Name: ribo-seq in bacteria: a sample collection and library preparation protocol for ngs sequencing
Uploaded: 2021-08-07T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about RIBO-seq in Bacteria: a Sample Collection and Library Preparation Protocol for NGS Sequencing at JoVE.com

تود ALS الاعتراف بالدعم المالي لمنح تثبيت EMBO IG 3914 وPOIR. 04.04.00-00-3E9C/17-00 نفذت في إطار برنامج الفريق الأول لمؤسسة العلوم البولندية التي يشارك في تمويلها الاتحاد الأوروبي في إطار الصندوق الأوروبي للتنمية الإقليمية.

1. جمع العينات
<ol><li>إعداد ثقافة بكتيرية. نوصي بمستوى ثقافة 100 مل لكل عينة.</li>
	<li>إعداد المعدات والكواشف لجمع العينات: ملعقتان لكل عينة، معقمة 0.45 ميكرومتر غشاء استرات السليلوز المختلط (MCE) مرشحات، 50 مل أنابيب معقمة، النيتروجين السائل، 50 ملغم/ مل كلورامينيكول في 70٪ (فول / فول) الإيثانول (اختياري...

التحدي التقني الرئيسي للتنميط ريبوسوم هو الحاجة إلى منع الترجمة بسرعة من أجل التقاط لقطة من الريبوسومات على الحمض النووي الريبي في حالة فسيولوجية معينة من الاهتمام. ولتحقيق ذلك، تستخدم مثبطات الترجمة والحصاد السريع وتجميد الفلاش في النيتروجين السائل بشكل شائع. تطبيق المضادات الحيوية اخ...

