Name: ribo-seq in bacteria: a sample collection and library preparation protocol for ngs sequencing
Uploaded: 2021-08-07T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about RIBO-seq in Bacteria: a Sample Collection and Library Preparation Protocol for NGS Sequencing at JoVE.com

ALS wil graag de financiële steun van EMBO Installatiesubsidies IG 3914 en POIR erkennen. 04.04.00-00-3E9C/17-00 uitgevoerd in het kader van het Eerste TEAM-programma van de Stichting voor Poolse Wetenschap, medegefinancierd door de Europese Unie in het kader van het Europees Fonds voor Regionale Ontwikkeling.

1. Monsterverzameling
<ol><li>Bereid een bacteriecultuur voor. Wij adviseren een kweekvolume van 100 ml per monster.</li>
	<li>Bereid apparatuur en reagentia voor het verzamelen van monsters: twee scoopula's per monster, steriele 0,45 μm gemengde cellulose-esters membraanfilters (MCE), 50 ml steriele buizen, vloeibare stikstof, 50 mg/ml chlooramfenicol in 70% (vol/vol) ethanol (optioneel). Prik het deksel van 50 ml buizen door om verdamping van vloeibare stikstof mogelijk te maken en de explosie van gesloten buizen te...

De belangrijkste technische uitdaging van de ribosoomprofilering is de noodzaak om de vertaling snel te remmen om een momentopname van ribosomen op mRNAs in een bepaalde fysiologische staat van belang vast te leggen. Om dit te bereiken, worden vertaalremmers, snel oogsten en vlamvriezen in vloeibare stikstof vaak gebruikt. Het toepassen van antibiotica is optioneel omdat ze artefacten kunnen veroorzaken. Chlooramfenicol is een veelgebruikt medicijn om langwerpige ribosomen in bacteriële RIBO-seq te arresteren. Het belet...

