Name: uptake of fluorescent labeled small extracellular vesicles in vitro and in spinal cord
Uploaded: 2021-05-23T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Uptake of Fluorescent Labeled Small Extracellular Vesicles In Vitro and in Spinal Cord at JoVE.com

이 연구는 NIH NINDS R01NS102836및 펜실베니아 보건부 유니버설 연구 강화(CURE)의 보조금에 의해 지원되었으며, 시나 K. 아지트에게 수여되었습니다. 우리는 원고의 비판적 독서에 대한 박사 브래들리 내쉬 에게 감사드립니다.

참고: 모든 절차는 실험실 동물의 치료 및 사용에 대한 NIH 가이드를 준수하여 수행되었으며 드렉셀 대학 의과 대학의 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 승인을 받았습니다. 시간 임신 한 CD-1 마우스는 성상체 배양에 사용되었고, 모든 댐은 함침 후 15 일 수신되었다. 12주 된 C57BL/6 마우스는 생체 내 섭취 실험에 사용되었다.
1. RAW 264.7 대식세포로부터 의 대체 분리
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	<li>Mulcahy, L. A., Pink, R. C., Carter, D. R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Routes+and+mechanisms+of+extracellular+vesicle+uptake.">Routes and mechanisms of extracellular vesicle uptake.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 3 (1), 24641 (2014).</li><li>Betzer, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+imaging+strategies+for+in+vivo+tracking+of+exosomes.">Advances in imaging strategies for in vivo tracking of exosomes.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews. Nanomedicine and Nanobiotechnology. 12 (2), 1594 (2020).</li><li>Dehghani, M., Gaborski, T. 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C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+extracellular+vesicles+contain+miRNAs+and+are+released+as+early+biomarkers+for+cardiac+injury.">Circulating extracellular vesicles contain miRNAs and are released as early biomarkers for cardiac injury.</a> Journal of Cardiovascular Translational Research. 9 (4), 291-301 (2016).</li><li>Montecalvo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+transfer+of+functional+microRNAs+between+mouse+dendritic+cells+via+exosomes.">Mechanism of transfer of functional microRNAs between mouse dendritic cells via exosomes.</a> Blood. 119 (3), 756-766 (2012).</li><li>Escrevente, C., Keller, S., Altevogt, P., Costa, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+and+uptake+of+exosomes+by+ovarian+cancer+cells.">Interaction and uptake of exosomes by ovarian cancer cells.</a> BMC Cancer. 11, 108 (2011).</li><li>Cho, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+exosomes+and+ferritin+protein+nanocages+for+the+delivery+of+membrane+protein+therapeutics.">Comparison of exosomes and ferritin protein nanocages for the delivery of membrane protein therapeutics.</a> Journal of Controlled Release. 279, 326-335 (2018).</li><li>Mantel, P. 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N. M. N. -. t., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+and+qualitative+flow+cytometric+analysis+of+nanosized+cell-derived+membrane+vesicles.">Quantitative and qualitative flow cytometric analysis of nanosized cell-derived membrane vesicles.</a> Nanomedicine: Nanotechnology, Biology and Medicine. 8 (5), 712-720 (2012).</li><li>Gangadaran, P., Hong, C. M., Ahn, B. -. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+update+on+in+vivo+imaging+of+extracellular+vesicles+as+drug+delivery+vehicles.">An update on in vivo imaging of extracellular vesicles as drug delivery vehicles.</a> Frontiers in Pharmacology. 9, 169 (2018).</li><li>Teare, G. F., Horan, P. K., Slezak, S. E., Smith, C., Hay, J. 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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confounding+factors+in+vesicle+uptake+studies+using+fluorescent+lipophilic+membrane+dyes.">Confounding factors in vesicle uptake studies using fluorescent lipophilic membrane dyes.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1388731 (2017).</li><li>Pu&#382;ar Dominku&#353;, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PKH26+labeling+of+extracellular+vesicles:+Characterization+and+cellular+internalization+of+contaminating+PKH26+nanoparticles.">PKH26 labeling of extracellular vesicles: Characterization and cellular internalization of contaminating PKH26 nanoparticles.</a> Biochimica et Biophysica Acta. Biomembranes. 1860 (6), 1350-1361 (2018).</li><li>Dehghani, M., Gulvin, S. M., Flax, J., Gaborski, T. 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C., Li, C., Durisic, N., Sullivan, R., G&#246;tz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+taken+up+by+neurons+hijack+the+endosomal+pathway+to+spread+to+interconnected+neurons.">Exosomes taken up by neurons hijack the endosomal pathway to spread to interconnected neurons.</a> Acta Neuropathologica Communications. 6 (1), 10 (2018).</li><li>Jurgielewicz, B. J., Yao, Y., Stice, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetics+and+specificity+of+HEK293T+extracellular+vesicle+uptake+using+imaging+flow+cytometry.">Kinetics and specificity of HEK293T extracellular vesicle uptake using imaging flow cytometry.</a> Nanoscale Research Letters. 15 (1), 170 (2020).</li></ol>

