यह प्रोटोकॉल एक उपन्यास अग्नाशय इंट्राविटल इमेजिंग विंडो के साथ अग्न्याशय के वीवो इमेजिंग में स्थिर और दोहराव वाले सेलुलर-स्तर का वर्णन करता है। इस तकनीक का मुख्य लाभ यह है कि लाइव माउस के अग्न्याशय में तीन सप्ताह से अधिक सेलुलर स्तर तक संकल्प के साथ स्थिर, त्रि-आयामी इमेजिंग करना संभव है। सर्जिकल प्लेटफॉर्म तैयार करके शुरू करें और 70% इथेनॉल के साथ सतहों को कीटाणुरहित करें।
एनेस्थेटाइजेशन के बाद, शरीर के तापमान की निगरानी के लिए होमथर्मिक-नियंत्रित हीटिंग पैड के साथ गुदा जांच का उपयोग करें। माउस के बाएं पार्श्व से बालों को हटा दें और वैकल्पिक रूप से शराब और आयोडीन लागू करें, चीरा साइट से बाहरी सतह पर घुमाएं, चीरा साइट पर वापस कभी न जाएं, और आयोडीन के साथ समाप्त हों। फिर, माउस के बाएं पार्श्व पर 1.5 सेंटीमीटर चीरा बनाएं, त्वचा और मांसपेशियों को विच्छेदन करें।
चीरा मार्जिन में पर्स स्ट्रिंग सीवन करने के लिए काले या नायलॉन 4-0 सीवन का उपयोग करें। अंगूठी संदंश के साथ तिल्ली को ध्यान से खींचें और अग्न्याशय की पहचान करें। माउस के पार्श्व में खिड़की रखने, खिड़की के खुले स्थान के माध्यम से तिल्ली और अग्न्याशय गुजरती हैं।
फिर खिड़की की खुली जगह पर तिल्ली रखते हुए धीरे-धीरे अग्न्याशय को इमेजिंग विंडो की प्लेट पर रखें। पैनी-1 न्यूलाइट लाल को सीधे अग्न्याशय में इंजेक्ट करें। इमेजिंग विंडो के मार्जिन पर एन-ब्यूटिल सायनोक्रिलेट गोंद की बूंदों को लागू करने के लिए 31 गेज कैथेटर सुई का उपयोग करें, यह सुनिश्चित करते हुए कि गोंद की न्यूनतम मात्रा लागू की जाती है।
धीरे-धीरे इमेजिंग विंडो के मार्जिन पर 12 मिलीमीटर राउंड कवर ग्लास लगाएं। फिर, सीवन लूप को खिड़की के पार्श्व नाली में फिट करने के लिए पकड़ें और इसे तीन बार बांधें। अंत में, चूहों के जागने पर इन तंग टांके के व्यवधान को रोकने के लिए, टाई की अधिकतम समीपस्थ साइट को काट दें।
लेजर पावर सहित इंट्राविटल माइक्रोस्कोप पर स्विच करके शुरू करें। एक संवहनी कैथेटर डालने के लिए, सूचकांक और तीसरी उंगली के साथ पूंछ के समीपस्थ पक्ष पर दबाव लागू करें। यदि आवश्यक हो तो पूंछ को दीपक से गर्म करें।
70% इथेनॉल स्प्रे के साथ पूंछ नस को कीटाणुरहित करें, फिर पार्श्व पूंछ नस में 30 गेज कैथेटर डालें और पीई-10 ट्यूब में रक्त के पुनरुत्थान की कल्पना करें। इसे स्थिर करने के लिए कैथेटर पर सिल्क टेप लगाएं। फ्लोरोसेंट जांच के संयोजन के अनुसार, फिटसी डेक्सट्रान और टीएमआर डेक्सट्रान, या अन्य फ्लोरोसेंट जांच को उपयुक्त के रूप में इंजेक्ट करें।
एक होमथॉर्मिक हीटिंग पैड सिस्टम के साथ शरीर के तापमान को स्वचालित रूप से नियंत्रित करने के लिए एक गुदा जांच डालें। फिर, इंट्राविटल माइक्रोस्कोपी सेटअप के दौरान तैयार अग्नाशय इमेजिंग विंडो को विंडो धारक में डालें। माउस को सर्जिकल प्लेटफॉर्म से इमेजिंग स्टेज में ट्रांसफर करें।