De ribosoomprofileringstechniek (RIBO-seq) is ontwikkeld in het laboratorium van Jonathan Weissman aan de Universiteit van Californië, San Francisco1. In vergelijking met andere methoden die worden gebruikt om genexpressie op translationeel niveau te bestuderen, richt RIBO-seq zich op elke ribosoombinding aan mRNA en geeft informatie over de locatie en het relatieve aantal ribosomen op een transcript. Het maakt het mogelijk om het proces van eiwitsynthese in vivo te volgen en kan een enkele codonresolutie en nauwkeurigheid bieden, waardoor de ribosoomdichtheid op zowel het individuele mRNA als langs het hele transcriptoom in de cel kan worden meten. Aan de basis van de RIBO-seq techniek ligt het feit dat het ribosoom tijdens de vertaling het mRNA molecuul bindt en zo het begraven fragment van het transcript beschermt tegen een ribonuclease spijsvertering. Bij toevoeging van de ribonuclease wordt het onbeschermde mRNA verteerd en blijven de fragmenten omsloten door ribosomen - meestal van ~ 28-30 nt lang - intact. Deze fragmenten, ribosomale voetafdrukken (RF) genoemd, kunnen vervolgens worden geïsoleerd, gesequenced en toegewezen aan het transcript waaruit ze afkomstig zijn, wat resulteert in de detectie van de exacte positie van de ribosomen. In feite wordt het ribosoomvermogen om mRNA-fragmenten te beschermen sinds de jaren zestig gebruikt om ribosomale bindings - en vertaalinitiatieplaatsen (TIS)2,3,4te bestuderen . Met de vooruitgang in diepe sequencingtechnologie is RIBO-seq echter een gouden standaard geworden voor vertaalmonitoring5 die, door de ribosoombetrokkenheid, een genoombrede informatie over eiwitsynthese kan bieden6. Ribosoomprofilering vulde de technologische kloof die bestond tussen het kwantificeren van het transcriptoom en het proteoom6.
Om ribosoomprofilering uit te voeren, moeten we celllysaat verkrijgen van het organisme dat onder de onderzochte omstandigheden was gegroeid. Het verstoren van deze omstandigheden tijdens het verzamelen en lyse van cellen kan onbetrouwbare gegevens opleveren. Om dit te voorkomen, worden vaak vertaalremmers, snel oogsten en vlamvriezen in vloeibare stikstof gebruikt. Cellen kunnen worden gelyseerd door cryogene slijping in een mechanische homogenisator zoals een mengmolen7,8 of een kraalklopper9, en door trituratie door een pipet10 of met een naald11. De lysisbuffer kan vlak voor of kort na verpulvering van de cellen worden toegevoegd. In ons protocol gebruiken we vloeibare stikstof om mortel en stamper voor tekoelen, evenals aluminiumoxide als een zachtere benadering van verstoring van de bacteriële celwand, die voorkomt dat RNA-schaar vaak wordt aangetroffen wanneer methoden zoals sonificatie worden toegepast. Na verpulvering voegen we een ijskoude lysisbuffer toe aan de gekoelde inhoud van de mortel. Selectie van een geschikte lysisbuffer is belangrijk voor het verkrijgen van de beste resolutie van ribosomale voetafdrukken. Aangezien de ionische sterkte zowel de RF-grootte als de precisie van het leesframe beïnvloedt, wordt momenteel aanbevolen om lysisbuffers met een lage ionische sterkte en buffercapaciteit te gebruiken, zelfs als blijkt dat de buffersamenstelling geen invloed heeft op de ribosomale bezetting op mRNAs11,12. Belangrijke componenten van de lysisbuffer zijn magnesiumionen, waarvan de aanwezigheid dissociatie van de ribosomale subeenheden voorkomt en spontane conformatieveranderingen in de bacteriële ribosomen11,13remt . Calciumionen spelen ook een belangrijke rol en zijn essentieel voor de activiteit van microkokkennuclease (MNase) die wordt gebruikt in de bacteriële ribosoomprofileringsmethode14. Toevoeging van guanosine 5′-[β,γ-imido]trifosfaat (GMP-PNP), een niet-hydrolyzable analoog van GTP, samen met chlooramfenicol remt de vertaling tijdens lysis15.
Wanneer het lysaat wordt verkregen, wordt het verduidelijkt door centrifugeren en verdeeld in twee porties, elk voor een RIBO-seq en een totale mRNA-sequencing (RNA-seq) met hoge doorvoer, omdat ze tegelijkertijd worden uitgevoerd (figuur 1). RNA-seq biedt een referentiepunt waarmee gegevens van zowel RIBO-seq als RNA-seq tijdens gegevensanalyse kunnen worden vergeleken. Het onderzochte vertaaloom wordt gedefinieerd door normalisatie van ribosomale voetafdrukken naar mRNA-overvloed16. Gegevens van RNA-seq kunnen ook helpen bij het identificeren van kloon- of sequencingartefacten17.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62544/62544fig01.jpg"> Figuur 1. Schema's van mRNA monstervoorbereiding voor RIBO-seq en RNA-seq. Voor ribo-seq bibliotheekvoorbereiding, wordt RNA verteerd met MNase (A), gevolgd door de grootteselectie van RF van ~28-30 nt lengte (B); voor RNA-seq is RNA geïsoleerd (C), uitgeput van rRNA (D), en het resulterende mRNA wordt willekeurig gefragmenteerd in fragmenten van verschillende lengtes (E). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62544/62544fig01large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.</a>
De eerste stappen van de monstervoorbereidingsprocedure voor RIBO-seq en RNA-seq verschillen enigszins (figuur 1). Voor de ribosomale profilering moet het lysaat worden verteerd door een specifiek endonuclease om de mRNA-moleculen af te voeren die niet door de ribosomen worden beschermd. In standaardprotocollen worden de verkregen monosomen teruggewonnen door een sucrosekussen ultracentrifugatie of een sucrose gradiënt ultracentrifugatie8,14. In dit artikel laten we zien dat deze stap niet nodig is om RF te isoleren die nodig is voor de RIBO-seq in bacteriën, ook voor eukaryotische cellen18, en dat de grootteselectie van de juiste lengte mRNA-fragmenten uit de polyacrylamidegel voldoende is.
Voor RNA-seq wordt mRNA verkregen door de uitputting van rRNA uit het totale RNA - rRNA moleculen hybridiseren naar de biotinylated oligonucleotide sondes die zich binden aan de streptavidin gecoate magnetische kralen. De rRNA-oligonucleotide-kraalcomplexen worden vervolgens met een magneet uit het monster verwijderd , wat resulteert in een rRNA-uitgeput monster19,20. De gezuiverde mRNA-moleculen worden vervolgens willekeurig gefragmenteerd door alkalische hydrolyse. De verkregen fragmenten van mRNA en de ribosomale voetafdrukken worden omgezet in cDNA-bibliotheken en voorbereid op diepe sequencing (figuur 2). Dit omvat eindreparatie die nodig is na alkalische hydrolyse (voor mRNA) en enzymatische vergisting (voor RF): defosforylatie van 3' uiteinden gevolgd door fosforylering van 5' uiteinden. De volgende stappen zijn adapters ligatie en de omgekeerde transcriptie om cDNA-inserts te maken die zijn omlijst door sequenties die nodig zijn voor de volgende generatie sequencing (NGS) met behulp van het Illumina-platform. De laatste fase van de voorbereiding van de bibliotheek is een PCR-reactie waarbij de constructies worden versterkt en geëtiketteerd met monsterspecifieke barcodes om multiplexing en sequencing van verschillende monsters op één kanaal mogelijk te maken. Voor de sequencing worden de kwaliteit en kwantiteit van de bibliotheken beoordeeld door de hooggevoelige DNA-on-chip elektroforese. cDNA-bibliotheken met de juiste parameters kunnen vervolgens worden samengevoegd en gesequenced. Sequencing kan worden uitgevoerd op verschillende Illumina-platforms, zoals MiSeq, NextSeq of HighSeq, afhankelijk van het aantal bibliotheken, de vereiste leeslengte en sequencingdiepte. Na sequencing wordt de bio-informatische analyse uitgevoerd.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62544/62544fig02.jpg"> Figuur 2. Bibliotheek voorbereiding. Bibliotheekvoorbereiding omvat de eindreparatie, adapters ligatie, omgekeerde transcriptie en versterking met barcodering. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62544/62544fig02large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.</a>
