Name: ribo-seq in bacteria: a sample collection and library preparation protocol for ngs sequencing
Uploaded: 2021-08-07T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about RIBO-seq in Bacteria: a Sample Collection and Library Preparation Protocol for NGS Sequencing at JoVE.com

ALS vil gerne anerkende den finansielle støtte fra EMBO Installation Grants IG 3914 og POIR. 04.04.00-00-3E9C/17-00 gennemført inden for rammerne af det første TEAM-program under Instituttet for Polsk Videnskab, der medfinansieres af Den Europæiske Union under Den Europæiske Fond for Regionaludvikling.

1. Prøveindsamling
<ol><li>Forbered en bakteriekultur. Vi anbefaler et kulturvolumen på 100 mL pr. prøve.</li>
	<li>Forbered udstyr og reagenser til prøveopsamling: to scoopulas pr. prøve, sterile 0,45 μm blandede celluloseestere membranfiltre (MCE), 50 ml sterile rør, flydende nitrogen, 50 mg/ml chloramphenicol i 70% (vol/vol) ethanol (valgfrit). Låget på 50 mL rør punkteres, så flydende nitrogen fordampes, og der forhindres eksplosion af lukkede rør. Dekontaminere scoopulas med laboratorievaskemiddel og 7...

Den vigtigste tekniske udfordring ved ribosome profilering er behovet for hurtigt at hæmme oversættelsen for at fange et øjebliksbillede af ribosomer på mRNA'er på en bestemt fysiologisk tilstand af interesse. For at opnå dette anvendes oversættelseshæmmere, hurtig høst og flashfrysning i flydende nitrogen. Anvendelse af antibiotika er valgfrit, da de kan forårsage artefakter. Chloramphenicol er et almindeligt anvendt lægemiddel til at arrestere aflange ribosomer i bakteriel RIBO-seq. Det forhindrer dog ikke, ...

