Name: uptake of fluorescent labeled small extracellular vesicles in vitro and in spinal cord
Uploaded: 2021-05-23T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Uptake of Fluorescent Labeled Small Extracellular Vesicles In Vitro and in Spinal Cord at JoVE.com

Это исследование было поддержано грантами NIH NINDS R01NS102836 и Департаментом здравоохранения Пенсильвании Commonwealth Universal Research Enhancement (CURE), присужденными Сиене К. Аджит. Мы благодарим доктора Брэдли Нэша за критическое прочтение рукописи.

ПРИМЕЧАНИЕ: Все процедуры были выполнены в соответствии с Руководством NIH по уходу и использованию лабораторных животных и одобрены Институциональным комитетом по уходу и использованию животных Медицинского колледжа Университета Дрекселя. Беременных мышей CD-1 использовали для астро?...

<ol>
	<li>Mulcahy, L. A., Pink, R. C., Carter, D. R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Routes+and+mechanisms+of+extracellular+vesicle+uptake.">Routes and mechanisms of extracellular vesicle uptake.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 3 (1), 24641 (2014).</li><li>Betzer, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+imaging+strategies+for+in+vivo+tracking+of+exosomes.">Advances in imaging strategies for in vivo tracking of exosomes.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews. Nanomedicine and Nanobiotechnology. 12 (2), 1594 (2020).</li><li>Dehghani, M., Gaborski, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+labeling+of+extracellular+vesicles.">Fluorescent labeling of extracellular vesicles.</a> Methods in Enzymology. 645, 15-42 (2020).</li><li>Gonz&#225;lez, M. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Covalently+labeled+fluorescent+exosomes+for+in+vitro+and+in+vivo+applications.">Covalently labeled fluorescent exosomes for in vitro and in vivo applications.</a> Biomedicines. 9 (1), 81 (2021).</li><li>Chuo, S. T. -. Y., Chien, J. C. -. Y., Lai, C. P. -. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+extracellular+vesicles:+current+and+emerging+methods.">Imaging extracellular vesicles: current and emerging methods.</a> Journal of Biomedical Science. 25 (1), 91 (2018).</li><li>vander Vlist, E. J., Nolte-'tHoen, E. N. M., Stoorvogel, W., Arkesteijn, G. J. A., Wauben, M. H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+labeling+of+nano-sized+vesicles+released+by+cells+and+subsequent+quantitative+and+qualitative+analysis+by+high-resolution+flow+cytometry.">Fluorescent labeling of nano-sized vesicles released by cells and subsequent quantitative and qualitative analysis by high-resolution flow cytometry.</a> Nature Protocols. 7 (7), 1311-1326 (2012).</li><li>Hoshino, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumour+exosome+integrins+determine+organotropic+metastasis.">Tumour exosome integrins determine organotropic metastasis.</a> Nature. 527 (7578), 329-335 (2015).</li><li>Heinrich, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confocal+laser+scanning+microscopy+using+dialkylcarbocyanine+dyes+for+cell+tracing+in+hard+and+soft+biomaterials.">Confocal laser scanning microscopy using dialkylcarbocyanine dyes for cell tracing in hard and soft biomaterials.</a> Journal of Biomedical Materials Research. Part B, Applied Biomaterials. 81 (1), 153-161 (2007).</li><li>Haney, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+as+drug+delivery+vehicles+for+Parkinson's+disease+therapy.">Exosomes as drug delivery vehicles for Parkinson's disease therapy.</a> Journal of Controlled Release. 207, 18-30 (2015).</li><li>Grange, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biodistribution+of+mesenchymal+stem+cell-derived+extracellular+vesicles+in+a+model+of+acute+kidney+injury+monitored+by+optical+imaging.">Biodistribution of mesenchymal stem cell-derived extracellular vesicles in a model of acute kidney injury monitored by optical imaging.</a> International Journal of Molecular Medicine. 33 (5), 1055-1063 (2014).</li><li>Wiklander, O. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicle+in+vivo+biodistribution+is+determined+by+cell+source,+route+of+administration+and+targeting.">Extracellular vesicle in vivo biodistribution is determined by cell source, route of administration and targeting.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 4, 26316 (2015).</li><li>Lai, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+and+tracking+of+tumour+extracellular+vesicle+delivery+and+RNA+translation+using+multiplexed+reporters.">Visualization and tracking of tumour extracellular vesicle delivery and RNA translation using multiplexed reporters.</a> Nature Communications. 6 (1), 7029 (2015).</li><li>Deddens, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+extracellular+vesicles+contain+miRNAs+and+are+released+as+early+biomarkers+for+cardiac+injury.">Circulating extracellular vesicles contain miRNAs and are released as early biomarkers for cardiac injury.</a> Journal of Cardiovascular Translational Research. 9 (4), 291-301 (2016).</li><li>Montecalvo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+transfer+of+functional+microRNAs+between+mouse+dendritic+cells+via+exosomes.">Mechanism of transfer of functional microRNAs between mouse dendritic cells via exosomes.</a> Blood. 119 (3), 756-766 (2012).</li><li>Escrevente, C., Keller, S., Altevogt, P., Costa, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+and+uptake+of+exosomes+by+ovarian+cancer+cells.">Interaction and uptake of exosomes by ovarian cancer cells.</a> BMC Cancer. 11, 108 (2011).</li><li>Cho, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+exosomes+and+ferritin+protein+nanocages+for+the+delivery+of+membrane+protein+therapeutics.">Comparison of exosomes and ferritin protein nanocages for the delivery of membrane protein therapeutics.</a> Journal of Controlled Release. 279, 326-335 (2018).</li><li>Mantel, P. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Malaria-infected+erythrocyte-derived+microvesicles+mediate+cellular+communication+within+the+parasite+population+and+with+the+host+immune+system.">Malaria-infected erythrocyte-derived microvesicles mediate cellular communication within the parasite population and with the host immune system.</a> Cell Host &amp; Microbe. 13 (5), 521-534 (2013).</li><li>Porro, C., Trotta, T., Panaro, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microvesicles+in+the+brain:+Biomarker,+messenger+or+mediator.">Microvesicles in the brain: Biomarker, messenger or mediator.</a> Journal of Neuroimmunology. 288, 70-78 (2015).</li><li>De Toro, J., Herschlik, L., Waldner, C., Mongini, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+roles+of+exosomes+in+normal+and+pathological+conditions:+new+insights+for+diagnosis+and+therapeutic+applications.">Emerging roles of exosomes in normal and pathological conditions: new insights for diagnosis and therapeutic applications.</a> Frontiers in Immunology. 6, 203 (2015).</li><li>Matsumoto, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transmission+of+alpha-synuclein-containing+erythrocyte-derived+extracellular+vesicles+across+the+blood-brain+barrier+via+adsorptive+mediated+transcytosis:+another+mechanism+for+initiation+and+progression+of+Parkinson's+disease.">Transmission of alpha-synuclein-containing erythrocyte-derived extracellular vesicles across the blood-brain barrier via adsorptive mediated transcytosis: another mechanism for initiation and progression of Parkinson's disease.</a> Acta Neuropathologica Communications. 5 (1), 71 (2017).</li><li>Matsumoto, J., Stewart, T., Banks, W. A., Zhang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transport+mechanism+of+extracellular+vesicles+at+the+blood-brain+barrier.">The transport mechanism of extracellular vesicles at the blood-brain barrier.</a> Current Pharmaceutical Design. 23 (40), 6206-6214 (2017).</li><li>Shaimardanova, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles+in+the+diagnosis+and+treatment+of+central+nervous+system+diseases.">Extracellular vesicles in the diagnosis and treatment of central nervous system diseases.</a> Neural Regeneration Research. 15 (4), 586-596 (2020).