De ribosoomprofilering is een universele methode die eenvoudig kan worden aangepast en aangepast aan de wetenschappelijke vraag. Oorspronkelijk werd het gebruikt in gist1, maar kort daarna werd het toegepast op bacteriële cellen21 evenals eukaryotische modelorganismen, waaronder muis10, zebravis22, fruitvlieg23 en Arabidopsis thaliana24. Het werd ook gebruikt voor het bestuderen van verschillende ribosoomtypen: cytoplasmatisch, mitochondriaal25,26 en chloroplast27,28. In eukaryoten wordt RIBO-seq gewoonlijk aangepast en verfijnd om specifieke aspecten van vertaling te onderzoeken, waaronder initiatie10,11,29,30,31,32, verlenging1,10,11,31,33, ribosoomstalling 33 en exterieurverandering33. De meeste wijzigingen betreffen het gebruik van verschillende vertaalremmers. Bij bacteriën zijn analoge studies echter moeilijk uit te voeren vanwege het gebrek aan remmers met het vereiste werkingsmechanisme34. De meest gebruikte vertaalremmer bij bacteriën is chlooramfenicol (CAM) dat zich bindt aan het peptidyltransferasecentrum (PTC) en de juiste positionering van het aminoacyl-tRNA in de A-site voorkomt. Als gevolg hiervan voorkomt CAM de vorming van een peptidebinding die leidt tot het arresteren van de langwerpige ribosomen35. Andere voorbeelden van vertaalremmers bij bacteriën zijn tetracycline (TET)36, retapamulin (RET)34 en Onc11237 die zijn gebruikt om vertaalinitiatieplaatsen te onderzoeken. TET, dat de toediening van tRNA aan het ribosoom voorkomt door direct te overlappen met de anticodonstamlus van tRNA op de A-site, werd oorspronkelijk toegepast om de resultaten van de CAM-behandeling te verifiëren, omdat het beide antibiotica zijn die de verlenging van de vertaling remmen38. TET bleek primaire TIS te detecteren, maar kon interne TIS36niet onthullen . RET bindt in de PTC van het bacteriële ribosoom en voorkomt de vorming van de eerste peptidebinding door te interfereren met een elongator aminoacyl-tRNA in de A-site. Het toepassen van RET resulteert in ribosomen arrestatie op zowel primaire als interne TISs34. Onc112, een proline-rijk antimicrobieel peptide, bindt in de uitgangstunnel en blokkeert aminoacyl-tRNA binding in de ribosomale A-site. Als gevolg hiervan voorkomt Onc112 dat initiatiecomplexen de verlengingsfase37ingaan .
De belangrijkste informatie die ribosoomprofilering biedt, is de ribosomdichtheid en hun positie op het mRNA. Het werd met succes toegepast om differentiële genexpressie op het niveau van vertaling te onderzoeken in verschillende groeiomstandigheden1,6, translationele efficiëntie1,38,39 te meten en vertaalregelgebeurtenissen zoals ribosomale pauze10te detecteren . RIBO-seq maakt het ook mogelijk om de vertaling van geannoteerde ncRNA, pseudogenen en ongeannoteerde kleine open leeskaders (ORF) te ontdekken die leiden tot de identificatie van nieuwe en/of zeer korte eiwitcoderingsgenen10,12,22,30,37. In dergelijke gevallen kan RIBO-seq de annotatie van het genoom verfijnen en verbeteren. Met zijn hoge gevoeligheid voor de identificatie van vertaalde ORF 's en zijn kwantitatieve aard kan ribosoomprofilering ook dienen als proxy voor de proteoombepaling of bij het helpen van proteomicsstudies31,34,39. Door TIS in kaart te brengen, onthult ribosoomprofilering N-terminaal verlengde en afgeknotte isovormen van bekende eiwitten10,32. RIBO-seq werd ook aangepast om co-translationele vouwen van eiwitten14,21,24 te bestuderen. Deze methode maakt het meten van reksnelheden1,10,39 of decoderingssnelheden van individuele codons6 mogelijk en helpt bij het ontwikkelen van kwantitatieve vertaalmodellen17. De ribosoomprofileringsmethode is ook in staat om mechanistische inzichten te geven in de ribosoomonderbreking bij bacteriën7,15,17, frameshifting40, stop-codon readthrough21, beëindiging / recyclingdefecten41,42 en ribosomale conformatieveranderingen33 bij eukaryoten. RIBO-seq werd ook aangepast om het effect van specifieke trans-acterende factoren op vertalingen zoals miRNAs6 en RNA-bindende eiwitten in eukaryoten16,43teonderzoeken . Het is echter belangrijk om te erkennen dat het experimentele ontwerp en de verkregen resolutie van RIBO-seq bepalend zijn voor de hoeveelheid informatie die kan worden geëxtraheerd uit de resulterende sequencinggegevens12.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10X TBE (powder)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9864</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol, 99%, pure</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>125472500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine 5&#39;-Triphosphate (ATP)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>P0756S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminium oxide calcinated pure p.a.</td>
			<td>Chempur</td>
			<td>114560600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride dihydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C3881-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>190321</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA Clean &#38; Concentrator -5</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>D4004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dnase I recombinant, Rnase-free</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4716728001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA disodium salt</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>E/P140/48</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl Alcohol Absolut 99,8%&#160; Pure-P.A.-Basic</td>
			<td>POCH Avantor Performance Materials Poland S.A</td>
			<td>BA6480111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filtration apparatus</td>
			<td>VWR Collection</td>
			<td>511-0265</td>
			<td>all-glass filtration apparatus, with funnel, fritted base, cap, 47 mm &#216; spring clamp and ground joint flask</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel 40 (19:1)</td>
			<td>Rotiphorese</td>
			<td>3030.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel Loading Dye, Blue, 6X</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E6138G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guanosine 5&#8242;-[&#946;,&#947;-imido]triphosphate trisodium salt hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G0635-25MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>labZAP</td>
			<td>A&#38;A Biotechnology</td>
			<td>040-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium acetate tetrahydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M5661-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MCE membrane fiter</td>
			<td>Alfatec Technology</td>
			<td>M47MCE45GWS</td>
			<td>pore size: 0.45um</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MICROBExpress Bacterial mRNA Purification</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM1905</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiplex Small RNA Library Prep Set for Illumina</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E7300S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-Free Water</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9937</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Acetate Anhydrous Pure P.A.</td>
			<td>POCH Avantor Performance Materials Poland S.A</td>
			<td>744330113</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quick-Load pBR322 DNA-MspI Digest</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E7323A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA Clean &#38; Concentrator -25</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>R1018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2889-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium carbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>223530-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydrogen carbonate pure p.a.</td>
			<td>POCH Avantor Performance Materials Poland S.A</td>
			<td>810530115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR Gold nucleic acid gel stain</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>S11494</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 Polynucleotide Kinase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0201L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 Polynucleotide Kinase Reaction Buffer</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B0201S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBE-Urea Sample Buffer (2x)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>LC6876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris(hydroxymethyl)amino-methane, ultrapure, 99,9%</td>
			<td>AlfaAesar</td>
			<td>J65594</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100, 98%</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>327371000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea G.R.</td>
			<td>lach:ner</td>
			<td>40096-AP0</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ribo-seq in bacteria: a sample collection and library preparation protocol for ngs sequencing