Den ribosome profilering teknik (RIBO-seq) blev udviklet i laboratoriet af Jonathan Weissman ved University of California, San Francisco1. I forhold til andre metoder, der anvendes til at studere genekspression på oversættelsesniveau, fokuserer RIBO-seq på hver ribosombinding til mRNA og giver information om dets placering og det relative antal ribosomer på en udskrift. Det gør det muligt at overvåge processen med proteinsyntese in vivo og kan give enkelt codonopløsning og nøjagtighed, der gør det muligt at måle ribosomtætheden på begge, det enkelte mRNA og langs hele transskriptomet i cellen. Ved grundlæggelsen af RIBO-seq teknikken ligger det faktum, at ribosomet under oversættelsen binder mRNA-molekylet og dermed beskytter det begravede fragment af transskriptionen mod en ribonukleas fordøjelse. Ved tilsætning af ribonuklease fordøjes det ubeskyttede mRNA, og fragmenterne omgivet af ribosomer - typisk på ~ 28-30 nt lange - forbliver intakte. Disse fragmenter, kaldet ribosomale fodspor (RF), kan derefter isoleres, sekventeres og kortlægges på udskriften, de stammer fra, hvilket resulterer i påvisning af ribosomernes nøjagtige position. Faktisk har ribosome evne til at beskytte mRNA fragmenter blevet brugt siden 1960'erne til at studere ribosomal bindende og oversættelse indledning sites (TIS)2,3,4. Men med avancement i dyb sekventering teknologi, RIBO-seq er blevet en guldstandard for oversættelse overvågning5, som gennem ribosome engagement, kan give et genom-dækkende oplysninger om proteinsyntese6. Ribosome profilering fyldte den teknologiske kløft, der eksisterede mellem at kvantificere transskriptionen og proteome6.
For at udføre ribosome profilering er vi nødt til at få celle lysat af organismen, der var vokset under de undersøgte forhold. Afbrydelse af disse tilstande under celleindsamling og lysis kan give upålidelige data. For at forhindre dette anvendes oversættelseshæmmere, hurtig høst og flashfrysning i flydende nitrogen. Celler kan lyses ved kryogen slibning i en mekanisk homogenisator som en mixermølle7,8 eller en perlebanker9og ved triturering gennem en pipette10 eller med en nål11. Lysisbufferen kan tilføjes lige før eller kort efter pulverisering af cellerne. I vores protokol bruger vi flydende nitrogen til at forkøle mørtel og støder på støder på aluminiumoxid som en blidere tilgang til forstyrrelse af bakteriecellevæggen, hvilket forhindrer RNA-klipning, der ofte opstår, når metoder som sonificering anvendes. Efter pulverisering tilføjer vi en iskold lysisbuffer i mørtelens afkølede indhold. Valg af en passende lysis buffer er vigtig for at opnå den bedste opløsning af ribosomale fodspor. Da ionisk styrke påvirker både RF-størrelsen og læserammens præcision, anbefales det i øjeblikket at bruge lysis buffere med lav ionisk styrke og bufferkapacitet, selvom det ser ud til, at buffersammensætningen ikke påvirker ribosomal belægning påmRNA'er 11,12. Vigtige komponenter i lysis bufferen er magnesiumioner, hvis tilstedeværelse forhindrer dissociation af ribosomale underenheder og hæmmer spontane kropsbygningsændringer i bakterielle ribosomer11,13. Calciumioner spiller også en væsentlig rolle og er afgørende for aktiviteten af mikrokokkerner (MNase), der anvendes i den bakterielle ribosome profilering metode14. Tilsætning af guanosin 5′-[β,γ-imido]triphosphat (GMP-PNP), en ikke-hydrolyserbar analog af GTP, sammen med chloramphenicol hæmmer oversættelse under lysis15.
Når lysatet opnås, afklares det ved centrifugering og opdeles i to portioner, hver for en RIBO-seq og en høj gennemløbssum mRNA-sekventering (RNA-sekt), da de udføres samtidigt (Figur 1). RNA-seq er et referencepunkt, der gør det muligt at sammenligne data fra både RIBO-seq og RNA-seq under dataanalyse. Den undersøgte oversættelse defineres ved normalisering af ribosomale fodspor til mRNA-overflod16. Data fra RNA-seq kan også hjælpe med at identificere kloning eller sekventering af artefakter17.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62544/62544fig01.jpg"> Figur 1. Skemaer over mRNA-prøveforberedelse til RIBO-seq og RNA-seq. For RIBO-seq bibliotek forberedelse, er RNA fordøjet med MNase (A), efterfulgt af størrelsen udvælgelse af RF på ~ 28-30 nt længde (B); for RNA-seq RNA er isoleret (C), udtømt af rRNA (D), og den resulterende mRNA er tilfældigt fragmenteret i fragmenter af varierende længde (E). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62544/62544fig01large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
De første trin i proceduren for prøveforberedelse til RIBO-seq og RNA-seq varierer en smule (figur 1). Til ribosomal profilering skal lysatet fordøjes af en bestemt endonuklease for at nedbryde de mRNA-molekyler, der ikke er beskyttet af ribosomerne. I standardprotokoller genvindes de opnåede monosomer ved hjælp af en saccharosepude ultracentrifugering eller en saccharosegradient ultracentrifugering8,14. I denne artikel viser vi, at dette trin ikke er nødvendigt for at isolere RF, der kræves til RIBO-seq i bakterier, ligeledes for eukaryote celler18, og at størrelsesvalg af passende længde mRNA-fragmenter fra polyacrylamidgelen er tilstrækkelig.
For RNA-seq opnås mRNA ved udtømning af rRNA fra de samlede RNA - rRNA-molekyler hybridiseres til de biotinylerede oligonukleotidsondesonder, der binder sig til de strøede magnetiske perler. RRNA-oligonukleotidperleotidperle komplekserne fjernes derefter fra prøven med en magnet , hvilket resulterer i en rRNA-udtømt prøve19,20. De rensede mRNA molekyler er derefter tilfældigt fragmenteret af alkalisk hydrolyse. De opnåede fragmenter af mRNA samt ribosomale fodspor omdannes til cDNA-biblioteker og forberedes til dyb sekventering (Figur 2). Dette indebærer, at der er behov for reparation efter alkalisk hydrolyse (for mRNA) og enzymatisk fordøjelse (for RF): dephosphorylering af 3' ender efterfulgt af fosforylering af 5' ender. De næste skridt er adaptere ligation og den omvendte transskription til at skabe cDNA skær indrammet af sekvenser, der kræves for den næste generation sekventering (NGS) ved hjælp af Illumina platform. Den sidste fase af biblioteksforberedelsen er en PCR-reaktion, hvor konstruktionerne forstærkes og mærkes med prøvespecifikke stregkoder for at tillade multipleksering og sekventering af forskellige prøver på en kanal. Før sekventering vurderes bibliotekernes kvalitet og kvantitet af den højfølsomme DNA on-chip elektroforese. cDNA-biblioteker med passende parametre kan derefter grupperes og sekventeres. Sekventering kan udføres på forskellige Illumina-platforme, såsom MiSeq, NextSeq eller HighSeq, afhængigt af antallet af biblioteker, krævet læselængde og sekventeringsdybde. Efter sekventering udføres den bioinformatiske analyse.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62544/62544fig02.jpg"> Figur 2. Biblioteksforberedelse. Biblioteksforberedelse omfatter enderne reparation, adaptere ligation, omvendt transskribering og forstærkning med stregkoder. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62544/62544fig02large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