تم تطوير تقنية التنميط الريبوسوم (RIBO-seq) في مختبر جوناثان ويسمان في جامعة كاليفورنيا ، سان فرانسيسكو1. بالمقارنة مع الأساليب الأخرى المستخدمة لدراسة التعبير الجيني على المستوى الترجمي ، يركز RIBO-seq على كل ربط ريبوسوم ل mRNA ويوفر معلومات حول موقعه والعدد النسبي للريبوسومات على نسخة. أنها تمكن من رصد عملية تخليق البروتين في الجسم الحي، ويمكن أن توفر دقة كودون واحد ودقة السماح لقياس كثافة الريبوسوم على حد سواء، مرنا الفردية وعلى طول النسخ الكامل في الخلية. في الأساس لتقنية ريبو-seq يكمن حقيقة أنه أثناء الترجمة يربط ريبوسوم جزيء مرنا وبالتالي يحمي جزء مدفون من النص من عملية الهضم ريبونوكليز. عند إضافة ريبونوكليز، يتم هضم الحمض النووي الريبي غير المحمي وتظل الشظايا المغلقة بالريبوسومات - التي يبلغ طولها عادة ~ 28-30 nt - سليمة. ويمكن بعد ذلك عزل هذه الشظايا، التي تسمى آثار أقدام ريبوسومية (RF)، وتسلسلها ورسم خرائط لها على النص الذي نشأت عنه مما أدى إلى الكشف عن الموضع الدقيق للريبوسومات. في الواقع، وقد استخدمت القدرة على حماية ريبوسوم شظايا مرنا منذ 1960s لدراسة الربط ribosomal ومواقع بدء الترجمة (TIS)2،3،4. ومع ذلك ، مع التقدم في تكنولوجيا التسلسل العميق ، أصبح RIBO-seq معيارا ذهبيا لرصد الترجمة5 ، والذي ، من خلال المشاركة الريبوسومية ، يمكن أن يوفر معلومات على نطاق الجينوم حول تخليق البروتين6. ريبوسوم التنميط سد الفجوة التكنولوجية التي كانت موجودة بين تحديد النسخ والبروتيوم6.
لإجراء التنميط ريبوسوم نحن بحاجة للحصول على lysate الخلية من الكائن الحي الذي نما في ظل الظروف التي تم التحقيق فيها. قد يؤدي تعطيل هذه الظروف أثناء جمع الخلايا وتحللها إلى توفير بيانات غير موثوقة. لمنع ذلك ، يتم استخدام مثبطات الترجمة والحصاد السريع وتجميد الفلاش في النيتروجين السائل. يمكن أن يتم التحلل الخلايا بواسطة طحن المبردة في التجانس الميكانيكية مثل مطحنة خلاط7،8 أو خافق حبة9، والتحوير من خلال ماصة10 أو مع إبرة11. يمكن إضافة المخزن المؤقت للتحلل قبل أو بعد وقت قصير من سحق الخلايا. في بروتوكولنا نستخدم النيتروجين السائل لقذائف الهاون والحشرات ، وكذلك أكسيد الألومنيوم كنهج ألطف لتعطيل جدار الخلية البكتيرية ، والذي يمنع قص الحمض النووي الريبي الذي غالبا ما يواجه عندما يتم تطبيق طرق مثل السونيشن. بعد السحق ، نضيف عازل تحلل بارد الجليد إلى المحتويات المبردة من قذائف الهاون. اختيار العازلة تحلل المناسبة مهم للحصول على أفضل قرار من آثار أقدام ريبوسومات. منذ قوة الأيونية يؤثر على كل من حجم RF ودقة إطار القراءة، فمن المستحسن حاليا لاستخدام المخازن المؤقتة تحلل مع قوة أيونية منخفضة والقدرة العازلة، حتى لو كان يبدو أن تكوين العازلة لا يؤثر على إشغال ريبوسومات على mRNAs11،12. المكونات الهامة للحاجز التحلل هي أيونات المغنيسيوم ، ووجود الذي يمنع تفكك الوحدات الفرعية ريبوسوم ويمنع التغيرات تشكيلية عفوية في ريبوسوماتالبكتيرية 11،13. أيونات الكالسيوم تلعب أيضا دورا هاما وضرورية لنشاط النيوكليز ميكروكوكال (MNase) المستخدمة في التنميط الريبوسوم البكتيرية طريقة14. إضافة جوانوسين 5′-[β,γ-imido]ثلاثي الفوسفات (GMP-PNP), التناظرية غير قابلة للتحلل من GTP, جنبا إلى جنب مع الكلورامفينيكول يمنع الترجمة خلال تحلل15.
عندما يتم الحصول على lysate، يتم توضيحه عن طريق الطرد المركزي وتقسيمها إلى قسمين، كل لريبو-seq وعالية الإنتاجية مجموع تسلسل مرنا (RNA-seq) لأنها تتم في وقت واحد(الشكل 1). يوفر RNA-seq نقطة مرجعية تمكن من مقارنة البيانات من كل من RIBO-seq و RNA-seq أثناء تحليل البيانات. يتم تعريف المترجم التحقيق من خلال تطبيع آثار أقدام ريبوسومات إلى وفرة مرنا16. يمكن أن تساعد البيانات من RNA-seq أيضا في تحديد الاستنساخ أو تسلسل القطع الأثرية17.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62544/62544fig01.jpg"> الشكل 1. تخطيطات إعداد عينة مرنا لريبو-seq و RNA-seq. لإعداد مكتبة ريبو-seq، يتم هضم الحمض النووي الريبي مع MNase (A)، تليها اختيار حجم RF من ~ 28-30 NT طول (B)؛ لرنا-seq يتم عزل (C)، استنفدت من rRNA (D)، ويتم تجزئة الحمض النووي الريبي الناتج عشوائيا إلى شظايا من أطوال متفاوتة (E). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62544/62544fig01large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
الخطوات الأولية لإجراء إعداد عينة لريبو-seq و RNA-seq تختلف قليلا (الشكل 1). بالنسبة للتنميط الريبوسومي ، يحتاج الليسات إلى هضمه بواسطة إندونوكليز محدد لإضعاف جزيئات الحمض النووي الريبي غير المحمية بالريبوسومات. في البروتوكولات القياسية، يتم استرداد أحادية الحصول عليها عن طريق جهاز الطرد الفائق وسادة السكروز أو الطارد الفائق الانحدار السكروز8،14. في هذه المقالة، ونحن نظهر أن هذه الخطوة ليست ضرورية لعزل RF المطلوبة لريبو-seq في البكتيريا، وبالمثل للخلايا eukaryotic18،وأن اختيار حجم شظايا مرنا طول المناسبة من هلام البولي أكريلاميد كافية.
بالنسبة ل RNA-seq ، يتم الحصول على مرنا عن طريق استنفاد الحمض النووي الريبي من إجمالي الحمض النووي الريبي - جزيئات rRNA تهجين إلى مسابير أوليغونوكليوتيد البيوتينية التي ترتبط بالخرز المغناطيسي المغلف بالستريبتافيدين. ثم تتم إزالة مجمعات rRNA-oligonucleotide-حبة من العينة مع مغناطيس مما أدى إلى rRNA المنضب عينة19،20. ثم يتم تجزئة جزيئات الحمض النووي الريبي المنقى عشوائيا بواسطة التحلل المائي القلوية. يتم تحويل الأجزاء التي تم الحصول عليها من مرنا وكذلك آثار أقدام ريبوسومات إلى مكتبات cDNA وإعدادها لتسلسل عميق(الشكل 2). وهذا ينطوي على إصلاح ينتهي اللازمة بعد التحلل المائي القلوية (لرنا) والهضم الأنزيمي (لRF): dephosphorylation من 3 'ينتهي تليها الفوسفور من نهايات 5'. الخطوات التالية هي ربط المحولات والنسخ العكسي لإنشاء إدراجات cDNA مؤطرة بتسلسل مطلوب لتسلسل الجيل التالي (NGS) باستخدام منصة Illumina. المرحلة الأخيرة من إعداد المكتبة هي رد فعل PCR حيث يتم تضخيم البنى ووضع علامات عليها مع عينة من الباركود المحدد للسماح بتعدد وتسلسل عينات مختلفة على قناة واحدة. قبل التسلسل، يتم تقييم جودة وكمية المكتبات من خلال الحمض النووي عالي الحساسية على رقاقة الكهربائي. يمكن بعد ذلك تجميع مكتبات cDNA ذات المعلمات المناسبة وتسلسلها. يمكن إجراء التسلسل على منصات Illumina مختلفة، مثل MiSeq، NextSeq أو HighSeq، اعتمادا على عدد المكتبات، وطول القراءة المطلوبة وعمق التسلسل. بعد التسلسل، يتم إجراء التحليل المعلوماتي الحيوي.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62544/62544fig02.jpg"> الشكل 2. إعداد المكتبة. يتضمن إعداد المكتبة إصلاح النهايات وربط المحولات والنسخ العكسي والتضخيم باستخدام ترميز. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62544/62544fig02large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
التنميط ريبوسوم هو أسلوب عالمي التي يمكن تعديلها بسهولة وتعديلها وفقا للمسألة العلمية. في الأصل كان يستخدم في الخميرة1، ولكن بعد فترة وجيزة تم تطبيقه على الخلايا البكتيرية21 وكذلك الكائنات الحية نموذج eukaryotic بما في ذلك الماوس10، حمار وحشي22، ذبابة الفاكهة23 و Arabidopsis thaliana24. كما تم استخدامه لدراسة أنواع مختلفة من الريبوسوم: السيتوبلازمية، الميتوكوندريا25،26 وكلوروبلاست27،28. في eukaryotes RIBO-seq عادة ما يتم تكييفها وصقلها للتحقيق في جوانب محددة من الترجمة، بما في ذلك بدء10،11،29،30،31،32، استطالة1،10،11،31،33، ريبوسوم المماطلة33 وتغيير تشكيل33. معظم التعديلات تنطوي على استخدام مثبطات الترجمة المختلفة. في البكتيريا ومع ذلك، كانت الدراسات المماثلة من الصعب إجراء بسبب ندرة مثبطات مع الآلية المطلوبة للعمل34. مثبط الترجمة الأكثر استخداما في البكتيريا هو الكلورامفينيكول (CAM) الذي يرتبط بمركز نقل بيبتيديل (PTC) ويمنع تحديد المواقع الصحيحة لل AMINOACYL-tRNA في الموقع A. ونتيجة لذلك، يمنع CAM تشكيل رابطة الببتيد مما يؤدي إلى اعتقال ريبوسومات ممدود35. أمثلة أخرى من مثبطات الترجمة في البكتيريا هي التتراسيكلين (TET)36، retapamulin (RET)34 و Onc11237 التي استخدمت للتحقيق في مواقع بدء الترجمة. TET، الذي يمنع تسليم الحمض النووي الريبي إلى ريبوسوم عن طريق التداخل المباشر مع حلقة الجذعية anticodon من tRNA في الموقع A، تم تطبيقها أصلا للتحقق من النتائج التي تم الحصول عليها من العلاج CAM لأنها على حد سواء المضادات الحيوية تثبيط ترجمة استطالة38. تم العثور على TET للكشف عن الأولية، ولكن لم يتمكن من الكشف عن TIS36الداخلية. يربط RET في PTC من الريبوسوم البكتيري ، ويمنع تكوين أول رابطة الببتيد عن طريق التدخل في استطالة أميناسيل -tRNA في الموقع A. تطبيق نتائج RET في اعتقال الريبوسومات في كل من الابتدائية وكذلك الداخلية TISS34. Onc112، ببتيد مضاد للميكروبات غني بالبرولين، يربط في نفق الخروج ويمنع ربط أمينواسيل-ترنا في موقع ريبوسومال A. ونتيجة لذلك، يمنع Onc112 مجمعات البدء من دخول مرحلة الاستطالة37.