De ribosoomprofileringstechniek (RIBO-seq) is momenteel het meest effectieve hulpmiddel voor het bestuderen van het proces van eiwitsynthese in vivo. Het voordeel van deze methode, in vergelijking met andere benaderingen, is het vermogen om de vertaling te controleren door de positie en het aantal ribosomen op een mRNA-transcript nauwkeurig in kaart te brengen.
In dit artikel beschrijven we de opeenvolgende stadia van monsterverzameling en voorbereiding voor de RIBO-seq-methode bij bacteriën, waarbij we de details benadrukken die relevant zijn voor de planning en uitvoering van het experiment.
Aangezien de RIBO-seq afhankelijk is van intacte ribosomen en gerelateerde mRNAs, is de belangrijkste stap een snelle remming van de vertaling en adequate desintegratie van cellen. Daarom raden we filtratie en flash-freezing in vloeibare stikstof voor celoogst aan met een optionele voorbehandeling met chlooramfenicol om vertaling in bacteriën te stoppen. Voor de desintegratie stellen we voor bevroren cellen te slijpen met mortel en stamper in aanwezigheid van aluminiumoxide om de celwand mechanisch te verstoren. In dit protocol is sucrosekussen of een sucrose gradiënt ultracentrifugatie voor monose zuivering niet vereist. In plaats daarvan wordt mRNA-scheiding met polyacrylamidegelelektroforese (PAGE) gevolgd door de ribosomale voetafdruk excisie (28-30 nt-band) toegepast en levert bevredigende resultaten op. Dit vereenvoudigt de methode grotendeels en vermindert de tijd- en uitrustingsvereisten voor de procedure. Voor de voorbereiding van de bibliotheek raden we aan om de in de handel verkrijgbaar kleine RNA-kit voor Illumina-sequencing van New England Biolabs te gebruiken, volgens de richtlijnen van de fabrikant met een zekere mate van optimalisatie.
De resulterende cDNA-bibliotheken bieden de juiste hoeveelheid en kwaliteit die nodig zijn voor de volgende generatie sequencing (NGS). Sequencing van de bibliotheken die volgens het beschreven protocol zijn voorbereid, resulteert in 2 tot 10 mln uniek in kaart gebrachte leespunten per monster die voldoende gegevens opleveren voor een uitgebreide bio-informatische analyse. Het protocol dat wij presenteren is snel en relatief eenvoudig en kan worden uitgevoerd met standaard laboratoriumapparatuur.