Ribosome-profilering er en universel metode, der let kan ændres og justeres i henhold til det videnskabelige spørgsmål. Oprindeligt blev det brugt i gær1, men kort efter blev det anvendt på bakterieceller21 samt eukaryote model organismer, herunder mus10, zebrafisk22, frugt flyve23 og Arabidopsis thaliana24. Det blev også brugt til at studere forskellige ribosomtyper: cytoplasmisk, mitokondrie25,26 og chloroplast27,28. I eukaryoter tilpasses og raffineres RIBO-seq almindeligvis til at undersøge specifikke aspekter af oversættelse, herunder indledning10,11,29,30,31,32, forlængelse1,10,11,31,33, ribosome stalling33 og kropsbygningsændring33. De fleste af ændringerne indebærer brug af forskellige oversættelseshæmmere. I bakterier har analoge undersøgelser imidlertid været vanskelige at gennemføre på grund af mangel på hæmmere med den krævede virkningsmekanisme34. Den mest anvendte oversættelseshæmmer i bakterier er chloramphenicol (CAM), som binder sig til peptidyl transferase center (PTC) og forhindrer korrekt placering af aminoacyl-tRNA i A-sitet. Som følge heraf forhindrer CAM dannelsen af en peptidbinding, hvilket fører til at arrestere de aflange ribosomer35. Andre eksempler på oversættelseshæmmere i bakterier er tetracyklin (TET)36, retapamulin (RET)34 og Onc11237, som er blevet brugt til at undersøge oversættelsesindledningssteder. TET, som forhindrer tRNA levering til ribosomet ved direkte overlapning med anticodon stem-loop af tRNA på A-sitet, blev oprindeligt anvendt til at kontrollere resultaterne fra CAM behandling, da de begge er antibiotika hæmmende oversættelse forlængelse38. TET blev fundet at opdage primære TIS, men var ude af stand til at afsløre interne TIS36. RET binder i PTC af bakterielle ribosom, og forhindrer dannelsen af den første peptid obligation ved at forstyrre en langstrakt aminoacyl-tRNA i A site. Anvendelse ret resulterer i ribosomer anholdelse på både primære såvel som interne TISs34. Onc112, en proline-rig antimikrobiel peptid, binder i exit tunnel og blokerer aminoacyl-tRNA binding i ribosomal A site. Som følge heraf forhindrer Onc112 indledningskomplekser i at komme ind i forlængelsesfasen37.
De vigtigste oplysninger ribosome profilering giver, er ribosomer tæthed og deres position på mRNA. Det blev anvendt med succes til at undersøge differentialgenudtryk på oversættelsesniveau under forskellige vækstbetingelser1,6, måle translationel effektivitet1,38,39 og opdage oversættelsesreguleringshændelser som ribosomal pause10. RIBO-seq giver også mulighed for at afdække oversættelsen af kommenterede ncRNA, pseudogener og ikke-kommenterede små åbne læserammer (ORF), der fører til identifikation af nye og / eller meget korte proteinkodningsgener10,12,22,30,37. I sådanne tilfælde kan RIBO-seq finjustere og forbedre genomanmærkning. Ribosome-profilering kan med sin høje følsomhed for identifikation af oversatte ORF'er og dens kvantitative karakter også tjene som en indikator for proteomebestemmelsen eller i støtteproteomics-undersøgelserne31,34,39. Ved kortlægning TIS, ribosome profilering afslører N-terminalt udvidet og afkortet isoformer af kendte proteiner10,32. RIBO-seq blev også tilpasset til at studere samtidig sammenlægning af proteiner14,21,24. Denne metode gør det muligt at måle forlængelseshastigheder1,10,39 eller afkodningshastigheder for de enkelte codoner6 og hjælper med at udvikle kvantitative oversættelsesmodeller17. Den ribosome profilering metode er også i stand til at give mekanistisk indsigt i ribosome pause i bakterier7,15,17, frameshifting40, stop-codon readthrough21, opsigelse / genanvendelse defekter41,42 og ribosomal kropsbygning ændringer33 i eukaryoter. RIBO-seq blev også tilpasset for at undersøge specifikke transvirkende faktorers indvirkning på oversættelse såsom miRNA6 og RNA-bindende proteiner i eukaryoter16,43. Det er dog vigtigt at erkende, at det eksperimentelle design og den opnåede opløsning af RIBO-seq bestemmer mængden af oplysninger, der kan udtrækkes fra de resulterende sekventeringsdata12.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10X TBE (powder)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9864</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol, 99%, pure</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>125472500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine 5&#39;-Triphosphate (ATP)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>P0756S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminium oxide calcinated pure p.a.</td>
			<td>Chempur</td>
			<td>114560600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride dihydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C3881-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>190321</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA Clean &#38; Concentrator -5</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>D4004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dnase I recombinant, Rnase-free</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4716728001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA disodium salt</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>E/P140/48</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl Alcohol Absolut 99,8%&#160; Pure-P.A.-Basic</td>
			<td>POCH Avantor Performance Materials Poland S.A</td>
			<td>BA6480111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filtration apparatus</td>
			<td>VWR Collection</td>
			<td>511-0265</td>
			<td>all-glass filtration apparatus, with funnel, fritted base, cap, 47 mm &#216; spring clamp and ground joint flask</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel 40 (19:1)</td>
			<td>Rotiphorese</td>
			<td>3030.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel Loading Dye, Blue, 6X</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E6138G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guanosine 5&#8242;-[&#946;,&#947;-imido]triphosphate trisodium salt hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G0635-25MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>labZAP</td>
			<td>A&#38;A Biotechnology</td>
			<td>040-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium acetate tetrahydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M5661-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MCE membrane fiter</td>
			<td>Alfatec Technology</td>
			<td>M47MCE45GWS</td>
			<td>pore size: 0.45um</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MICROBExpress Bacterial mRNA Purification</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM1905</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiplex Small RNA Library Prep Set for Illumina</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E7300S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-Free Water</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9937</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Acetate Anhydrous Pure P.A.</td>
			<td>POCH Avantor Performance Materials Poland S.A</td>
			<td>744330113</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quick-Load pBR322 DNA-MspI Digest</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E7323A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA Clean &#38; Concentrator -25</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>R1018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2889-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium carbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>223530-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydrogen carbonate pure p.a.</td>
			<td>POCH Avantor Performance Materials Poland S.A</td>
			<td>810530115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR Gold nucleic acid gel stain</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>S11494</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 Polynucleotide Kinase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0201L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 Polynucleotide Kinase Reaction Buffer</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B0201S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBE-Urea Sample Buffer (2x)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>LC6876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris(hydroxymethyl)amino-methane, ultrapure, 99,9%</td>
			<td>AlfaAesar</td>
			<td>J65594</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100, 98%</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>327371000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea G.R.</td>
			<td>lach:ner</td>
			<td>40096-AP0</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ribo-seq in bacteria: a sample collection and library preparation protocol for ngs sequencing

