4,5,6,7. I veicoli elettrici sono stati inizialmente etichettati con coloranti a membrana cellulare che erano comunemente usati per l'immagine delle cellule. Questi coloranti fluorescenti generalmente macchiano il doppio strato lipidico o le proteine di interesse sui sEV. Diversi coloranti lipofili mostrano un forte segnale fluorescente quando incorporati nel citosol, tra cui DiR (1,1′-diottadecile-3,3,3′,3′-tetrametilinditricarbocianina ioduro), DiL (1, 1′-diottadecile-3, 3, 3′, 3′-tetrametil indocarbocianina perclorato) e DiD (1, 1′-diottadecile-3, 3, 3′,3′-tetrametil indocarbocianine 4-clorobenzensolfonato sale)8,9,10,11.
Altri coloranti lipofili, come PKH67 e PKH26, hanno un gruppo di testa polare altamente fluorescente e una lunga coda di idrocarburi alifatici che si intercala facilmente in qualsiasi struttura lipidica e porta alla ritenzione del colorante a lungo termine e alla fluorescenza stabile12. I coloranti PKH possono anche etichettare i veicoli elettrici, il che consente lo studio delle proprietà EV in vivo13. Molti altri coloranti sono stati utilizzati per osservare gli esosomi utilizzando la microscopia a fluorescenza e la citometria a flusso, compresi i coloranti per l'etichettatura lipidica14 e coloranti permeabili alle cellule come l'estere succinimidile carbossifluoresceina diacetato (CFDA-SE)15,16 e l'estere acetoximetile (AM) di calceina17.
Studi di crosstalk mediata da sEV tra diverse cellule del SNC hanno fornito importanti approfondimenti sulla patogenesi delle malattie neuroinfiammatorie e neurodegenerative18. Ad esempio, gli sEV dei neuroni possono diffondere peptidi beta-amiloidi e proteine tau fosforilate e aiutare nella patogenesi della malattia di Alzheimer19. Inoltre, gli EV derivati dagli eritrociti contengono grandi quantità di alfa-sinucleina e possono attraversare la barriera emato-encefalica e contribuire alla patologia del Parkinson20. La capacità dei sEV di attraversare le barriere fisiologiche21 e trasferire le loro biomolecole alle cellule bersaglio li rende strumenti convenienti per fornire farmaci terapeutici al SNC22.
La visualizzazione dell'assorbimento di sEV da parte di una miriade di cellule del SNC nel midollo spinale consentirà sia studi meccanicistici che la valutazione dei benefici terapeutici dei sEV somministrati esogenamente da varie fonti cellulari. Questo documento descrive la metodologia per etichettare i sEV derivati dai macrofagi e immaginare il loro assorbimento in vitro e in vivo nel midollo spinale lombare da parte di neuroni, microglia e astrociti per confermare qualitativamente la consegna di sEV mediante visualizzazione.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra 0.5 mL centrifugal filters</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>Z677094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Alix Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab186429</td>
			<td>1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Calnexin Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>Ab10286</td>
			<td>1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD81 Antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-166029</td>
			<td>1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-GAPDH Monoclonal Antibody (14C10)</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>2118</td>
			<td>1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Glial Fibrillary Acidic Protein Antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>MAB360</td>
			<td>1:500 for IF; 1:1000 for IHC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Iba1 Antibody</td>
			<td>Wako</td>
			<td>019-19741</td>
			<td>1:2000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-MAP2A Antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>MAB378</td>
			<td>1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>0332</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Strainer, 40 &#956;m</td>
			<td>VWR</td>
			<td>15-1040-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Tubes</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>3118-0050</td>
			<td>12,000 x g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip, 12-mm, #1.5</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>72230-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip, 18-mm, #1.5</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>72222-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9542-1MG</td>
			<td>1 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DC Protein Assay</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>500-0116</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxyribonuclease I (DNAse I)</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>D4513-1VL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey Anti-Rabbit IgG H&#38;L (HRP)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab16284</td>
			<td>1:10000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey Anti-Rabbit IgG H&#38;L, Alexa Fluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-21206</td>
			<td>1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double Frosted Microscope Slides, #1</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>12-552-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS without Calcium and Magnesium</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-031-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10-013-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Exosome-Depleted Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A27208-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>35-011-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluorChem M imaging system</td>
			<td>ProteinSimple</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FV3000 Confocal Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Mouse IgG H&#38;L (HRP)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab6789</td>
			<td>1:10000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Mouse IgG H&#38;L, Alexa Fluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-11001</td>
			<td>1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Mouse IgG1, Alexa Fluor 594</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-21125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#39;s Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>02-0121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HRP Substrate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>34094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Intercept blocking buffer, TBS</td>
			<td>LI-COR Biosciences</td>
			<td>927-60001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laemmli SDS Sample Buffer</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>AAJ61337AC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Cover Glass, #1</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48404-454</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microm HM550</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoSight NS300 system</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoSight NTA 3.2 software</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neuro-2a Cell Line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-131</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Goat Serum</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>S-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O.C.T Compound</td>
			<td>Sakura Finetek</td>
			<td>4583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Papain</td>
			<td>Worthington Biochemical Corporation</td>
			<td>NC9597281</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>19210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PKH26</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>MINI26-1KT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PKH67</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>MINI67-1KT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>1862209</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVDF Transfer Membrane</td>
			<td>MDI</td>
			<td>SVFX8302XXXX101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RAW 267.4 Cell Line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>TIB-71</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RIPA Buffer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R0278</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>AMRESCO</td>
			<td>0241-2.5KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost Plus Gold Slides</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>15-188-48</td>
			<td>adhesive slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-75 Flasks</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431464U</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tecnai 12 Digital Transmission Electron Microscope</td>
			<td>FEI Company</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEM Grids</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>FSF300-cu</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-Glycine Protein Gel, 12%</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>XP00120BOX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-Glycine SDS Running Buffer</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>LC26755</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-Glycine Transfer Buffer</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>LC3675</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express</td>
			<td></td>
			<td>cell dissociation enzyme</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>327371000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin, 0.25%</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-053-CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge Tubes</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>344058</td>
			<td>110,000 x g</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