</li><li>Th&#233;ry, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimal+information+for+studies+of+extracellular+vesicles+2018+(MISEV2018):+a+position+statement+of+the+International+Society+for+Extracellular+Vesicles+and+update+of+the+MISEV2014+guidelines.">Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).</li><li>Hoen, E. N. M. N. -. t., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+and+qualitative+flow+cytometric+analysis+of+nanosized+cell-derived+membrane+vesicles.">Quantitative and qualitative flow cytometric analysis of nanosized cell-derived membrane vesicles.</a> Nanomedicine: Nanotechnology, Biology and Medicine. 8 (5), 712-720 (2012).</li><li>Gangadaran, P., Hong, C. M., Ahn, B. -. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+update+on+in+vivo+imaging+of+extracellular+vesicles+as+drug+delivery+vehicles.">An update on in vivo imaging of extracellular vesicles as drug delivery vehicles.</a> Frontiers in Pharmacology. 9, 169 (2018).</li><li>Teare, G. F., Horan, P. K., Slezak, S. E., Smith, C., Hay, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+tracking+of+lymphocytes+in+vivo:+the+migration+of+PKH-labeled+lymphocytes.">Long-term tracking of lymphocytes in vivo: the migration of PKH-labeled lymphocytes.</a> Cellular Immunology. 134 (1), 157-170 (1991).</li><li>Kuffler, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+survival+and+sprouting+in+culture+by+motoneurons+isolated+from+the+spinal+cord+of+adult+frogs.">Long-term survival and sprouting in culture by motoneurons isolated from the spinal cord of adult frogs.</a> Journal of Comparative Neurology. 302 (4), 729-738 (1990).</li><li>Takov, K., Yellon, D. M., Davidson, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confounding+factors+in+vesicle+uptake+studies+using+fluorescent+lipophilic+membrane+dyes.">Confounding factors in vesicle uptake studies using fluorescent lipophilic membrane dyes.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1388731 (2017).</li><li>Pu&#382;ar Dominku&#353;, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PKH26+labeling+of+extracellular+vesicles:+Characterization+and+cellular+internalization+of+contaminating+PKH26+nanoparticles.">PKH26 labeling of extracellular vesicles: Characterization and cellular internalization of contaminating PKH26 nanoparticles.</a> Biochimica et Biophysica Acta. Biomembranes. 1860 (6), 1350-1361 (2018).</li><li>Dehghani, M., Gulvin, S. M., Flax, J., Gaborski, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+evaluation+of+PKH+labelling+on+extracellular+vesicle+size+by+nanoparticle+tracking+analysis.">Systematic evaluation of PKH labelling on extracellular vesicle size by nanoparticle tracking analysis.</a> Scientific Reports. 10 (1), 9533 (2020).</li><li>Shimomura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+lipophilic+fluorescent+dyes+for+labeling+extracellular+vesicles:+characterization+and+monitoring+of+cellular+uptake.">New lipophilic fluorescent dyes for labeling extracellular vesicles: characterization and monitoring of cellular uptake.</a> Bioconjugate Chemistry. 32 (4), 680-684 (2021).</li><li>Yuan, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+exosomes+as+natural+nanocarriers+for+protein+delivery+to+inflamed+brain.">Macrophage exosomes as natural nanocarriers for protein delivery to inflamed brain.</a> Biomaterials. 142, 1-12 (2017).</li><li>Polanco, J. C., Li, C., Durisic, N., Sullivan, R., G&#246;tz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+taken+up+by+neurons+hijack+the+endosomal+pathway+to+spread+to+interconnected+neurons.">Exosomes taken up by neurons hijack the endosomal pathway to spread to interconnected neurons.</a> Acta Neuropathologica Communications. 6 (1), 10 (2018).</li><li>Jurgielewicz, B. J., Yao, Y., Stice, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetics+and+specificity+of+HEK293T+extracellular+vesicle+uptake+using+imaging+flow+cytometry.">Kinetics and specificity of HEK293T extracellular vesicle uptake using imaging flow cytometry.</a> Nanoscale Research Letters. 15 (1), 170 (2020).</li></ol>