Ribosome-profileringsteknikken (RIBO-seq) er i øjeblikket det mest effektive værktøj til at studere processen med proteinsyntese in vivo. Fordelen ved denne metode, i forhold til andre tilgange, er dens evne til at overvåge oversættelse ved præcist at kortlægge placeringen og antallet af ribosomer på en mRNA-udskrift.
I denne artikel beskriver vi de efterfølgende stadier af prøveindsamling og forberedelse til RIBO-seq-metoden i bakterier og fremhæver de detaljer, der er relevante for planlægningen og udførelsen af eksperimentet.
Da RIBO-seq er afhængig af intakte ribosomer og relaterede mRNA'er, er det vigtigste trin hurtig hæmning af oversættelse og tilstrækkelig opløsning af celler. Således foreslår vi filtrering og flash-frysning i flydende nitrogen til cellehøst med en valgfri forbehandling med chloramphenicol for at arrestere oversættelse i bakterier. Til opløsning foreslår vi slibning af frosne celler med mørtel og støder i nærværelse af aluminiumoxid for mekanisk at forstyrre cellevæggen. I denne protokol kræves der ikke saccharosepude eller en saccharosegradient ultracentrifugering til monosomerensning. I stedet anvendes mRNA-adskillelse ved hjælp af polyacrylamidgelelektroforese (PAGE) efterfulgt af ribosomal fodaftryk excision (28-30 nt bånd) og giver tilfredsstillende resultater. Dette forenkler i vid udstrækning metoden samt reducerer tids- og udstyrskravene til proceduren. Til biblioteksforberedelse anbefaler vi at bruge det kommercielt tilgængelige lille RNA-sæt til Illumina-sekventering fra New England Biolabs efter producentens retningslinjer med en vis grad af optimering.
De resulterende cDNA-biblioteker præsenterer passende mængde og kvalitet, der kræves til næste generations sekventering (NGS). Sekvensering af biblioteker udarbejdet i henhold til den beskrevne protokol resulterer i 2 til 10 mln entydigt kortlagt læser per prøve giver tilstrækkelige data til omfattende bioinformatik analyse. Den protokol, vi præsenterer, er hurtig og relativt nem og kan udføres med standardlaboratorieudstyr.