이 프로토콜에서, 우리는 PKH 염료와 sEV의 라벨링과 척수에 그들의 섭취량의 시각화를 보여주었습니다. PKH 리포필릭 형광염은 세포측정 및형광 현미경검사3,5,6,12,24,25를유동하여 세포 라벨링에 널리 사용된다. 상대적으로 긴 반감기 와 낮은 세포 독...

작은 세포 외 소포 (sEV)는 나노 크기, 50-150 nm의 크기 범위와 멤브레인 소포입니다. 그(것)들은 다중 vesicular 바디 (MVBs)에서 유래하고 플라즈마 막과 MVB의 융합에 세포에서 풀어 놓입니다. sEV는 miRNAs, mRNA, 단백질 및 생리활성 지질을 포함하고, 이 분자는 세포 간 세포 통신의 형태로 세포 사이 옮겨질 것입니다. sEV는 다양한 내막 경로에 의해 수신자 세포에 의해 내부화될 수 있으며, 수신자 세포에 의한 sEV의 이러한 포획은 EV와 표적 세포1모두에 대한 표면 분자의 인식에 의해 중재된다.
sEV는 수용체 세포의 분자 및 현상 변화를 유발할 수 있는 능력, 치료제로서의 유용성, 화물 분자 또는 약리학제의 운반선으로서의 잠재력으로 인해 관심을 얻고 있습니다. 그들의 작은 크기 때문에, sEV의 화상 진찰 및 추적은 특히 생체 내 연구 및 임상 설정에 도전적일 수 있습니다. 따라서 생체 내 및 생체 내 및 생체 내 추적을 지원하기 위해 라벨 및 이미지 sEV를 표시하고 이미지 sEV를개발하는 많은 방법이 개발되었다.
sEV 생체 분포및 표적 세포 상호 작용을 연구하는 가장 일반적인 기술은 형광염염료 분자3,4,5,6,7로라벨을 붙이는 것을 포함한다. 전기 는 처음에 일반적으로 이미지 세포에 사용 된 세포막 염료로 표시 되었다. 이 형광 염료는 일반적으로 sEV에 관심있는 지질 이중 층 또는 단백질을 얼룩. 몇몇 지방성 염료는 디르 (1,1′-디옥타데딜-3,3,3′,3′-테트라메틸린도트리카르보시아노니 오오드), DiL (1, 1′-dioctadecyl-3, 3, 3′, 3′-테트라메틸 인도카르보시아닌 과염소산염), 및 DiD (1, 1′-디옥타데킬-3, 3, 3′, 3′, 3′-테트라메틸 인도카르보시야닌 4-클로로벤젠술포네이트 소금)8,9,101.
PKH67 및 PKH26과 같은 다른 지방성 염료는, 고형성 극지 헤드 그룹과 어떤 지질 구조로 쉽게 상호 작용하고 장기 염료 보존 및 안정적인 형광12로이어지는 긴 알리파성 탄화수소 꼬리를 갖는다. PKH 염료는 또한 EV 라벨을 지정할 수 있으며, 이는 생체 내에서EV 속성의 연구를 할 수 있습니다13. 다른 많은 염료는 형광 현미경 검사법과 유동 세포종을 사용하여 외종을 관찰하는 데 사용되어 왔으며, 여기에는 지질 라벨염료14 및 카박스시플루오레세인 디아세테이트 succinimidyl ester(CFDA-SE)15,16 및 칼세옥 아세틸(AM)
CNS에 있는 다른 세포 사이 sEV 매개 한 교차토크의 연구 결과는 신경 염증성 및 신경 퇴행성 질환의 병인에 중요한 통찰력을 제공했다18. 예를 들어, 뉴런으로부터의 sEV는 베타 아밀로이드 펩타이드와 인광타우 단백질을 퍼뜨리고알츠하이머병(19)의발병에 도움을 주어 질 수 있다. 추가적으로, 적혈구에서 파생된 전기는 많은 양의 알파-시뉴클레인을 함유하고 있으며 혈액-뇌 장벽을 넘어파킨슨병증(20)에기여할 수 있다. sEV의 능력은 생리적 장벽을교차하고 표적 세포에 자신의 생체 분자를 전송하는 그들에게 CNS22에치료 약물을 전달하는 편리한 도구를 만든다.
척수에 있는 무수한 CNS 세포에 의하여 sEV upup를 시각화하는 것은 기계학 연구 및 각종 세포 근원에서 외인성 관리한 sEV의 치료 이득의 평가를 둘 다 가능하게 할 것입니다. 이 논문은 대식세포에서 파생된 sEV를 라벨로 지정하고 생체외에서 의 기생을 이미지하고 뉴런, 마이크로글리아 및 성상세포에 의해 요추 척수에서 생체내로 분류하여 시각화에 의한 sEV 전달을 질적으로 확인하는 방법을 설명합니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra 0.5 mL centrifugal filters</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>Z677094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Alix Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab186429</td>
			<td>1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Calnexin Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>Ab10286</td>
			<td>1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD81 Antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-166029</td>
			<td>1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-GAPDH Monoclonal Antibody (14C10)</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>2118</td>
			<td>1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Glial Fibrillary Acidic Protein Antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>MAB360</td>
			<td>1:500 for IF; 1:1000 for IHC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Iba1 Antibody</td>
			<td>Wako</td>
			<td>019-19741</td>
			<td>1:2000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-MAP2A Antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>MAB378</td>
			<td>1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>0332</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Strainer, 40 &#956;m</td>
			<td>VWR</td>
			<td>15-1040-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Tubes</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>3118-0050</td>
			<td>12,000 x g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip, 12-mm, #1.5</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>72230-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip, 18-mm, #1.5</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>72222-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9542-1MG</td>
			<td>1 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DC Protein Assay</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>500-0116</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxyribonuclease I (DNAse I)</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>D4513-1VL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey Anti-Rabbit IgG H&#38;L (HRP)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab16284</td>
			<td>1:10000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey Anti-Rabbit IgG H&#38;L, Alexa Fluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-21206</td>