المعلومات الرئيسية التنميط ريبوسوم يوفر هو كثافة الريبوسومات وموقفها على مرنا. تم تطبيقه بنجاح للتحقيق في التعبير الجيني التفاضلي على مستوى الترجمة في ظروف النمو المختلفة1،6، قياس الكفاءة الترجمية1،38،39 والكشف عن أحداث تنظيم الترجمة مثل التوقف الريبوسومي10. RIBO-seq يسمح أيضا للكشف عن ترجمة ncRNA المشروح، pseudogenes وإطارات القراءة المفتوحة الصغيرة غير معطاة (ORF) مما يؤدي إلى تحديد الجينات الرواية و / أو قصيرة جدا البروتين الترميز10،12،22،30،37. في مثل هذه الحالات، يمكن RIBO-seq صقل وتحسين التعليقات التوضيحية الجينوم. مع حساسيته العالية لتحديد ORFs المترجمة وطبيعتها الكمية ، يمكن أن يكون التنميط الريبوسوم أيضا بمثابة وكيل لتحديد البروتيوم أو في مساعدة دراسات البروتيوميات31،34،39. عن طريق رسم خرائط TIS، التنميط ريبوسوم يكشف N-ميؤوس منها isoforms الموسعة والمقتطعة من البروتينات المعروفة10،32. كما تم تكييف RIBO-seq لدراسة الطي المترجم المشترك للبروتينات14و21و24. تمكن هذه الطريقة من قياس معدلات الاستطالة1،10،39 أو فك سرعة codons الفردية6 وتساعد في تطوير نماذج كمية للترجمة17. طريقة التنميط ريبوسوم هي أيضا قادرة على توفير رؤى ميكانيكية في التوقف ريبوسوم في البكتيريا7،15،17، frameshifting40، وقف كودون قراءة21، إنهاء / إعادة تدوير العيوب41،42 وتشكيل ريبوسومات التغييرات33 في eukaryotes. كما تم تكييف RIBO-seq لدراسة تأثير عوامل محددة عبر المفعول على الترجمة مثلميرناس 6 والبروتينات الرابطة للجيش الملكي النيبالي في eukaryotes16،43. ومع ذلك، من المهم أن نعترف بأن التصميم التجريبي والقرار الذي تم الحصول عليه من ريبو-seq تحديد كمية المعلومات التي يمكن استخلاصها من البيانات الناتجة التسلسل12.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10X TBE (powder)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9864</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol, 99%, pure</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>125472500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine 5&#39;-Triphosphate (ATP)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>P0756S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminium oxide calcinated pure p.a.</td>
			<td>Chempur</td>
			<td>114560600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride dihydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C3881-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>190321</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA Clean &#38; Concentrator -5</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>D4004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dnase I recombinant, Rnase-free</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4716728001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA disodium salt</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>E/P140/48</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl Alcohol Absolut 99,8%&#160; Pure-P.A.-Basic</td>
			<td>POCH Avantor Performance Materials Poland S.A</td>
			<td>BA6480111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filtration apparatus</td>
			<td>VWR Collection</td>
			<td>511-0265</td>
			<td>all-glass filtration apparatus, with funnel, fritted base, cap, 47 mm &#216; spring clamp and ground joint flask</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel 40 (19:1)</td>
			<td>Rotiphorese</td>
			<td>3030.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel Loading Dye, Blue, 6X</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E6138G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guanosine 5&#8242;-[&#946;,&#947;-imido]triphosphate trisodium salt hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G0635-25MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>labZAP</td>
			<td>A&#38;A Biotechnology</td>
			<td>040-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium acetate tetrahydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M5661-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MCE membrane fiter</td>
			<td>Alfatec Technology</td>
			<td>M47MCE45GWS</td>
			<td>pore size: 0.45um</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MICROBExpress Bacterial mRNA Purification</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM1905</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiplex Small RNA Library Prep Set for Illumina</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E7300S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-Free Water</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9937</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Acetate Anhydrous Pure P.A.</td>
			<td>POCH Avantor Performance Materials Poland S.A</td>
			<td>744330113</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quick-Load pBR322 DNA-MspI Digest</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E7323A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA Clean &#38; Concentrator -25</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>R1018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2889-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium carbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>223530-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydrogen carbonate pure p.a.</td>
			<td>POCH Avantor Performance Materials Poland S.A</td>
			<td>810530115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR Gold nucleic acid gel stain</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>S11494</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 Polynucleotide Kinase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0201L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 Polynucleotide Kinase Reaction Buffer</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B0201S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBE-Urea Sample Buffer (2x)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>LC6876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris(hydroxymethyl)amino-methane, ultrapure, 99,9%</td>
			<td>AlfaAesar</td>
			<td>J65594</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100, 98%</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>327371000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea G.R.</td>
			<td>lach:ner</td>
			<td>40096-AP0</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ribo-seq in bacteria: a sample collection and library preparation protocol for ngs sequencing