В этом протоколе мы показали маркировку sEV красителями PKH и визуализацию их поглощения в спинном мозге. Липофильные флуоресцентные красители PKH широко используются для маркировки клеток с помощью проточной цитометрии и флуоресцентной микроскопии3,5,</s...

Небольшие внеклеточные везикулы (sEV) представляют собой наноразмерные, мембранные везикулы с диапазоном размеров 50-150 нм. Они происходят из многовезикулярных тел (MVB) и высвобождаются из клеток при слиянии MVB с плазматической мембраной. sEV содержат миРНК, мРНК, белки и биологически активные липиды, и эти молекулы переносятся между клетками в форме межклеточной связи. sEV могут быть интернализованы клетками-реципиентами различными эндоцитарными путями, и этот захват sEV клетками-реципиентами опосредован распознаванием поверхностных молекул как на EV, так и на клетках-мишенях1.
sEV приобрели интерес из-за их способности вызывать молекулярные и фенотипические изменения в акцепторных клетках, их полезности в качестве терапевтического агента и их потенциала в качестве носителей для грузовых молекул или фармакологических агентов. Из-за их небольшого размера визуализация и отслеживание sEV могут быть сложными, особенно для исследований in vivo и клинических условий. Поэтому было разработано много методов для маркировки и изображения sEV, чтобы помочь их биораспределению и отслеживанию in vitro и in vivo2.
Наиболее распространенный метод изучения биораспределения sEV и взаимодействия клеток-мишеней включает их маркировку флуоресцентными молекулами красителя3,4,5,6,7. Электромобили были первоначально помечены красителями клеточной мембраны, которые обычно использовались для изображения клеток. Эти флуоресцентные красители обычно окрашивают липидный бислой или белки, представляющие интерес на sEV. Несколько липофильных красителей демонстрируют сильный флуоресцентный сигнал при включении в цитозоль, включая DiR (1,1'-диоктадецил-3,3,3',3'-тетраметилиндотрикарбоцианин йодид), DiL (1, 1'-диоктадецил-3, 3,3', 3'-тетраметилиндокарбоцианинперхлорат) и DiD (1, 1'-диоктадецил-3, 3', 3'-тетраметилиндокарбоцианин 4-хлорбензолсульфонатная соль)8,9,10,11.
Другие липофильные красители, такие как PKH67 и PKH26, имеют высокофлуоресцентную полярную головную группу и длинный алифатический углеводородный хвост, который легко интеркалируется в любую липидную структуру и приводит к долгосрочному удержанию красителя и стабильной флуоресценции12. Красители PKH также могут маркировать EV, что позволяет изучать свойства EV in vivo13. Многие другие красители были использованы для наблюдения экзосом с использованием флуоресцентной микроскопии и проточной цитометрии, включая липидные красители14 и клеточно-проницаемые красители, такие как карбоксифлуоресцеин диацетат сукцинимидиловый эфир (CFDA-SE)15,16 и кальцеин ацетоксиметил (AM) эфир17.
Исследования sEV-опосредованных перекрестных помех между различными клетками в ЦНС дали важную информацию о патогенезе нейровоспалительных и нейродегенеративных заболеваний18. Например, sEV из нейронов могут распространять бета-амилоидные пептиды и фосфорилированные тау-белки и помогать в патогенезе болезни Альцгеймера19. Кроме того, EV, полученные из эритроцитов, содержат большое количество альфа-синуклеина и могут пересекать гематоэнцефалический барьер и способствовать патологии Паркинсона20. Способность sEV пересекать физиологические барьеры21 и переносить свои биомолекулы в клетки-мишени делает их удобными инструментами для доставки терапевтических препаратов в ЦНС22.
Визуализация поглощения сЭВ мириадами клеток ЦНС в спинном мозге позволит как механистические исследования, так и оценить терапевтические преимущества экзогенно вводимых sEV из различных клеточных источников. В данной работе описана методология маркировки sEV, полученных из макрофагов, и изображения их поглощения in vitro и in vivo в поясничном спинном мозге нейронами, микроглией и астроцитами для качественного подтверждения доставки sEV путем визуализации.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra 0.5 mL centrifugal filters</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>Z677094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Alix Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab186429</td>
			<td>1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Calnexin Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>Ab10286</td>
			<td>1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD81 Antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-166029</td>
			<td>1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-GAPDH Monoclonal Antibody (14C10)</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>2118</td>
			<td>1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Glial Fibrillary Acidic Protein Antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>MAB360</td>
			<td>1:500 for IF; 1:1000 for IHC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Iba1 Antibody</td>
			<td>Wako</td>
			<td>019-19741</td>
			<td>1:2000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-MAP2A Antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>MAB378</td>
			<td>1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>0332</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Strainer, 40 &#956;m</td>
			<td>VWR</td>
			<td>15-1040-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Tubes</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>3118-0050</td>
			<td>12,000 x g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip, 12-mm, #1.5</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>72230-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip, 18-mm, #1.5</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>72222-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9542-1MG</td>
			<td>1 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DC Protein Assay</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>500-0116</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxyribonuclease I (DNAse I)</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>D4513-1VL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey Anti-Rabbit IgG H&#38;L (HRP)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab16284</td>
			<td>1:10000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey Anti-Rabbit IgG H&#38;L, Alexa Fluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-21206</td>
			<td>1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double Frosted Microscope Slides, #1</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>12-552-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS without Calcium and Magnesium</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-031-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10-013-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Exosome-Depleted Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A27208-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>35-011-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluorChem M imaging system</td>
			<td>ProteinSimple</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FV3000 Confocal Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Mouse IgG H&#38;L (HRP)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab6789</td>
			<td>1:10000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Mouse IgG H&#38;L, Alexa Fluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-11001</td>
			<td>1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Mouse IgG1, Alexa Fluor 594</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-21125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#39;s Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>02-0121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HRP Substrate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>34094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Intercept blocking buffer, TBS</td>
			<td>LI-COR Biosciences</td>
			<td>927-60001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laemmli SDS Sample Buffer</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>AAJ61337AC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Cover Glass, #1</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48404-454</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microm HM550</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoSight NS300 system</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoSight NTA 3.2 software</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neuro-2a Cell Line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-131</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Goat Serum</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>S-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O.C.T Compound</td>
			<td>Sakura Finetek</td>
			<td>4583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Papain</td>
			<td>Worthington Biochemical Corporation</td>
			<td>NC9597281</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>19210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PKH26</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>MINI26-1KT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PKH67</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>MINI67-1KT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>1862209</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVDF Transfer Membrane</td>
			<td>MDI</td>
			<td>SVFX8302XXXX101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RAW 267.4 Cell Line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>TIB-71</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RIPA Buffer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R0278</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>AMRESCO</td>
			<td>0241-2.5KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost Plus Gold Slides</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>15-188-48</td>
			<td>adhesive slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-75 Flasks</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431464U</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tecnai 12 Digital Transmission Electron Microscope</td>
			<td>FEI Company</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEM Grids</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>FSF300-cu</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-Glycine Protein Gel, 12%</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>XP00120BOX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-Glycine SDS Running Buffer</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>LC26755</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-Glycine Transfer Buffer</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>LC3675</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express</td>
			<td></td>
			<td>cell dissociation enzyme</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>327371000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin, 0.25%</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-053-CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge Tubes</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>344058</td>
			<td>110,000 x g</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