			<td>1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double Frosted Microscope Slides, #1</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>12-552-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS without Calcium and Magnesium</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-031-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10-013-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Exosome-Depleted Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A27208-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>35-011-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluorChem M imaging system</td>
			<td>ProteinSimple</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FV3000 Confocal Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Mouse IgG H&#38;L (HRP)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab6789</td>
			<td>1:10000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Mouse IgG H&#38;L, Alexa Fluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-11001</td>
			<td>1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Mouse IgG1, Alexa Fluor 594</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-21125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#39;s Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>02-0121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HRP Substrate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>34094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Intercept blocking buffer, TBS</td>
			<td>LI-COR Biosciences</td>
			<td>927-60001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laemmli SDS Sample Buffer</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>AAJ61337AC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Cover Glass, #1</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48404-454</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microm HM550</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoSight NS300 system</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoSight NTA 3.2 software</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neuro-2a Cell Line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-131</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Goat Serum</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>S-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O.C.T Compound</td>
			<td>Sakura Finetek</td>
			<td>4583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Papain</td>
			<td>Worthington Biochemical Corporation</td>
			<td>NC9597281</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>19210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PKH26</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>MINI26-1KT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PKH67</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>MINI67-1KT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>1862209</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVDF Transfer Membrane</td>
			<td>MDI</td>
			<td>SVFX8302XXXX101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RAW 267.4 Cell Line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>TIB-71</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RIPA Buffer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R0278</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>AMRESCO</td>
			<td>0241-2.5KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost Plus Gold Slides</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>15-188-48</td>
			<td>adhesive slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-75 Flasks</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431464U</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tecnai 12 Digital Transmission Electron Microscope</td>
			<td>FEI Company</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEM Grids</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>FSF300-cu</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-Glycine Protein Gel, 12%</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>XP00120BOX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-Glycine SDS Running Buffer</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>LC26755</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-Glycine Transfer Buffer</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>LC3675</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express</td>
			<td></td>
			<td>cell dissociation enzyme</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>327371000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin, 0.25%</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-053-CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge Tubes</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>344058</td>
			<td>110,000 x g</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