uptake of fluorescent labeled small extracellular vesicles in vitro and in spinal cord

Le piccole vescicole extracellulari (sEV) sono vescicole da 50-150 nm secrete da tutte le cellule e presenti nei fluidi corporei. Gli sEV trasferiscono biomolecole come RNA, proteine e lipidi dalle cellule donatrici alle cellule accettori, rendendole mediatori chiave di segnalazione tra le cellule. Nel sistema nervoso centrale (SNC), i sEV possono mediare la segnalazione intercellulare, comprese le interazioni neuroimmune. Le funzioni di sEV possono essere studiate monitorando l'assorbimento di sEV etichettati nelle cellule riceventi sia in vitro che in vivo. Questo documento descrive l'etichettatura dei sEV dai mezzi condizionati delle cellule macrofagiCHE RAW 264.7 utilizzando un colorante a membrana PKH. Mostra l'assorbimento di diverse concentrazioni di sEV etichettati in più punti temporali da parte delle cellule Neuro-2a e degli astrociti primari in vitro. Viene anche mostrato l'assorbimento di sEV somministrati per via intratecale nei neuroni del midollo spinale del topo, negli astrociti e nelle microglia visualizzate mediante microscopia confocale. I risultati rappresentativi dimostrano una variazione dipendente dal tempo nell'assorbimento di sEV da parte di cellule diverse, che può aiutare a confermare il successo della consegna di sEV nel midollo spinale.

Dopo l'isolamento dei sEV dai mezzi condizionati RAW 264.7 tramite centrifugazione, nta è stato utilizzato per determinare la concentrazione e la distribuzione dimensionale dei sEV purificati. La dimensione media media delle sEV derivate da RAW 264,7 era di 140 nm e la dimensione delle particelle di picco era di 121,8 nm, confermando che la maggior parte delle particelle rilevabili nella misurazione della diffusione della luce rientrava nell'intervallo di dimensioni degli esosomi o dei sEV a 50-150 nm (<strong class="xf...