uptake of fluorescent labeled small extracellular vesicles in vitro and in spinal cord

Небольшие внеклеточные везикулы (sEV) представляют собой везикулы 50-150 нм, секретируемые всеми клетками и присутствующие в жидкостях организма. sEV переносят биомолекулы, такие как РНК, белки и липиды, от донорских к акцепторным клеткам, что делает их ключевыми сигнальными медиаторами между клетками. В центральной нервной системе (ЦНС) sEV могут опосредовать межклеточную сигнализацию, включая нейроиммунные взаимодействия. Функции sEV могут быть изучены путем отслеживания поглощения меченых sEV в клетках-реципиентах как in vitro, так и in vivo. В данной работе описывается маркировка sEV из кондиционированных сред клеток макрофагов RAW 264.7 с использованием мембранного красителя PKH. Он показывает поглощение различных концентраций меченых sEV в несколько временных точек клетками Neuro-2a и первичными астроцитами in vitro. Также показано поглощение sEV, доставляемых интратекально в нейроны спинного мозга мыши, астроциты и микроглию, визуализированные конфокальной микроскопией. Репрезентативные результаты демонстрируют зависящие от времени вариации в поглощении sEV различными клетками, что может помочь подтвердить успешную доставку sEV в спинной мозг.

После выделения sEV из кондиционированных сред RAW 264.7 с помощью центрифугирования NTA использовали для определения концентрации и распределения по размерам очищенных sEV. Средний размер RAW 264.7-производных sEV составлял 140 нм, а пиковый размер частиц составлял 121,8 нм, подтверждая, что большинст...

Watch this Scientific Journal Video about Uptake of Fluorescent Labeled Small Extracellular Vesicles In Vitro and in Spinal Cord at JoVE.com

Uptake of Fluorescent Labeled Small Extracellular Vesicles In Vitro and in Spinal Cord

Мы описываем протокол маркировки небольших внеклеточных везикул, полученных из макрофагов, красителями PKH и наблюдаем их поглощение in vitro и в спинном мозге после интратекальной доставки.

Поглощение флуоресцентных меченых малых внеклеточных везикул in vitro и в спинном мозге

Small extracellular vesicles (sEVs) are 50-150 nm vesicles secreted by all cells and present in bodily fluids. sEVs transfer biomolecules such as RNA, ...