uptake of fluorescent labeled small extracellular vesicles in vitro and in spinal cord

작은 세포 외 소포 (sEV)는 모든 세포에 의해 분비되고 체액에 존재하는 50-150 nm 소포입니다. sEV는 RNA, 단백질 및 지질과 같은 생체 분자를 기증자에서 수용세포로 이송하여 세포 간의 주요 신호 중재자를 만듭니다. 중추 신경계 (CNS)에서 sEV는 신경 면역 상호 작용을 포함하여 세포 간 신호를 중재 할 수 있습니다. sEV 기능은 생체외 및 생체 내 모두 받는 사람 세포에서 표지된 sEV의 섭취량을 추적하여 연구할 수 있다. 이 논문은 PKH 멤브레인 염료를 사용하여 RAW 264.7 대식세포의 조건부 매체로부터 sEV의 라벨링을 설명합니다. 그것은 신경-2a 세포와 시험관내1 차 성상세포에 의해 여러 시간 지점에서 표지된 sEV의 다른 농도의 uptakes를 보여줍니다. 또한 마우스 척수 뉴런, 성상세포 및 공초점 현미경 검사법에 의해 시각화된 미세glia에서 내trathecally를 전달한 sEV의 섭취도 표시됩니다. 대표적인 결과는 척수로 성공적인 sEV 납품을 확인하는 것을 도울 수 있는 다른 세포에 의하여 sEV의 uptake에 있는 시간 의존적인 변이를 보여줍니다.

원심분리를 통해 RAW 264.7 컨디셔닝 된 매체로부터 sEV를 분리한 후, NTA는 정제된 세프의 농도 및 크기 분포를 결정하는 데 사용되었다. RAW 264.7 유래 sEV의 평균 평균 크기는 140nm이고 피크 입자 크기는 121.8nm였으며, 빛 산란 측정에서 대부분의 검출 가능한 입자가 50-150 nm(그림1A)에서엑소좀 또는 sEV의 크기 범위 내에 떨어졌는 것을 확인하였다. 세포 외 소포 2018 (MISEV2018)<sup class="...

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Uptake of Fluorescent Labeled Small Extracellular Vesicles In Vitro and in Spinal Cord

우리는 PKH 염료로 대식세포 유래 작은 세포외 소포를 라벨과 시험관 내 및 척수에서 그들의 upup을 관찰하는 프로토콜을 기술합니다.