تقنية التنميط الريبوسوم (RIBO-seq) هي حاليا الأداة الأكثر فعالية لدراسة عملية تخليق البروتين في الجسم الحي. ميزة هذه الطريقة، بالمقارنة مع النهج الأخرى، هي قدرتها على رصد الترجمة عن طريق رسم خرائط دقيقة لموقف وعدد من الريبوسومات على نسخة مرنا.
في هذه المقالة، نقوم بوصف المراحل المتتالية لجمع العينات وإعداد طريقة ريبو-سيك في البكتيريا، مع تسليط الضوء على التفاصيل ذات الصلة بتخطيط وتنفيذ التجربة.
وبما أن ريبو-سيك يعتمد على الريبوسومات السليمة والرنانات المرتبطة بها، فإن الخطوة الرئيسية هي التثبيط السريع للترجمة والتفكك الكافي للخلايا. وبالتالي، نقترح الترشيح وتجميد فلاش في النيتروجين السائل لحصاد الخلايا مع المعالجة المسبقة اختياري مع الكلورامفينيكول لوقف الترجمة في البكتيريا. للتفكك، نقترح طحن الخلايا المجمدة مع هاون والحشرات في وجود أكسيد الألومنيوم لتعطيل ميكانيكيا جدار الخلية. في هذا البروتوكول، لا يلزم وسادة السكروز أو جهاز طرد فائق الانحدار السكروز لتنقية أحادية. بدلا من ذلك، يتم تطبيق فصل مرنا باستخدام البولي أكريلاميد هلام الكهربائي (PAGE) تليها استئصال بصمة ريبوسومال (28-30 NT الفرقة) ويوفر نتائج مرضية. هذا يبسط إلى حد كبير الأسلوب وكذلك يقلل من الوقت ومتطلبات المعدات لهذا الإجراء. لإعداد المكتبة، نوصي باستخدام مجموعة الحمض النووي الريبي الصغيرة المتاحة تجاريا لتسلسل Illumina من نيو إنجلاند Biolabs، باتباع إرشادات الشركة المصنعة مع درجة ما من التحسين.
مكتبات cDNA الناتجة تقدم الكمية والنوعية المناسبة المطلوبة لتسلسل الجيل التالي (NGS). ويؤدي تسلسل المكتبات المعدة وفقا لنتائج البروتوكول الموصوف إلى أن يقرأ 2 إلى 10 ملايين من الملونات التي تم تعيينها بشكل فريد لكل عينة، مما يوفر بيانات كافية للتحليل المعلوماتي الحيوي الشامل. البروتوكول الذي نقدمه سريع وسهل نسبيا ويمكن تنفيذه بمعدات مختبرية قياسية.