De hier gepresenteerde voorbeeldige resultaten werden verkregen in een studie die vertaalregulatie in sporulerende WT Bacillus-subtiliscellen onderzocht. Nachtculturen werden verdund tot OD600 gelijk aan 0,1 in 100 ml rijk medium en geïncubeerd bij 37 °C met krachtig schudden tot OD600 0,5-0,6 bereikte. Het rijke medium werd vervolgens vervangen door een minimaal medium om het sporulatieproces te induceren en de incubatie werd tot vier uur voortgezet. Cellen werden elk uur geoogst, te beg...

Watch this Scientific Journal Video about RIBO-seq in Bacteria: a Sample Collection and Library Preparation Protocol for NGS Sequencing at JoVE.com

RIBO-seq in Bacteria: a Sample Collection and Library Preparation Protocol for NGS Sequencing

Hier beschrijven we de stadia van monsterverzameling en voorbereiding voor RIBO-seq bij bacteriën. Sequencing van de bibliotheken die volgens deze richtlijnen zijn opgesteld, resulteert in voldoende gegevens voor een uitgebreide bio-informatische analyse. Het protocol dat we presenteren is eenvoudig, maakt gebruik van standaard laboratoriumapparatuur en duurt zeven dagen van lysis tot het verkrijgen van bibliotheken.

RIBO-seq in Bacteria: een Sample Collection and Library Preparation Protocol voor NGS Sequencing

The ribosome profiling technique (RIBO-seq) is currently the most effective tool for studying the process of protein synthesis in vivo. The advantage of ...