체외 및 척수에서 형광 라벨 작은 세포 외 소포의 섭취

Small extracellular vesicles (sEVs) are 50-150 nm vesicles secreted by all cells and present in bodily fluids. sEVs transfer biomolecules such as RNA, ...

척수의 다른 세포에 의해 sEV라고도 하는 작은 세포 외 소포의 섭취를 시각화하면 sEV의 성공적인 전달을 확인할 수 있습니다. 이를 통해 로덴 모델의 다양한 소스에서 내trathecally 투여 된 sEV의 기계론 적 및 치료 연구를 가능하게합니다. 이 프로토콜은 온화한 척수에 있는 세포에 의하여 sEV upup를 구상하는 것을 이용할 수 있고, 척추 무질서, 고통 및 염증에 있는 sEV 및 그것의 화물 분자의 역할을 평가하는 것을 도울 수 있습니다.이 절차는 저와 함께 시나 아지트 박사의 연구실에서 두 대학원생인 슈안 루오(Xuan Luo)와 함께 제일 준 주청 린(Xuan Luo)이 시연할 것입니다. 12 개의 웰 플레이트에 18 mm 커버 슬립을 배치한 다음 10 %의 FBS 및 1 % 펜 스트렙을 포함하는 완전한 DMEM의 총 1 밀리리터로 각 우물의 신경 -2a 세포를 플레이트합니다. 세포 수 유창성이 80~ 90%에 도달하면 매매체를 DMEM 엑소솜 고갈된 배지로 변경하여 각각 1, 5 또는 10 마이크로그램의 라벨이 부착된 sEV를 추가합니다.1, 4 및 24 시간 동안. 주사제 제어의 동일한 볼륨에서 우물의 나머지 부분에 복용량 및 시간 의존 섭취량에 대 한. 60mm에서 산후 새끼의 두뇌를 수집, 얼음 차가운 행크스 균형 소금 용액을 포함하는 페트리 접시 10 밀리몰라 헤페로 보충, 피질 엽을 모두 해부하고 수막을 제거.그런 다음 멸균 된 블레이드로 조직을 다진다. 페판 또는 데옥시리보뉴클레우스를 함유한 15밀리리터 원뿔형 튜브로 조직을 옮기고 37도에서 20분 동안 배양하고, 5분마다 튜브를 소용돌이치며, 체퍼를 흡인하고, 완전한 DMEM 5 밀리리터를 튜브에 추가한다. 효소 활성을 비활성화하려면 5 밀리리터 유리 세로지컬 파이펫과 화염 연마 목초지 파이펫으로 조직을 분리하기 위해 신중하게 평가하십시오.40 마이크로미터 세포 스트레이너를 통해 세포 현탁액을 통과한 다음, 섭씨 4도에서 5분 동안 250회 G로 세포를 원심분리하고, 배지를 흡인하고, 75 평방 센티미터 플라스크에서 완전한 DMEM의 10 밀리리터에서 세포를 볼 수 있습니다. 4시간 의 도금 후, 신선한 DMEM 배지의 15 밀리리터로 슈퍼네이트와 매체를 교체하십시오. 마이크로글리아와 올리고드렌드로키테를 분리하기 위해 14일 간 시험관에서 플라스크를 궤도 셰이커로 6시간 동안 320 RPM으로 옮는다.섭씨 37도에서 10분 동안 세포 해리 효소 5밀리리터를 사용하십시오. 트립시인화하려면, 나머지 성상세포는 효소 작용을 비활성화하고 완전한 DMEM의 5 밀리리터를 추가한 다음 섭씨 4도에서 5분 동안 250배 G로 세포를 펠릿합니다. 완전한 DMEM에서 세포를 다시 중단하고 24 웰 플레이트에서 12 밀리미터 번호 1.5 커버 슬립에 세포를 참조하십시오.PBS를 사용하여 세포를 3번 헹구고 실온에서 10분 동안 PBS에서 4%의 포름알데히드 또는 PFA로 고정합니다. 고정 된 세포를 PBS로 5 분 동안 3 번 세척하고 PBS에서 0.1 % Triton X 100을 사용하여 10 ~ 15 분 동안 과미를 처리하십시오. 그런 다음 PBS로 세동을 반복합니다.실온에서 1시간 동안 PBS에서 5%의 정상 염소 혈청 또는 NGS를 사용하여 세포를 차단하고, 신경-2a 세포를 맵 양방향 항체와 GFAP 항체로 1~500비율로 1-500비율로 배양하여 신선 5%NGS 또는 PBS를 4°C에서 4°C. PBS에서 세포를 3회 세척한 후, 5%NGS에 플루오로포레 컨쥬게이드 이차 항체를 첨가한다. 