De eksemplariske resultater, der præsenteres her, blev opnået i en undersøgelse, der undersøgte oversættelsesforordningen ved sporulering af WT Bacillus subtilis-celler. Fra den ene dag til den anden blev kulturerne fortyndet tilOD 600 svarende til 0,1 ud af 100 mL rigt medium og inkuberet ved 37 °C med kraftig rysten, indtil OD600 nåede 0,5-0,6. Det rige medium blev derefter erstattet med minimal medium for at fremkalde sporulationsproces, og inkubationen blev fortsat i op til fire ...

Watch this Scientific Journal Video about RIBO-seq in Bacteria: a Sample Collection and Library Preparation Protocol for NGS Sequencing at JoVE.com

RIBO-seq in Bacteria: a Sample Collection and Library Preparation Protocol for NGS Sequencing

Her beskriver vi stadierne i prøveindsamling og forberedelse til RIBO-seq i bakterier. Rækkefølgen af de biblioteker, der er udarbejdet i henhold til disse retningslinjer, resulterer i tilstrækkelige data til omfattende bioinformatikanalyse. Den protokol, vi præsenterer, er enkel, bruger standardlaboratorieudstyr og tager syv dage fra lysis til at få biblioteker.

RIBO-seq i bakterier: en prøvesamling og biblioteksforberedelsesprotokol til NGS-sekventering

The ribosome profiling technique (RIBO-seq) is currently the most effective tool for studying the process of protein synthesis in vivo. The advantage of ...