इंट्राविटल इमेजिंग करने के लिए, अग्नाशय इमेजिंग खिड़की में अग्न्याशय के पूरे दृश्य को स्कैन करने के लिए, चार बार जैसे कम आवर्धन पर अग्न्याशय इमेजिंग के साथ शुरू करें। एक बार ब्याज के क्षेत्र निर्धारित किया गया है, एक उच्च आवर्धन उद्देश्य लेंस के लिए स्विच, 20 बार या ४० बार की तरह, पार्श्व और अक्षीय संकल्प के साथ सेलुलर स्तर इमेजिंग प्रदर्शन करने के लिए क्रमशः लगभग ०.५ माइक्रोमीटर और 3 माइक्रोमीटर । सेल माइग्रेशन जैसे 3डी संरचना या सेलुलर-स्तर की गतिशीलता का निरीक्षण करने के लिए जेड-स्टैक या समय-चूक इमेजिंग करें।
अग्नाशय इंट्राविटल इमेजिंग विंडो के साथ संयुक्त इंट्राविटल माइक्रोस्कोपी दीर्घकालिक ऊतक स्थिरता प्रदान करती है जो तीन सप्ताह तक व्यक्तिगत आइलेट्स को ट्रैक करने के लिए उच्च-रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग के अधिग्रहण को सक्षम बनाती है। खिड़की नसों के साथ एक C57 काले 6 एन माउस में प्रत्यारोपित-एंटी-CD31 एंटीबॉडी इंजेक्शन, एक एलेक्सा ६४७ फ्लोरोफोर के साथ संयुग्मित, व्यापक क्षेत्र इमेजिंग की सुविधा और अग्न्याशय के 3 डी इमेजिंग बढ़ाया । Acinar कोशिकाओं को आसन्न वाक्यूलेचर में अग्नाशय के ऊतकों की औसत छवियों में पहचाना गया था, क्रमशः ऑटोफ्लोरेसेंस और एंटी-सीडी 31 एंटीबॉडी का उपयोग करके कल्पना की गई थी।
मोज़ेक इमेजिंग विधि का उपयोग करना, जो उच्च-रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग के साथ एक व्यापक क्षेत्र दृश्य को जोड़ती है, आसन्न वाक्यूलेचर के साथ लगभग 40 से 50 आइलेट्स को एमआईपी-जीएफपी माउस में कल्पना की गई थी। पिछले एक अध्ययन से पता चला है कि इस स्थिर इमेजिंग विधि का उपयोग करके आइलेट्स को तीन सप्ताह तक ट्रैक किया जा सकता है। कैंसर कोशिकाओं की कल्पना करने के लिए, PANC-1 nuclite लाल कोशिकाओं को सीधे सर्जरी के दौरान माउस अग्न्याशय में प्रत्यारोपित किया गया और आसपास के जहाजों एलेक्सा ६४७ के साथ संयुग्मित विरोधी CD31 के साथ दाग रहे थे ।
इस प्रोटोकॉल का उपयोग करके, अग्नाशय के कैंसर की व्यापक क्षेत्र छवियां उत्पन्न हुईं। इससे ट्यूमर के मार्जिन को चित्रित करने में मदद मिली, साथ ही एकल सेल स्तर पर उच्च-रिज़ॉल्यूशन 3डी छवियों को प्राप्त करने में मदद मिली। इस विधि में सबसे महत्वपूर्ण कदम माउस में अग्नाशय इमेजिंग खिड़की का कुशल प्रत्यारोपण है।
फ्लोरोसेंट माउस कोशिकाओं के अन्य संयोजनों का उपयोग करना, और एंटीबॉडी जांच, या तो आइलेट्स या रद्द कोशिकाओं के साथ आसपास की कोशिकाओं की गतिशील बातचीत की पहचान की जा सकती है। इस विधि को विभिन्न रोगविज्ञानी स्थितियों और सीटू में अग्नाशय के कैंसर के सूक्ष्म वातावरण में आइलेट के परिवर्तन की खोज करने वालों द्वारा व्यापक रूप से लागू किया जा सकता है।