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Uptake of Fluorescent Labeled Small Extracellular Vesicles In Vitro and in Spinal Cord

Descriviamo un protocollo per etichettare piccole vescicole extracellulari derivate da macrofagi con coloranti PKH e osservarne l'assorbimento in vitro e nel midollo spinale dopo il parto intratecale.

Assorbimento di piccole vescicole extracellulari etichettate fluorescenti in vitro e nel midollo spinale

Small extracellular vesicles (sEVs) are 50-150 nm vesicles secreted by all cells and present in bodily fluids. sEVs transfer biomolecules such as RNA, ...

Visualizzare l'assorbimento di piccole vescicole extracellulari, note anche come sEV, da parte di diverse cellule del midollo spinale, può confermare una consegna di successo di sEV. Ciò consente studi sia meccanicistici che terapeutici di sEV somministrati per via intratecale da varie fonti in modelli di roden. Questo protocollo può essere utilizzato per visualizzare l'assorbimento di sEV da parte delle cellule in un midollo spinale lieve e può aiutare a valutare il ruolo dei sEV e delle sue molecole di carico nei disturbi spinali, nel dolore e nell'infiammazione.Questa procedura sarà dimostrata da me, insieme a Xuan Luo a nd Zhucheng Lin, i due studenti laureati nel laboratorio del dottor Seena Ajit. Inizia posizionando scivolate di copertura da 18 millimetri nella piastra del pozzo 12, quindi piastre le cellule neuro-2a in ciascun pozzetto con un totale di 1 millilitro di DMEM completo contenente il 10% FBS e l'1% di pen strep. Quando la fluidità della conta cellulare ha raggiunto l'80-90%, cambiare il mezzo in mezzo impoverito di esosomi DMEM in ciascun pozzo aggiungere uno, 5 o 10 microgrammi di sEV etichettati.Per 1, 4 e 24 ore. Per l'assorbimento dipendente dalla dose e dal tempo al resto dei pozzetto ad un volume uguale di controllo del colorante. Raccogli il cervello dei cuccioli postnatali in una capsula di Petri da 60 millimetri contenente una soluzione salina bilanciata Hanks ghiacciata integrata con 10 hepes millimolari, seziona entrambi i lobi corticali e rimuovi le meningi.Quindi tritare i tessuti con una lama sterilizzata. Trasferire i tessuti in un tubo conico da 15 millilitri contenente Pepano o desossiribonucleo un tampone di dissociazione e incubare per 20 minuti a 37 gradi Celsius, ruotando il tubo ogni 5 minuti, aspirare il surnatante e aggiungere 5 millilitri di DMEM completo al tubo. Per inattivare l'attività enzimatica, prova a valutare attentamente per dissociare i tessuti con una pipetta sierologica di vetro da 5 millilitro e una pipetta da pascolo lucidata a fiamma.Passare la sospensione cellulare attraverso un filtro cellulare da 40 micrometri, quindi centrifugare le cellule a 250 volte G per 5 minuti a 4 gradi Celsius, aspirare il mezzo e vedere le celle in 10 millilitri di DMEM completo in un pallone da 75 centimetri quadrati. Dopo 4 ore di placcatura, sostituire il supernato e il mezzo con 15 millilitri di mezzo DMEM fresco. Dopo 14 giorni in vitro per staccare la microglia e gli oligodendrociti, trasferire il pallone in uno shaker orbitale a 320 RPM per 6 ore.Utilizzare 5 millilitri dell'enzima di dissociazione cellulare per 10 minuti a 37 gradi Celsius. Per tripinizzare, gli astrociti rimanenti, per inattivare l'azione enzimatica, aggiungere un DMEM completo di 5 millilitri e poi pellettizzare le cellule a 250 volte G per 5 minuti a 4 gradi Celsius. Risuspentare le celle in DMEM completo e vedere le celle sul coperchio numero 1.5 da 12 millimetri scivolare in una piastra da 24 pozzetti.Usando PBS risciacquare le cellule 3 volte e poi fissarle con formaldeide o PFA al 4% di potenza in PBS per 10 minuti a temperatura ambiente. Lavare le celle fisse 3 volte per 5 minuti con PBS e permeabilizzarle usando lo 0,1% di Triton X 100 in PBS per 10-15 minuti. Quindi ripetere i lavaggi con PBS.Utilizzare il siero di capra normale al 5% o NGS in PBS per 1 ora a temperatura ambiente per bloccare le cellule, incubare le cellule neuro-2a con anticorpi bidirezionali mappati e gli astrociti primari con anticorpi GFAP con un