Ribosome-profileringsteknikken, også kaldet RIBO-seq, er i øjeblikket det mest effektive værktøj til at studere processen med proteinsyntese in vivo. Fordelen ved denne metode er dens evne til at overvåge oversættelse ved præcist at kortlægge placeringen og antallet af ribosomer. RIBO-seq er baseret på det faktum, at ribosomet ved at binde sig til mRNA-molekylet beskytter det begravede fragment af udskriften ved ribonuklease fordøjelse.De opnåede fragmenter, kaldet ribosomale fodspor, kan sekventeres og kortlægges på udskriften, de stammer fra, hvilket resulterer i bestemmelse af ribosomernes nøjagtige position. Samtidig til RIBO-seq udføres der en høj gennemløbssummRNA-sekventering for at give et referencepunkt og gøre det muligt at sammenligne data fra både RIBO-seq og RNA-seq under dataanalyse. Før cellerne høster, kan du eventuelt tilføje chloramphenicol til bakteriekulturen, til den endelige koncentration af 100 mikrogram pr. milliliter, for at hæmme oversættelsen.Inkuber kulturen med antibiotika i et minut. Dette trin er vigtigt, hvis høsten tager længere tid end normalt, da oversættelseshæmning gør det muligt at forlænge prøveindsamlingstiden. Prøverne opsamles med et forvarmet filtreringssystem.Du kan introducere rystelser for at efterligne vækstbetingelser. Stop filtreringen, når alle medier har passeret membranen, men lad ikke filteret tørre helt. Opsamle bakteriel pellets ved hurtigt at skrabe cellerne ud af filterskiven ved hjælp af en forvarmet, desinficeret scoopula.Placer straks hele scoopulaen med de høstede celler i 50 milliliterrør fyldt med flydende nitrogen. Den høstede pellet skal være helt dækket af flydende nitrogen. Lad pellet fryse grundigt, og løsne frosne celler ved hjælp af en tidligere afkølet scoopula.Luk låget, og sørg for, at det er punkteret. Dette er vigtigt, da flydende nitrogen kan få lukkede beholdere til at eksplodere på grund af trykændringen ved fordampning. Forbered GMPP, DNA-podning og friske Eppendorf-rør dedikeret til lysase.Forbered lysis buffer med tilsætning af chloramphenicol om nødvendigt. Tildel 500 mikroliter lysis buffer pr. prøve i separate Eppendorf-rør, og læg dem på is. Dekontaminere mørtel og støder med et laboratoriedesinficeringsmiddel og 70% ethanol.Afkøl mørtel og støder ved at hælde flydende nitrogen i mørtelen. Overfør den frosne bakteriel pellet til en forkølet mørtel og slib den til et pulver. Tilsæt ca. et volumen aluminiumoxid og fortsæt slibning.Hold mørtel, støder, og cellerne afkøles ved at hælde flydende nitrogen, når det er nødvendigt, for ikke at lade indholdet af mørtelen tø op. Lige før du bruger, tilsættes GMPPNP og DNA podning i lysis buffer aliquot. Overfør opløsningen til mørtelen og fortsæt slibning.Lad lysase tø langsomt, mens slibning. Når lysasen tøer helt op, overføres blandingen til det forkølede Eppendorf-rør og vende tilbage til is. Centrifuge lysase ved 20.000 G i fem minutter ved fire Celsius grader.Overfør supernatants i friske, forkølede Eppendorf rør og læg dem på is. RNA-koncentrationen måles i hver fortyndet prøve med NanoDrop. Del hvert lysat i to portioner, 0,5 til 1 milligram RNA for RIBO-seq, og resten for RNA-seq.Til en milligram af RNA, tilsæt 3,8 mikroliter MNase i Tris pH 8, og top det op med lysis buffer til det samlede volumen på 500 mikroliter. Inkuber ved 25 Celsius grader, 300 runder i minuttet, i 45 minutter. Når inkubationen er færdig, skal prøverne rengøres med et kommercielt tilgængeligt RNA-oprydningssæt.Forbered 15%polyacrylamid TBE gel med otte molar urinstof, og læg den i en tank med TBE buffer. Forkør i mindst 10 minutter ved en konstant spænding på 200 volt. Bland prøverne med TBE-Urea prøvebuffer.Denature ved 95 Celsius grader i et minut og læg dem straks på is. Urinstofvasken vaskes af ved at indsprøjte TBE-bufferen i gelbrønde ved hjælp af en sprøjte. Prøverne skal lastes, så der er et godt mellemrum mellem dem for at adskille hver prøve og forhindre krydskontaminering.Brug 29 nukleotider lange oligo, og en blanding af 26 og 32 nukleotider lange oligoer som markører. Kør elektroforese ved en konstant spænding på 180 volt. Forbered steril buffer til inkubation natten over.Når elektroforese er færdig, plette gelen med SYBR Gold. Punktfragmenter af gelen mellem 26 og 32 nukleotider med en steril nål eller et barberblad, og læg gelfragmenterne i separate Eppendorf-rør. Skift kanylen eller barberbladet mellem prøverne.Tilsæt 200 mikroliter af natten inkubationsbuffer til hver Eppendorf og inkuber prøverne ved 10 Celsius grader, 1000 runder i minuttet, natten over. Næste dag, rengør prøverne med RNA oprydning kit, og elute dem i 18 mikroliter af nuklease-fri vand. De opnåede