تم الحصول على النتائج المثالية المعروضة هنا في دراسة تدرس تنظيم الترجمة في خلايا WT Bacillus الفرعية. تم تخفيف الثقافات بين عشية وضحاها إلى OD600 يساوي 0.1 في 100 مل من المتوسط الغني واحتضانها عند 37 درجة مئوية مع اهتزاز قوي حتى OD600 وصلت إلى 0.5-0.6. ثم تم استبدال الوسط الغني بالحد الأدنى ?...

Watch this Scientific Journal Video about RIBO-seq in Bacteria: a Sample Collection and Library Preparation Protocol for NGS Sequencing at JoVE.com

RIBO-seq in Bacteria: a Sample Collection and Library Preparation Protocol for NGS Sequencing

هنا نحن نصف مراحل جمع العينات وإعداد لريبو-seq في البكتيريا. ويؤدي تسلسل المكتبات المعدة وفقا لهذه المبادئ التوجيهية إلى بيانات كافية لإجراء تحليل معلوماتي حيوي شامل. البروتوكول الذي نقدمه بسيط، ويستخدم معدات مختبرية قياسية ويستغرق سبعة أيام من التحلل إلى الحصول على المكتبات.

RIBO-seq في البكتيريا: مجموعة عينة وبروتوكول إعداد المكتبة لتسلسل NGS

The ribosome profiling technique (RIBO-seq) is currently the most effective tool for studying the process of protein synthesis in vivo. The advantage of ...