rapporto da 1 a 500 in NGS o PBS fresco del 5% durante la notte a 4 gradi Celsius con un leggero scuotimento. Dopo aver lavato le cellule 3 volte in PBS, aggiungere gli anticorpi secondari coniugati con fluoroforo in 5% NGS. Incubare per 2 ore a temperatura ambiente al riparo dalla luce su un bilanciere.Ripetere il lavaggio con PBS e incubare la cella con 1 microgrammo per millilitro di DAPI per 10 minuti a temperatura ambiente. Ancora una volta, lavare le celle 3 volte con PBS. Utilizzando un mezzo di montaggio anti dissolvenza, montare i coperchi scivola sui vetrini numero 1, lasciarli asciugare durante la notte al buio e conservare i vetrini preparati a 4 gradi Celsius fino all'imaging su un microscopio confocale.Sezionare il midollo spinale e fissarlo in PFA al 4% in PBS a 4 gradi Celsius per 24 ore. Prima proteggere i tessuti in saccarosio al 30% in PBS a 4 gradi Celsius per 24 ore o fino a quando i tessuti affondano e quindi conservare i tessuti a 4 gradi Celsius fino all'immunoistochimica, inmbare il midollo spinale L4 L5 nel composto OCT, quindi congelarlo su ghiaccio secco fino a quando non è completamente solidificato. Utilizzare un criostato per sezionare i tessuti a 30 micrometri e raccogliere le sezioni in una piastra a 24 pozzetti contenente PBS.Lavare le sezioni 3 volte per 5 minuti ciascuna con lo 0,3% di tritone in PBS, bloccare i siti di legame non specifici usando il 5% mgs nello 0,3% di Triton PBS per 2 ore a temperatura ambiente. Incubare le sezioni durante la notte a 4 gradi Celsius su uno shaker. Lavare le sezioni 3 volte per 5 minuti con lo 0,3% di Tritone in Pbs.Quindi aggiungere la concentrazione appropriata degli anticorpi secondari. Secondo il manoscritto del testo, incubare a temperatura ambiente per due ore, lavare le sezioni usando solo PBS e incubarle in 1 microgrammo per millilitro di DAPI per 10 minuti a temperatura ambiente. Quindi ripetere i lavaggi PBS al microscopio ottico, montare le sezioni su un vetrino adesivo trasparente con un pennello fine.Bagnare il coperchio scivolare con il mezzo di montaggio e polimerizzare durante la notte al buio a temperatura ambiente, acquisire immagini al microscopio confocale con i rispettivi laser, La dimensione media media di RA 2 6 4 0,7 sEV derivati era di 140 nanometri e la dimensione delle particelle di picco era di 121,8 nanometri. Con le particelle più rilevabili che rientrano nella gamma di dimensioni degli esosomi o sEVS. A 50-150 nanometri, il western blotting di sEV, celllysate e media esodepletati, ha dimostrato che i campioni proteici derivati da sEV contenevano le proteine marcatori sEV Alix CD81 e GAPDH.Il lisiato cellulare è stato arricchito con reticolo endoplasmatico, proteina residente Calnexin quindi Calnexin è servito come marcatore negativo per la contaminazione cellulare in quanto era assente nei sEV. È stato osservato che l'assorbimento di sEV si è verificato a 1 ora e per i sEV da 1, 5 e 10 microgrammi, la fluorescenza post incubazione poteva essere rilevata a 4 ore, per 4, 5 e 10 microgrammi di sEV. L'assorbimento di sEV etichettati con PKH 26 da parte degli astrociti primari è stato esaminato e la massima fluorescenza dall'assorbimento di sEVS negli astrociti corticali primari si è verificata a 24 ore sono stati assorbiti sEV con marchio PKH26 e la massima fluorescenza è stata osservata a 6 ore, post-iniezione nei neuroni astrociti e cellule microgliali.L'inclusione di controlli, sEV non etichettati e controllo del colorante crea codice per un vento falsi segnali positivi recenti a causa dell'etichettatura ora specifica Opry dance of Unbound dye patch coasts. L'assorbimento di seV può essere confermato studiando il trasferimento del carico biomolecolare alla ricetta e alle cellule e ai tessuti e determinando i cambiamenti nei livelli di espressione delle biomolecole o dei geni bersaglio. Possono anche essere eseguiti studi comportamentali, per indagare l'impatto funzionale della consegna di sEV.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Uptake of Fluorescent Labeled Small Extracellular Vesicles In Vitro and in Spinal Cord

Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

Dissezione e la cultura di neuroni embrionali commissurali da midollo spinale

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

Ricerca

Neuroscienze

Spinal Cord Electrophysiology II: Extracellular Suction Electrode Fabrication

Spinal Cord Elettrofisiologia II: extracellulare fabbricazione di elettrodi di aspirazione

Development of neural circuitries and locomotion can be studied using neonatal rodent spinal cord central pattern generator (CPG) behavior. We demonstrate ...

Lateral Fluid Percussion: Model of Traumatic Brain Injury in Mice

Fluido laterale Percussioni: Modello delle lesioni cerebrali traumatiche nei topi

Traumatic brain injury (TBI) research has attained renewed momentum due to the increasing awareness of head injuries, which result in morbidity and ...

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

Retrograda Etichettatura fluorescente Consente mirata extracellulare singola unità di registrazione da parte dei neuroni identificati<em&gt; In vivo</em

The overall goal of this method is to record single-unit responses from an identified population of neurons. In vivo electrophysiological recordings from ...

Spinal Cord Transection in the Larval Zebrafish

Spinal Cord transezione nel larvale Zebrafish

Mammals fail in sensory and motor recovery following spinal cord injury due to lack of axonal regrowth below the level of injury as well as an inability ...

An Ex Vivo Laser-induced Spinal Cord Injury Model to Assess Mechanisms of Axonal Degeneration in Real-time

An Ex Vivo Laser-induced Spinal Cord Injury Model to Assess Mechanisms of Axonal Degeneration in Real-time

Un<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Laser-indotta Spinal Cord Injury modello per valutare i meccanismi di degenerazione assonale in tempo reale

Injured CNS axons fail to regenerate and often retract away from the injury site. Axons spared from the initial injury may later undergo secondary axonal ...

Two-photon Imaging of Cellular Dynamics in the Mouse Spinal Cord

Due fotoni Imaging di Cellular Dynamics nel midollo spinale del mouse

Two-photon (2P) microscopy is utilized to reveal cellular dynamics and interactions deep within living, intact tissues. Here, we present a method for ...

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

Imaging di attività neurale nella corteccia somatosensoriale primaria utilizzando Thy1-topi transgenici GCaMP6s

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in ...

Laminectomy and Spinal Cord Window Implantation in the Mouse

Laminectomia e impianto della finestra del cavo spinale nel mouse

This protocol describes a method for spinal cord laminectomy and glass window implantation for in vivo imaging of the mouse spinal cord. An integrated ...

Preparation of Rhythmically-active In Vitro Neonatal Rodent Brainstem-spinal Cord and Thin Slice

Preparazione di ritmicamente-attivo In Vitro neonatale del roditore del tronco cerebrale-spinale e fetta sottile

Mammalian inspiratory rhythm is generated from a neuronal network in a region of the medulla called the preB&#246;tzinger complex (pBC), which produces a ...