De ribosoomprofileringstechniek, ook wel RIBO-seq genoemd, is momenteel het meest effectieve hulpmiddel voor het bestuderen van het proces van eiwitsynthese in vivo. Het voordeel van deze methode is het vermogen om de vertaling te controleren door de positie en het aantal ribosomen nauwkeurig in kaart te brengen. RIBO-seq is gebaseerd op het feit dat het ribosoom, door binding aan het mRNA-molecuul, het begraven fragment van het transcript beschermt bij de vertering van ribonuclease.De verkregen fragmenten, ribosomale voetafdrukken genoemd, kunnen worden gesequenced en in kaart gebracht op het transcript waaruit ze afkomstig zijn, wat resulteert in de bepaling van de exacte positie van de ribosomen. Gelijktijdig met de RIBO-seq wordt een totale mRNA-sequencing met hoge doorvoer uitgevoerd om een referentiepunt te bieden en de vergelijking van gegevens van zowel RIBO-seq als RNA-seq tijdens gegevensanalyse mogelijk te maken. Voordat cellen worden geoogst, kunt u optioneel chlooramfenicol toevoegen aan de bacteriecultuur, tot de uiteindelijke concentratie van 100 microgram per milliliter, om de vertaling te remmen.Incubeer de cultuur met het antibioticum gedurende één minuut. Deze stap is belangrijk als het oogsten langer duurt dan normaal, omdat vertaalremming het mogelijk maakt om de verzameltijd van het monster te verlengen. Verzamel de monsters met een voorverwarmd filtratiesysteem.U kunt schudden introduceren om groeiomstandigheden na te bootsen. Stop met filteren wanneer alle media door het membraan zijn gegaan, maar laat het filter niet volledig drogen. Verzamel bacteriële pellets door de cellen snel van de filterschijf te schrapen met behulp van een voorverwarmde, gedesinfecteerde scoopula.Plaats onmiddellijk de hele scoopula met de geoogste cellen in een buis van 50 milliliter gevuld met vloeibare stikstof. De geoogste pellet moet volledig bedekt zijn met vloeibare stikstof. Laat de pellet goed invriezen en laat bevroren cellen los met behulp van een eerder afgekoelde scoopula.Sluit het deksel en zorg ervoor dat het doorboord is. Dit is belangrijk, omdat vloeibare stikstof ervoor kan zorgen dat gesloten containers exploderen als gevolg van de drukverandering bij verdamping. Bereid GMPP, DNA-swab en verse Eppendorf-buizen voor lysase.Bereid de lysisbuffer voor met de toevoeging van chlooramfenicol indien nodig. Wijs 500 microliter lysisbuffer per monster toe aan afzonderlijke Eppendorf-buizen en plaats ze op ijs. Ontsmet mortel en stamper met een laboratoriumdesinfectiemiddel en 70% ethanol.Koel mortel en stamper door vloeibare stikstof in de mortel te gieten. Breng de bevroren bacteriële pellet over in een voorgekoelde mortel en maal deze tot een poeder. Voeg ongeveer één volume aluminiumoxide toe en blijf malen.Houd mortel, stamper en de cellen koel door vloeibare stikstof te gieten wanneer dat nodig is, om de inhoud van de mortel niet te laten ontdooien. Voeg vlak voor gebruik GMPPNP en DNA-swab toe aan de lysisbuffer aliquot. Breng de oplossing over in de mortel en blijf malen.Laat de lysase langzaam ontdooien tijdens het malen. Wanneer de lysase volledig ontdooit, breng het mengsel over in de voorgekoelde Eppendorf-buis en keer terug naar ijs. Centrifugeer lysase op 20.0000 G gedurende vijf minuten bij vier Graden Celsius.Breng supernatanten over in verse, voorgekoelde Eppendorf-buizen en leg ze op ijs. Meet de RNA-concentratie in elk verdund monster met NanoDrop. Verdeel elk lysaat in twee porties, 0,5 tot 1 milligram RNA voor RIBO-seq en de rest voor RNA-seq.Voeg aan één milligram van het RNA 3,8 microliter MNase toe in Tris pH 8 en vul het aan met lysisbuffer tot het totale volume van 500 microliters. Incubeer op 25 Graden Celsius, 300 ronden per minuut, gedurende 45 minuten. Wanneer de incubatie is voltooid, reinigt u de monsters met een in de handel verkrijgde RNA-opruimset.Bereid 15% polyacrylamide TBE-gel met acht molaire ureum en plaats deze in een tank met TBE-buffer. Voorloop minimaal 10 minuten bij een constante spanning van 200 volt. Meng de monsters met de TBE-Ureum monsterbuffer.Denature op 95 Graden Celsius gedurende een minuut en plaats ze onmiddellijk op ijs. Was het ureum uit door de TBE-buffer met een spuit in gelputten te injecteren. Laad de monsters, laat een putruimte tussen hen om elk monster te scheiden en kruisbesmetting te voorkomen.Gebruik 29 nucleotiden-lang oligo, en een mix van 26 en 32 nucleotiden-lange oligo's als markers. Voer de elektroforese uit op een constante spanning van 180 volt. Bereid steriele buffer voor op nachtelijke incubatie.Zodra de elektroforese is voltooid, beitst u de gel met SYBR Gold. Verwijder fragmenten van de gel tussen 26 en 32 nucleotiden met een steriele naald of een scheermesje en plaats de gelfragmenten in afzonderlijke Eppendorf-buizen. Vervang de naald of het scheermesje tussen de monsters.Voeg 200 microliter nachtelijke incubatiebuffer toe aan elke Eppendorf en incubeer de monsters 's nachts op 10 Graden Celsius, 1000 ronden per minuut. Reinig de volgende dag de monsters met RNA-opruimkit en elute ze in 18 microliters nucleasevrij water. De verkregen ribosomale