تقنية التنميط ريبوسوم، وتسمى أيضا ريبو-seq، هي حاليا الأداة الأكثر فعالية لدراسة عملية تخليق البروتين في الجسم الحي. وميزة هذه الطريقة هي قدرتها على رصد الترجمة عن طريق رسم خرائط دقيقة لموقف وعدد من الريبوسومات. ويستند ريبو-seq على حقيقة أن الريبوسوم، عن طريق ربط جزيء مرنا، يحمي جزء مدفون من النص على الهضم ريبونوكليز.يمكن تسلسل الشظايا التي تم الحصول عليها ، وتسمى آثار أقدام ريبوسومية ، ورسم خرائط لها على النص الذي نشأت منه ، مما يؤدي إلى تحديد الموقف الدقيق للريبوسومات. في وقت واحد إلى ريبو-seq، يتم تنفيذ تسلسل إجمالي إنتاجية عالية مرنا لتوفير نقطة مرجعية وتمكين مقارنة البيانات من كل من ريبو-seq و RNA-seq أثناء تحليل البيانات. قبل حصاد الخلايا، يمكنك إضافة الكلورامفينيكول اختياريا إلى الثقافة البكتيرية، إلى التركيز النهائي من 100 ميكروغرام لكل ملليلتر، لمنع الترجمة.احتضان الثقافة بالمضادات الحيوية لمدة دقيقة واحدة. هذه الخطوة مهمة إذا كان الحصاد يستغرق وقتا أطول من المعتاد، حيث يسمح تثبيط الترجمة بتمديد وقت جمع العينات. جمع العينات مع نظام الترشيح قبل الحارة.يمكنك إدخال اهتزاز من أجل محاكاة ظروف النمو. توقف عن التصفية عندما تمر جميع الوسائط عبر الغشاء ، ولكن لا تسمح للمرشح بالجفاف تماما. جمع الكريات البكتيرية عن طريق كشط بسرعة الخلايا من قرص التصفية باستخدام مغرفة مطهرة مسبقا.ضع على الفور ملعقة كاملة مع الخلايا حصادها في أنبوب 50 ملليلتر مليئة النيتروجين السائل. يجب تغطية بيليه حصادها بالكامل في النيتروجين السائل. دع الكريات تتجمد جيدا، وإزاحة الخلايا المجمدة باستخدام مغرفة تم تبريدها مسبقا.أغلق الغطاء وتأكد من ثقبه. وهذا أمر مهم، حيث يمكن أن يتسبب النيتروجين السائل في انفجار الحاويات المغلقة بسبب تغير الضغط عند التبخر. إعداد GMPP، مسحة الحمض النووي، وأنابيب إيبيندورف الطازجة المخصصة لليساز.إعداد تحلل العازلة مع إضافة الكلورامفينيكول إذا لزم الأمر. تخصيص 500 ميكرولتر من العازلة تحلل لكل عينة في أنابيب منفصلة Eppendorf، ووضعها على الجليد. إزالة التلوث هاون والحشرات مع مطهر مختبر و 70٪ الإيثانول.هاون بارد والحشرات عن طريق صب النيتروجين السائل في قذائف الهاون. نقل بيليه البكتيرية المجمدة في هاون المبردة مسبقا وطحنها إلى مسحوق. إضافة ما يقرب من حجم واحد من أكسيد الألومنيوم ومواصلة طحن.الحفاظ على هاون، والحشرات، والخلايا باردة عن طريق صب النيتروجين السائل عند الحاجة، لعدم السماح لمحتويات هاون لذوبان. قبل الاستخدام مباشرة ، أضف GMPPNP ومسحة الحمض النووي إلى aliquot العازلة للتحلل. نقل الحل إلى هاون ومواصلة طحن.دع ال ليساز يذوب ببطء أثناء الطحن. عندما يذوب ال ليساز تماما، نقل الخليط إلى أنبوب إيبيندورف المبردة مسبقا والعودة إلى الجليد. الطرد المركزي lysase في 20، 0000 G لمدة خمس دقائق في أربع درجات مئوية.نقل المضادات العملاقة إلى أنابيب إيبيندورف الطازجة المبردة مسبقا ووضعها على الجليد. قياس تركيز الحمض النووي الريبي في كل عينة مخففة مع NanoDrop. تقسيم كل lysate إلى قسمين، 0.5 إلى 1 ملليغرام من الحمض النووي الريبي لريبو-seq، والباقي لRNA-seq.إلى ملليغرام واحد من الحمض النووي الريبي، إضافة 3.8 ميكرولتر من MNase في تريس pH 8، وأعلى ذلك مع عازلة تحلل إلى الحجم الإجمالي لل500 ميكرولتر. حضانة في 25 درجة مئوية، 300 طلقة في الدقيقة الواحدة، لمدة 45 دقيقة. عند الانتهاء من الحضانة، قم بتنظيف العينات باستخدام مجموعة تنظيف الحمض النووي الريبي المتاحة تجاريا.إعداد 15٪ بولياكريلاميد TBE هلام مع ثمانية اليوريا الضرس، ووضعها في خزان مع مخزن مؤقت TBE. قبل تشغيل لمدة لا تقل عن 10 دقائق في الجهد المستمر من 200 فولت. خلط العينات مع مخزن مؤقت عينة TBE-Urea.النشوة في 95 درجة مئوية لمدة دقيقة واحدة ووضعها على الفور على الجليد. غسل اليوريا عن طريق حقن TBE العازلة في آبار هلام باستخدام حقنة. تحميل العينات، وترك مسافة بئر واحدة بينهما لفصل كل عينة ومنع التلوث المتبادل.استخدام 29 النيوكليوتيدات طويلة القلة، ومزيج من 26 و 32 أوليغو النيوكليوتيدات طويلة كعلامات. تشغيل الكهربائي في الجهد المستمر من 180 فولت. إعداد العازلة العقيمة لاحتضان بين عشية وضحاها.بمجرد الانتهاء من الكهربائي، وصمة عار الجل مع الذهب SYBR. أجزاء المكوس من هلام بين 26 و 32 النيوكليوتيدات مع إبرة معقمة أو شفرة حلاقة، ووضع شظايا هلام في أنابيب منفصلة Eppendorf. تغيير الإبرة أو شفرة الحلاقة بين العينات.إضافة 200 ميكرولتر من العازلة حضانة بين عشية وضحاها إلى كل Eppendorf واحتضان العينات في 10 درجة مئوية، 1000 طلقة في الدقيقة الواحدة، بين عشية وضحاها. في اليوم التالي، تنظيف العينات مع عدة تنظيف الحمض النووي الريبي، وeeute لهم في 18 ميكرولتر من المياه الخالية من النيوكليز. آثار أقدام ريبوسومات التي تم الحصول عليها جاهزة لإعداد المكتبة.