Визуализация поглощения небольших внеклеточных везикул, также известных как sEV, различными клетками спинного мозга, может подтвердить успешную доставку sEV. Это позволяет проводить как механистические, так и терапевтические исследования интратекально вводимых sEV из различных источников в моделях роденов. Этот протокол может быть использован для визуализации поглощения sEV клетками в мягком спинном мозге и может помочь оценить роль sEV и его молекул-грузов в спинальных расстройствах, боли и воспалении.Эта процедура будет продемонстрирована мной вместе с Сюань Ло и Чжучэн Линем, двумя аспирантами в лаборатории доктора Сины Аджит. Начните с размещения 18-миллиметровых покровных слипов в 12-луночную пластину, затем пластинчатые клетки нейро-2а в каждой скважине с общим количеством 1 миллилитра полного DMEM, содержащего 10% FBS и 1% стрептококка. Когда количество клеток беглости достигает 80-90%, изменяют среду на ДМЕМ экзосомную обедненную среду в каждую скважину добавляют один, 5 или 10 мкг меченых sEV.В течение 1, 4 и 24 часов. Для дозы и времени зависит поглощение остальных скважин при равном объеме контроля красителя. Соберите мозги послеродовых детенышей в 60-миллиметровую чашку Петри, содержащую ледяной холодный раствор соли Хэнкса, дополненную 10 миллимолярными гепе, рассекните обе корковые доли и удалите мозговые огромождения.Затем измерзать ткани стерилизованным лезвием. Переместите ткани в 15-миллилитровую коническую трубку, содержащую Pepane или дезоксирибонуклеус один диссоциационный буфер, и инкубировать в течение 20 минут при 37 градусах Цельсия, закручивая трубку каждые 5 минут, аспирировать супернатант и добавлять 5 миллилитров полного DMEM в трубку. Чтобы инактивировать активность фермента, попробуйте тщательно оценить диссоциации тканей с помощью 5-миллилитровой стеклянной серологической пипетки и пламенной полированной пастбищной пипетки.Пропустите клеточную суспензию через 40-микрометровый клеточный сетчатый фильтр, а затем центрифугируют клетки в 250 раз G в течение 5 минут при 4 градусах Цельсия, аспирируют среду и видят клетки в 10 миллилитрах полного DMEM в колбе площадью 75 квадратных сантиметров. После 4 часов покрытия замените супернат и среду 15 миллилитрами свежей среды DMEM. Через 14 дней in vitro отсоединяют микроглию и олигодендроциты, переносят колбу на орбитальный шейкер при 320 об/мин в течение 6 часов.Используйте 5 миллилитров фермента диссоциации клеток в течение 10 минут при 37 градусах Цельсия. Чтобы трипсинизировать оставшиеся астроциты, инактивировать ферментативное действие, добавляют 5 миллилитров полного DMEM, а затем гранулируют клетки в 250 раз больше G в течение 5 минут при 4 градусах Цельсия. Повторно суспендируете ячейки в полном DMEM и посмотрите, как ячейки на 12-миллиметровой крышке с номером 1,5 проскальзывают в 24-колодезной пластине.С помощью PBS промыть ячейки 3 раза, а затем зафиксировать их формальдегидом 4% мощности или PFA в PBS в течение 10 минут при комнатной температуре. Промыть неподвижные клетки 3 раза в течение 5 минут с PBS и процедить их, используя 0,1% Triton X 100 в PBS в течение 10-15 минут. Затем повторите стирку с PBS.Используйте 5% нормальную козью сыворотку или NGS в PBS в течение 1 часа при комнатной температуре, чтобы блокировать клетки, инкубировать клетки neuro-2a с картой двусторонних антител и первичные астроциты с антителами GFAP в соотношении от 1 до 500 в свежих 5% NGS или PBS на ночь при 4 градусах Цельсия с легким встряхиванием. После промывки клеток 3 раза в PBS добавляют флуорофор конъюгированных вторичных антител в 5%NGS. Инкубировать в течение 2 часов при комнатной температуре, защищенной от света на коромысле.