voetafdrukken zijn klaar voor de voorbereiding van de bibliotheek.Voer ribosomale RNA-uitputting uit voor monsters voor RNA-seq met behulp van een in de handel verkrijgde kit. Reinig vervolgens de monsters met de RNA-opruimset. Voer de alkalische hydrolyse als volgt uit; bereid de alkalische hydrolysebuffer voor, voeg één volume van de buffer toe aan één volume van het monster en incubeer gedurende 25 minuten bij 95 Graden Celsius.Voeg vijf microliters van 3 molair natriumacetaat pH 5,5 toe aan elk monster om de reactie te stoppen. Reinig de monsters met RNA-opruimkit en ontleed ze in 18 microliters nucleasevrij water. Het verkregen willekeurig gefragmenteerde RNA is klaar voor de voorbereiding van de bibliotheek.Voeg 10 microliters 10x reactiebuffer en vijf microliters T4 polynucleotidekinase toe aan elk monster. Incubeer anderhalf uur bij 37 Graden Celsius. Voeg na deze tijd drie microliters van één millimolar ATP toe en incubeer gedurende een uur bij 37 Graden Celsius.Reinig vervolgens de monsters met de RNA-opruimset. Voer de bibliotheekvoorbereiding uit met behulp van de in de handel verkrijgde kit, volgens het hier verstrekte protocol. Voer PAGE uit met 6%polyacrylamide gel.Beits de gel met SYBR Gold. Accijnsgelfragmenten met de bibliotheken. Voor RNA-seq monsters, de bibliotheek is tussen 135 en 180 nucleotiden, en voor RIBO-seq, tussen 135 en 170 nucleotiden.Gebruik steriele naalden of scheermesjes en plaats de gelfragmenten in aparte Eppendorf-buizen. Vergeet niet om de naald of het scheermesje tussen de monsters te vervangen. Voeg 100 microliter nucleasevrij water toe aan elk gelfragment.En incubeer ze op 10 Graden Celsius, 450 kogels per minuut, 's nachts. Maak de volgende dag de monsters schoon met een DNA-opruimset. De verkregen bibliotheken zijn klaar voor kwaliteit- en kwantiteitscontrole met hoge gevoeligheid, DNA-on-chip elektroforese en vervolgens voor de volgende generatie sequencing.De resulterende cDNA-bibliotheken bieden een passende hoeveelheid en kwaliteit die nodig is voor de volgende generatie sequencing, zoals geverifieerd door hoge gevoeligheid, DNA-on-chip elektroforese. De banden en pieken die de RIBO-seq-bibliotheken vertegenwoordigen, zijn smaller en beter gedefinieerd, in vergelijking met deze die de RNA-seq-bibliotheken vertegenwoordigen. Volgens de on-chip elektroforese hebben de bibliotheken de verwachte lens.De extra pieken dichter bij 200 basisparen in RIBO-seq-bibliotheken kunnen wijzen op sluimeringen van ribosomen, niet volledig verteerde ribosomale voetafdrukken of artefacten, bijvoorbeeld rRNA, en kunnen worden verwijderd tijdens bioinformatische analyse wanneer de gegevens die zijn verkregen uit sequencing worden bijgesneden en rRNA tRNA wordt gefilterd. De gemiddelde hoeveelheid cDNA die wordt gegenereerd bij de voorbereiding van de bibliotheek is 32 nanogram, wat voldoende hoeveelheid materiaal oplevert die nodig is voor de volgende generatie sequencing. Na kwaliteitscontrole door on-chip elektroforese werden bibliotheken getrokken voor single en 50 base pair sequencing op een Illumina's NextSeq 500 platform.Het trimmen van de adapters en sequenties van slechte kwaliteit resulteerde in 25 tot 47 miljoen aflezingen per monster voor RNA-seq-monsters en 25 tot 50 miljoen aflezingen per monster voor RIBO-seq-monsters. De verkregen gegevens werden gecontroleerd op kwaliteitscontrole met FastQC. Zowel RNA-seq als RIBO-seq monsters presenteerden een zeer goede kwaliteit.Het in kaart brengen van de bibliotheken die volgens het beschreven protocol zijn opgesteld, leverde 2,4 tot 9,6 miljoen uniek in kaart gebrachte leesingen per monster op voor RNA-seq-monsters en 2,3 tot 10,4 miljoen uniek in kaart gebrachte leesgegevens voor RIBO-seq-monsters. RIBO-seq-gegevens vertonen een verdrievoudigde periodiciteit en een hoge, smalle piek, die overeenkomt met de initiërende ribosomen en kenmerkend is voor de ribosomale voetafdrukken, wat niet wordt waargenomen in de RNA-seq-gegevens. Bovendien onthult het plot met de profielen van de gemiddelde dekking van ribosomale voetafdrukken en mRNA-fragmenten op de coderingssequenties het hogere percentage leesingen dat is toegewezen aan de CDS's in de RIBO-seq-gegevensset, zoals verwacht.De visualisatie van de in kaart gebrachte ribosomale voetafdrukken vertoonde zeer vergelijkbare patronen in vergelijking met de resultaten van hetzelfde experiment dat dienovereenkomstig werd uitgevoerd volgens de standaard RIBO-seq-procedure, die monosoomherstel door sucrose gradiënt ultracentrifugatie omvat. Ons protocol is gebruikt om vertaalregulatie in verschillende groeiomstandigheden te onderzoeken, maar kan worden toegepast om andere aspecten van vertaling te bestuderen, zoals detectie van vertaalinitiatiesites en nieuwe eiwitcoderingsgenen. Sequencing van de bibliotheken opgesteld volgens onze richtlijnen resulteert in voldoende gegevens voor een uitgebreide bio-informatische analyse.Het protocol dat we hier presenteren is snel, eenvoudig en kosteneffectief en kan worden uitgevoerd met standaard laboratoriumapparatuur.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