أداء استنفاد الحمض النووي الريبي ريبوسومال لعينات من الحمض النووي الريبي-seq باستخدام عدة المتاحة تجاريا. بعد ذلك، تنظيف العينات مع RNA تنظيف عدة. إجراء التحلل المائي القلوية على النحو التالي؛ إعداد العازلة التحلل المائي القلوية، إضافة حجم واحد من العازلة إلى حجم واحد من العينة، واحتضان في 95 درجة مئوية لمدة 25 دقيقة.إضافة خمسة ميكرولترات من 3 مولار خلات الصوديوم درجة الحموضة 5.5 إلى كل عينة من أجل وقف رد الفعل. تنظيف العينات مع RNA تنظيف عدة، وeeute لهم في 18 ميكرولتر من المياه الخالية من النيوكليز. الحمض النووي الريبي المجزأ عشوائيا الذي تم الحصول عليه جاهز لإعداد المكتبة.إضافة 10 ميكرولتر من العازلة رد فعل 10x وخمسة ميكرولترات من كيناز البولي كلوكليوتيد T4 إلى كل عينة. احتضان في 37 درجة مئوية لمدة ساعة ونصف الساعة. بعد هذا الوقت، إضافة ثلاثة ميكرولتر من ATP ملليمولار واحد واحتضان في 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة.بعد ذلك، تنظيف العينات مع RNA تنظيف عدة. قم بإعداد المكتبة باستخدام المجموعة المتاحة تجاريا، وفقا للبروتوكول المقدم هنا. تنفيذ الصفحة باستخدام هلام البولي أكريلاميد 6٪.وصمة عار الجل مع الذهب SYBR. أجزاء هلام المكوس التي تحتوي على المكتبات. وبالنسبة لعينات الحمض النووي الريبي- سيك، تتراوح المكتبة بين 135 و180 نيوكليوتيدات، وبالنسبة لريبو-سيك، بين 135 و170 نيوكليوتيدات.استخدام الإبر العقيمة أو شفرات الحلاقة ووضع شظايا هلام مقتطعة في أنابيب Eppendorf منفصلة. تذكر لتغيير إبرة أو شفرة الحلاقة بين العينات. إضافة 100 ميكرولتر من المياه الخالية من النيوكليز إلى كل جزء هلام مقتطع.واحتضانهم في 10 درجات مئوية، 450 طلقة في الدقيقة، بين عشية وضحاها. في اليوم التالي، تنظيف العينات مع مجموعة تنظيف الحمض النووي. المكتبات التي تم الحصول عليها جاهزة للتحكم في الجودة والكمية مع حساسية عالية ، الحمض النووي على رقاقة الكهربائي ، ومن ثم لتسلسل الجيل القادم.مكتبات cDNA الناتجة تقدم كمية ونوعية مناسبة مطلوبة لتسلسل الجيل التالي ، كما تم التحقق منها من خلال الحساسية العالية ، الحمض النووي على رقاقة الكهربائي. العصابات والقمم التي تمثل مكتبات ريبو-seq هي أكثر ضيقا وأفضل تعريفا، مقارنة مع هذا يمثل مكتبات RNA-seq. وفقا ل electrophoresis على رقاقة ، والمكتبات لديها العدسة المتوقعة.قمم إضافية أقرب إلى 200 أزواج قاعدة موجودة في مكتبات ريبو-seq قد تشير إلى ريبوسومات السبات، وليس تماما هضم آثار أقدام ريبوسومية، أو القطع الأثرية، على سبيل المثال، rRNA، ويمكن التخلص منها أثناء التحليل المعلوماتية الحيوية عندما يتم اقتطاع البيانات التي تم الحصول عليها من التسلسل ويتم تصفية الحمض النووي الريبي rRNA. ويبلغ متوسط كمية الأقراص المدمجة المتولدة في إعداد المكتبة 32 نانوغراما، مما يوفر كمية كافية من المواد اللازمة لتسلسل الجيل التالي. بعد مراقبة الجودة عن طريق الكهربائي على رقاقة، تم سحب المكتبات لتسلسل زوج واحد و 50 قاعدة على منصة NextSeq 500 في Illumina.وأدى تشذيب المحولات والتسلسلات ذات النوعية الرديئة إلى 25 إلى 47 مليون قراءة لكل عينة لعينات الحمض النووي الريبي- seq، و25 إلى 50 مليون قراءة لكل عينة لعينات ريبو- سيك. تم فحص البيانات التي تم الحصول عليها مع FastQC مراقبة الجودة. وقدم كل من RNA-seq وريبو-seq عينات ذات نوعية جيدة جدا.وأسفر رسم خرائط المكتبات المعدة وفقا للبروتوكول الموصوف عن 2.4 إلى 9.6 مليون من القراءات المرسومة بشكل فريد لكل عينة لعينات الحمض النووي الريبي - سيك، و 2.3 إلى 10.4 مليون من القراءات المرسومة بشكل فريد لعينات ريبو- سيك. تظهر بيانات RIBO-seq ثلاث مرات دورية وذروة طويلة وضيقة ، تتوافق مع الريبوسومات البادئة وخصائص آثار أقدام الريبوسومات ، والتي لا يلاحظها بيانات الحمض النووي الريبي- seq. وعلاوة على ذلك، تكشف المؤامرة التي تبين ملامح متوسط تغطية آثار أقدام الريبوسومات وشظايا الحمض النووي الريبي على تسلسل الترميز عن ارتفاع نسبة القراءات المرسومة إلى CDS في مجموعة بيانات ريبو-سيك، كما هو متوقع.أظهر تصور آثار أقدام الريبوسومات المرسومة أنماطا متشابهة جدا مقارنة بالنتائج التي تم الحصول عليها من نفس التجربة التي أجريت وفقا لإجراء RIBO-seq القياسي ، والذي يتضمن استردادا أحاديا عن طريق الطرد الفائق الانحدار من السكروز. وقد استخدم بروتوكولنا للتحقيق في تنظيم الترجمة في ظروف النمو المختلفة، ولكن يمكن تطبيقه لدراسة جوانب أخرى من الترجمة، مثل الكشف عن مواقع بدء الترجمة وجينات ترميز البروتين الجديدة. ويؤدي تسلسل المكتبات المعدة وفقا للمبادئ التوجيهية إلى بيانات كافية لإجراء تحليل معلوماتي حيوي شامل.البروتوكول الذي نقدمه هنا سريع وسهل وفعال من حيث التكلفة، ويمكن تنفيذه بمعدات مختبرية قياسية.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