ribosomale fodspor er klar til biblioteksforberedelse.Udfør ribosomal RNA-udtømning for prøver til RNA-seq ved hjælp af et kommercielt tilgængeligt sæt. Rengør derefter prøverne med RNA-oprydningssæt. Udfør alkalisk hydrolyse som følger;forbered alkalisk hydrolysebuffer, tilsæt et volumen af bufferen til et volumen af prøven, og inkubat ved 95 Celsius grader i 25 minutter.Der tilsættes fem mikroliter af 3 Molarnatriumacetat pH 5,5 til hver prøve for at stoppe reaktionen. Rengør prøverne med RNA-oprydningssæt, og elute dem i 18 mikroliter af nukleasefrit vand. Det opnåede tilfældigt fragmenterede RNA er klar til biblioteksforberedelse.Der tilsættes 10 mikroliter 10x reaktionsbuffer og fem mikroliter T4 polynukleotidkinase til hver prøve. Inkuber ved 37 Celsius grader i en og en halv time. Efter denne tid tilsættes tre mikroliter af en millimolar ATP og inkuber ved 37 Celsius grader i en time.Rengør derefter prøverne med RNA-oprydningssæt. Udfør biblioteksforberedelse ved hjælp af det kommercielt tilgængelige sæt i henhold til protokollen her. Udfør PAGE ved hjælp af 6%polyacrylamidgel.Plette gelen med SYBR Gold. Punktafgift gel fragmenter, der indeholder biblioteker. For RNA-seq prøver, biblioteket er mellem 135 og 180 nukleotider, og for RIBO-seq, mellem 135 og 170 nukleotider.Brug sterile nåle eller barberblade og læg de punkterede gelfragmenter i separate Eppendorf-rør. Husk at skifte nål eller barberblad mellem prøverne. Tilsæt 100 mikroliter af nukleasefrit vand til hvert punktafgiftsgelfragment.Og inkubere dem ved 10 Celsius grader, 450 runder i minuttet, natten over. Den næste dag, rengør prøverne med DNA-oprydningssæt. De opnåede biblioteker er klar til kvalitets- og mængdekontrol med høj følsomhed, DNA on-chip elektroforese og derefter til næste generations sekventering.De resulterende cDNA-biblioteker præsenterer en passende mængde og kvalitet, der kræves til næste generations sekventering, som verificeret af høj følsomhed, DNA on-chip elektroforese. De bånd og toppe, der repræsenterer RIBO-seq-bibliotekerne, er mere smalle og bedre definerede sammenlignet med dette, der repræsenterer RNA-seq-bibliotekerne. Ifølge on-chip elektrophoresis, bibliotekerne har den forventede linse.De ekstra toppe tættere på 200 basepar, der findes i RIBO-seq-biblioteker, kan indikere dvale ribosomer, ikke helt fordøjede ribosomale fodspor eller artefakter, for eksempel rRNA, og kan kasseres under bioinformatisk analyse, når de data, der er opnået fra sekventering, trimmes og rRNA tRNA filtreres. Den gennemsnitlige mængde cDNA, der genereres i biblioteksforberedelse, er 32 nanogram, hvilket giver tilstrækkelig mængde materiale, der kræves til næste generations sekventering. Efter kvalitetskontrol af on-chip elektrophoresis, biblioteker blev trukket for enkelt og 50 base par sekventering på en Illumina's NextSeq 500 platform.Trimning af adaptere og sekvenser af dårlig kvalitet resulterede i 25 til 47 millioner læsninger pr. prøve for RNA-seq-prøver og 25 til 50 millioner læsninger pr. prøve for RIBO-seq-prøver. De opnåede data blev kvalitetskontrol kontrolleret med FastQC. Både RNA-seq og RIBO-seq prøver præsenterede meget god kvalitet.Kortlægning af biblioteker udarbejdet i henhold til den beskrevne protokol gav 2,4 til 9,6 millioner unikt kortlagt læser per prøve for RNA-seq prøver, og 2,3 til 10,4 millioner af unikt kortlagt læser for RIBO-seq prøver. RIBO-seq-data udviser tredoblet periodicitet og en høj, smal top, svarende til de indledende ribosomer og karakteristisk for ribosomale fodspor, som ikke observeres i RNA-seq-dataene. Desuden viser plottet, der viser profilerne for den gennemsnitlige dækning af ribosomale fodaftryk og mRNA-fragmenter på kodningssekvenserne, den højere andel af aflæsninger, der er kortlagt cds'erne i RIBO-seq-datasættet som forventet.Visualiseringen af de kortlagte ribosomale fodaftryk viste meget ens mønstre sammenlignet med resultaterne fra det samme eksperiment udført i overensstemmelse hermed til standard RIBO-seq-proceduren, som omfatter monosom genvinding ved saccharosegradient ultracentrifugering. Vores protokol er blevet brugt til at undersøge oversættelsesregulering under forskellige vækstbetingelser, men kan anvendes til at studere andre aspekter af oversættelse, såsom påvisning af oversættelsesinitieringssteder og nye proteinkodningsgener. Rækkefølgen af de biblioteker, der er udarbejdet i henhold til vores retningslinjer, resulterer i tilstrækkelige data til omfattende bioinformatikanalyse.Den protokol, vi præsenterer her, er hurtig, nem og omkostningseffektiv og kan udføres med standardlaboratorieudstyr.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