Повторите промывку PBS и инкубируете клетку с 1 микрограммом на миллилитр DAPI в течение 10 минут при комнатной температуре. Еще раз промыть клетки 3 раза PBS. Используя антивядаю монтажную среду, установите крышку на слайды No 1, дайте им высохнуть в течение ночи в темноте и храните подготовленные стеклянные слайды при 4 градусах Цельсия до получения изображения на конфокальном микроскопе.Рассекните спинной мозг и зафиксируйте его в 4% PFA в PBS при 4 градусах Цельсия в течение 24 часов. Предварительно защищают ткани в 30% сахарозе в PBS при 4 градусах Цельсия в течение 24 часов или до тех пор, пока ткани не опустятся, а затем хранят ткани при 4 градусах Цельсия до иммуногистохимии, впитают спинной мозг L4 L5 в соединение OCT, затем замораживают его на сухом льду до полного затвердения. Используйте криостат для секционирования тканей на 30 микрометров и сбора срезов в 24 скважины, содержащей PBS.Промыть участки 3 раза по 5 минут каждый с 0,3% тритона в PBS, заблокировать неспецифические сайты связывания с помощью 5%MGS в 0,3% Triton PBS в течение 2 часов при комнатной температуре. Высиживать срезы на ночь при 4 градусах Цельсия на шейкере. Промыть секции 3 раза в течение 5 минут с 0,3% тритона в Pbs.Затем добавляют соответствующую концентрацию вторичных антител. Согласно рукописи текста, инкубируют при комнатной температуре в течение двух часов, моют участки, используя только PBS и инкубируют их в 1 микрограмм на миллилитр DAPI в течение 10 минут при комнатной температуре. Затем повторите промывки PBS под световым микроскопом, установите участки на прозрачный клеевой слайд тонкой кистью.Смочите крышку с помощью монтажной среды и отвержьте на ночь в темноте при комнатной температуре, получите изображения под конфокальным микроскопом с соответствующими лазерами, Средний размер RA 2 6 4 0,7 производных sEV составил 140 нанометров, а пиковый размер частиц составил 121,8 нанометра. С наиболее обнаруживаемыми частицами, попадающими в диапазон размеров экзосом или sEVS. На высоте от 50 до 150 нанометров западное блоттирование sEV, клеточного лизата и экзодеплементированных сред показало, что образцы белков, полученные из sEV, содержат белки-маркеры sEV Alix CD81 и GAPDH.Клеточный лизат обогащали эндоплазматическим щетикулумом, резидентным белком Calnexin, таким образом, Calnexin служил отрицательным маркером клеточного загрязнения, поскольку он отсутствовал в sEV. Было отмечено, что поглощение sEV происходило через 1 час, а для 1, 5 и 10 микрограммов sEV постинклюбационная флуоресценция могла быть обнаружена через 4 часа, для 4, 5 и 10 микрограммов sEV. Изучалось поглощение PKH 26 меченых sEV первичными астроцитами, и максимальная флуоресценция от поглощения sEVS в первичных корковых астроцитах происходила через 24 часа, когда были взяты PKH26-меченые sEV, а максимальная флуоресценция наблюдалась через 6 часов после инъекции в нейроны астроцитов и микроглиальные клетки.Включение элементов управления, немаркированных sEV и управления красителем создает код для ветра ложноположительных недавних сигналов из-за теперь специфической маркировки Opry dance несвязанным красителем пятен побережья. Поглощение seV может быть подтверждено путем исследования биомолекулярного переноса груза в рецептуру и клетки и ткани и определения изменений в уровнях экспрессии биомолекул или генов-мишеней. Также могут быть проведены поведенческие исследования, чтобы исследовать функциональное влияние доставки sEV.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Uptake of Fluorescent Labeled Small Extracellular Vesicles In Vitro and in Spinal Cord

Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

Разбор и культуры спаечный Нейроны из эмбриональных спинного мозга

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

Spinal Cord Electrophysiology II: Extracellular Suction Electrode Fabrication

Спинной мозг электрофизиологии II: внеклеточной изготовление электродов Всасывающая

Development of neural circuitries and locomotion can be studied using neonatal rodent spinal cord central pattern generator (CPG) behavior. We demonstrate ...

Lateral Fluid Percussion: Model of Traumatic Brain Injury in Mice

Боковые ударные жидкости: Модель черепно-мозговой травмой у мышей

Traumatic brain injury (TBI) research has attained renewed momentum due to the increasing awareness of head injuries, which result in morbidity and ...

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

Ретроградная Флуоресцентная маркировка Позволяет Целевые Внеклеточные единичные Запись с Выявленные Нейроны<em&gt; В естественных условиях</em

The overall goal of this method is to record single-unit responses from an identified population of neurons. In vivo electrophysiological recordings from ...

Spinal Cord Transection in the Larval Zebrafish

Перерезки спинного шнур в личиночной данио рерио

Mammals fail in sensory and motor recovery following spinal cord injury due to lack of axonal regrowth below the level of injury as well as an inability ...

An Ex Vivo Laser-induced Spinal Cord Injury Model to Assess Mechanisms of Axonal Degeneration in Real-time

An Ex Vivo Laser-induced Spinal Cord Injury Model to Assess Mechanisms of Axonal Degeneration in Real-time

<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Лазерно-индуцированное Травма спинного мозга модель для оценки Механизмы дегенерации аксонов в режиме реального времени

Injured CNS axons fail to regenerate and often retract away from the injury site. Axons spared from the initial injury may later undergo secondary axonal ...

Two-photon Imaging of Cellular Dynamics in the Mouse Spinal Cord

Два-Фотон изображений клеточной динамики в спинном мозге мыши

Two-photon (2P) microscopy is utilized to reveal cellular dynamics and interactions deep within living, intact tissues. Here, we present a method for ...

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

Imaging нейронной активности в первичной соматосенсорной коры, с помощью Thy1-GCaMP6s трансгенных мышей

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in ...

Laminectomy and Spinal Cord Window Implantation in the Mouse

Ламинэктомия и имплантация окна спинного мозга в мыши

This protocol describes a method for spinal cord laminectomy and glass window implantation for in vivo imaging of the mouse spinal cord. An integrated ...

Preparation of Rhythmically-active In Vitro Neonatal Rodent Brainstem-spinal Cord and Thin Slice

Подготовка ритмично активные в Vitro неонатальной грызунов ствола мозга-спинного мозга и тонкий ломтик

Mammalian inspiratory rhythm is generated from a neuronal network in a region of the medulla called the preB&#246;tzinger complex (pBC), which produces a ...