إعداد نموذج لتحديد الهوية الجماعية على أساس قياس الطيف الكتلي للجيش الملكي النيبالي-ربط المناطق

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

An All-in-one Sample Holder for Macromolecular X-ray Crystallography with Minimal Background Scattering

حامل عينة الكل في واحد لبلورات الأشعة السينية الجزيئية مع الحد الأدنى من تشتت الخلفية

Macromolecular X-ray crystallography (MX) is the most prominent method to obtain high-resolution three-dimensional knowledge of biological macromolecules. ...

A Plasma Sample Preparation for Mass Spectrometry using an Automated Workstation

إعداد عينة البلازما لقياس الطيف الكتلي باستخدام محطة عمل آلية

Sample preparation for mass spectrometry analysis in proteomics requires enzymatic cleavage of proteins into a peptide mixture. This process involves ...

Sample Preparation for Probe Electrospray Ionization Mass Spectrometry

إعداد عينة لمسبار Electrospray قياس الطيف الكتلي

Mass spectrometry (MS) is a powerful tool in analytical chemistry because it provides very accurate information about molecules, such as mass-to-charge ...

TMT Sample Preparation for Proteomics Facility Submission and Subsequent Data Analysis

إعداد عينة TMT لتقديم مرافق Proteomics وتحليل البيانات اللاحقة

Proteomic technologies are powerful methodologies that can aid our understanding of mechanisms of action in biological systems by providing a global view ...

MS2-Affinity Purification Coupled with RNA Sequencing in Gram-Positive Bacteria

MS2-تقارب تنقية مقرونة تسلسل الحمض النووي الريبي في البكتيريا إيجابية الغرام

Although small regulatory RNAs (sRNAs) are widespread among the bacterial domain of life, the functions of many of them remain poorly characterized ...

NMR-Based Fragment Screening in a Minimum Sample but Maximum Automation Mode

فحص الأجزاء القائم على الرنين المغناطيسي النووي في الحد الأدنى من العينة ولكن وضع الأتمتة الأقصى

Fragment-based screening (FBS) is a well-validated and accepted concept within the drug discovery process both in academia and industry. The greatest ...

A Sample Preparation Pipeline for Microcrystals at the VMXm Beamline

خط أنابيب إعداد عينة للبلورات الدقيقة في خط شعاع VMXm

The mounting of microcrystals (&#60;10 &#181;m) for single crystal cryo-crystallography presents a non-trivial challenge. Improvements in data quality ...

Sample Preparation and Transfer Protocol for In-Vacuum Long-Wavelength Crystallography on Beamline I23 at Diamond Light Source

بروتوكول تحضير العينات ونقلها لعلم البلورات طويل الطول الموجي داخل الفراغ على خط الشعاع I23 في مصدر ضوء الماس

Long-wavelength macromolecular crystallography (MX) exploits the anomalous scattering properties of elements, such as sulfur, phosphorus, potassium, ...

Preparation of High-Temperature Sample Grids for Cryo-EM

إعداد شبكات عينات ذات درجة حرارة عالية ل Cryo-EM

The sample grids for cryo-electron microscopy (cryo-EM) experiments are usually prepared at a temperature optimal for the storage of biological samples, ...