로커의 빛으로부터 보호되는 실온에서 2시간 동안 배양하세요.PBS로 세척을 반복하고 실온에서 10 분 동안 DAPI밀리리터 당 1 마이크로 그램으로 세포를 배양하십시오. 다시 한번, PBS로 세포를 3 번 씻으십시오. 안티 페이드 장착 매체를 사용하여, 1 번 슬라이드에 커버 슬립을 장착, 그들은 어둠 속에서 하룻밤 건조하고 공초점 현미경에 이미징 때까지 섭씨 4도에서 준비 된 유리 슬라이드를 저장합니다.척수를 해부하고 24 시간 동안 섭씨 4도에서 PBS에서 4 % PFA로 수정하십시오. 이전에는 PBS에서 30%의 자당에서 24시간 동안 또는 조직이 침몰할 때까지 조직을 섭씨 4도까지 보관한 다음, 면역작용까지 조직을 섭씨 4도에 보관하고, 10월 화합물에 L4 L5 척수를 침범한 다음, 완전히 고화될 때까지 드라이 아이스에 동결한다. 30 마이크로미터에서 조직을 절개하기 위해 극저온을 사용하고 PBS를 포함하는 24 개의 웰 플레이트에서 섹션을 수집합니다.PBS에서 0.3%트리톤으로 5분간 섹션을 3회 세척하고 실온에서 2시간 동안 5%MGS를 사용하여 비특이적 결합 부위를 차단합니다. 셰이커에서 섭씨 4도에서 하룻밤 동안 섹션을 배양하십시오. Pbs에서 0.3 %의 트리톤으로 5 분 동안 섹션을 3 번 씻으시면하십시오.그런 다음 이차 항체의 적절한 농도를 추가합니다. 텍스트 원고에 따르면 실온에서 2 시간 동안 배양하고 PBS만 사용하여 섹션을 세척하고 실온에서 10 분 동안 DAPI 밀리리터 당 1 마이크로 그램으로 배양하십시오. 그런 다음 가벼운 현미경으로 PBS 세싱을 반복하고 미세 페인트 브러시로 명확한 접착제 슬라이드에 섹션을 장착합니다.커버 슬립을 실온에서 밤새 마운팅 매체로 적시시키고, 각각의 레이저로 공초점 현미경으로 심상을 획득하고, 평균 평균 크기RA 2 6 4 0.7 유래 sEV는 140 나노미터이고 피크 입자 크기는 121.8 나노미터였다. 가장 검출 가능한 입자가 엑소좀 또는 sEVS의 크기 범위 내에 떨어지면 됩니다. 50 내지 150 나노미터에서, sEV, 세포 Lysate 및 외래 매체의 서쪽 블로팅은 sEV 파생 단백질 샘플이 sEV 마커 단백질 Alix CD81 및 GAPDH를 포함하고 있음을 입증했습니다.세포 용해는 내피 성 망상, 상주 단백질 칼넥신으로 농축되었기 때문에 칼넥신은 세포 오염에 대한 부정적인 마커로서 sEV에 결석했다. sEV의 섭취량은 1시간, 10마이크로그램 sEV에 대해 발생했으며, 4시간, 5, 10마이크로그램의 sEV를 4시간 동안 배양 형광을 검출할 수 있었다. 1차 성상세포에 의한 PKH 26 표지된 sEV의 섭취를 검사하고 1차 피질 성상세포에서 sEVS 섭취량으로부터 최대 형광이 발생하였고, 24시간 PKH26 표지된 sEV를 복용하여 6시간 동안 최대 형광을 관찰하고, 뉴런 성화세포 및 마이크로글리아 세포에서 최대 형광이 관찰되었다.컨트롤, 레이블이 없는 sEV 및 염료 제어가 포함되면 언바운드 염료 패치 해안의 특정 레이블 오프리 댄스로 인해 바람이 거짓 긍정 최근 신호에 대한 코드를 생성합니다. seV의 섭취는 조리법과 세포 및 조직에 생체 분자화물 전송을 조사하고 생체 분자 또는 표적 유전자의 발현 수준에 있는 변경을 결정해서 확인할 수 있습니다. sEV 전달의 기능적 영향을 조사하기 위해 행동 연구를 수행할 수도 있습니다.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Uptake of Fluorescent Labeled Small Extracellular Vesicles In Vitro and in Spinal Cord

Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

배아 척수에서 뉴런의 Commissural 해부와 문화

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

연구

신경과학

Spinal Cord Electrophysiology II: Extracellular Suction Electrode Fabrication

척수 전기 생리학 II : 세포 흡입 전극 제작

Development of neural circuitries and locomotion can be studied using neonatal rodent spinal cord central pattern generator (CPG) behavior. We demonstrate ...

Lateral Fluid Percussion: Model of Traumatic Brain Injury in Mice

측면 유체 타악기 : 마우스의 외상성 뇌 손상 모델

Traumatic brain injury (TBI) research has attained renewed momentum due to the increasing awareness of head injuries, which result in morbidity and ...

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

역행 형광 라벨이 확인 된 신경 세포의 표적 세포 외 단일 단위 기록을 허용<em&gt; 생체 내</em

The overall goal of this method is to record single-unit responses from an identified population of neurons. In vivo electrophysiological recordings from ...

Spinal Cord Transection in the Larval Zebrafish

애벌레 Zebrafish의 척수 절개

Mammals fail in sensory and motor recovery following spinal cord injury due to lack of axonal regrowth below the level of injury as well as an inability ...

An Ex Vivo Laser-induced Spinal Cord Injury Model to Assess Mechanisms of Axonal Degeneration in Real-time

An Ex Vivo Laser-induced Spinal Cord Injury Model to Assess Mechanisms of Axonal Degeneration in Real-time

<em&gt; 전의 VIVO</em&gt; 레이저에 의한 척수 손상 모델은 실시간으로 축삭 변성의 메커니즘을 평가하기 위해

Injured CNS axons fail to regenerate and often retract away from the injury site. Axons spared from the initial injury may later undergo secondary axonal ...

Two-photon Imaging of Cellular Dynamics in the Mouse Spinal Cord

마우스 척수의 세포 역학의 두 광자 이미징

Two-photon (2P) microscopy is utilized to reveal cellular dynamics and interactions deep within living, intact tissues. Here, we present a method for ...

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

Thy1를 사용 하 여 기본 Somatosensory 피 질에서 신경 활동을 이미징-GCaMP6s 유전자 변형 쥐

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in ...

An In Vivo Duo-color Method for Imaging Vascular Dynamics Following Contusive Spinal Cord Injury

An In Vivo Duo-color Method for Imaging Vascular Dynamics Following Contusive Spinal Cord Injury

에 비보 듀오 컬러 이미징 혈관 역학 Contusive 척수 상해를 따르는 방법

Spinal cord injury (SCI) causes significant vascular disruption at the site of injury. Vascular pathology occurs immediately after SCI and continues ...

Laminectomy and Spinal Cord Window Implantation in the Mouse

마우스에 있는 Laminectomy 및 척수 창 이식

This protocol describes a method for spinal cord laminectomy and glass window implantation for in vivo imaging of the mouse spinal cord. An integrated ...