Prøveforberedelse til massespektrometri-baseret identifikation af RNA-bindende regioner

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

An All-in-one Sample Holder for Macromolecular X-ray Crystallography with Minimal Background Scattering

En all-in-One-prøve holder til makromolekylær røntgenkrystallografi med minimal baggrunds spredning

Macromolecular X-ray crystallography (MX) is the most prominent method to obtain high-resolution three-dimensional knowledge of biological macromolecules. ...

A Plasma Sample Preparation for Mass Spectrometry using an Automated Workstation

En forberedelse til plasmaprøve til massespektrometri ved hjælp af en automatiseret arbejdsstation

Sample preparation for mass spectrometry analysis in proteomics requires enzymatic cleavage of proteins into a peptide mixture. This process involves ...

Sample Preparation for Probe Electrospray Ionization Mass Spectrometry

Prøve forberedelse til Sonde Elektrospray Ionization Mass Spektrometri

Mass spectrometry (MS) is a powerful tool in analytical chemistry because it provides very accurate information about molecules, such as mass-to-charge ...

TMT Sample Preparation for Proteomics Facility Submission and Subsequent Data Analysis

TMT Prøve forberedelse til Proteomics Facility Indsendelse og efterfølgende dataanalyse

Proteomic technologies are powerful methodologies that can aid our understanding of mechanisms of action in biological systems by providing a global view ...

MS2-Affinity Purification Coupled with RNA Sequencing in Gram-Positive Bacteria

MS2-Affinitetsrensning kombineret med RNA-sekventering i gram-positive bakterier

Although small regulatory RNAs (sRNAs) are widespread among the bacterial domain of life, the functions of many of them remain poorly characterized ...

NMR-Based Fragment Screening in a Minimum Sample but Maximum Automation Mode

NMR-baseret fragmentscreening i en minimumsprøve, men maksimal automatiseringstilstand

Fragment-based screening (FBS) is a well-validated and accepted concept within the drug discovery process both in academia and industry. The greatest ...

A Sample Preparation Pipeline for Microcrystals at the VMXm Beamline

En prøveforberedelsespipeline til mikrokrystaller på VMXm Beamline

The mounting of microcrystals (&#60;10 &#181;m) for single crystal cryo-crystallography presents a non-trivial challenge. Improvements in data quality ...

Sample Preparation and Transfer Protocol for In-Vacuum Long-Wavelength Crystallography on Beamline I23 at Diamond Light Source

Prøveforberedelse og overførselsprotokol til in-vakuum langbølgelængdekrystallografi på Beamline I23 ved diamantlyskilde

Long-wavelength macromolecular crystallography (MX) exploits the anomalous scattering properties of elements, such as sulfur, phosphorus, potassium, ...

Preparation of High-Temperature Sample Grids for Cryo-EM

Forberedelse af højtemperaturprøvegitre til Cryo-EM

The sample grids for cryo-electron microscopy (cryo-EM) experiments are usually prepared at a temperature optimal for the storage of biological samples, ...