Bereiding van de monsters voor de massa spectrometrie gebaseerde identificatie van RNA-bindende regio 's

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

An All-in-one Sample Holder for Macromolecular X-ray Crystallography with Minimal Background Scattering

Een alles-in-een monsterhouder voor macromoleculaire X-Ray kristallografie met minimale achtergrond verstrooiing

Macromolecular X-ray crystallography (MX) is the most prominent method to obtain high-resolution three-dimensional knowledge of biological macromolecules. ...

A Plasma Sample Preparation for Mass Spectrometry using an Automated Workstation

Een plasmamonstervoorbereiding voor massaspectrometrie met behulp van een geautomatiseerd werkstation

Sample preparation for mass spectrometry analysis in proteomics requires enzymatic cleavage of proteins into a peptide mixture. This process involves ...

Sample Preparation for Probe Electrospray Ionization Mass Spectrometry

Monster voorbereiding voor Probe Electrospray Ionization Mass Spectrometry

Mass spectrometry (MS) is a powerful tool in analytical chemistry because it provides very accurate information about molecules, such as mass-to-charge ...

TMT Sample Preparation for Proteomics Facility Submission and Subsequent Data Analysis

TMT Sample Voorbereiding voor Proteomics Facility Indiening en latere data-analyse

Proteomic technologies are powerful methodologies that can aid our understanding of mechanisms of action in biological systems by providing a global view ...

MS2-Affinity Purification Coupled with RNA Sequencing in Gram-Positive Bacteria

MS2-Affinity Zuivering in combinatie met RNA Sequencing in Gram-Positieve Bacteriën

Although small regulatory RNAs (sRNAs) are widespread among the bacterial domain of life, the functions of many of them remain poorly characterized ...

NMR-Based Fragment Screening in a Minimum Sample but Maximum Automation Mode

NMR-gebaseerde fragmentscreening in een minimale steekproef maar maximale automatiseringsmodus

Fragment-based screening (FBS) is a well-validated and accepted concept within the drug discovery process both in academia and industry. The greatest ...

A Sample Preparation Pipeline for Microcrystals at the VMXm Beamline

Een monstervoorbereidingspijplijn voor microkristallen op de VMXm Beamline

The mounting of microcrystals (&#60;10 &#181;m) for single crystal cryo-crystallography presents a non-trivial challenge. Improvements in data quality ...

Sample Preparation and Transfer Protocol for In-Vacuum Long-Wavelength Crystallography on Beamline I23 at Diamond Light Source

Monstervoorbereidings- en overdrachtsprotocol voor in-vacuüm kristallografie met lange golflengte op Beamline I23 bij Diamond Light Source

Long-wavelength macromolecular crystallography (MX) exploits the anomalous scattering properties of elements, such as sulfur, phosphorus, potassium, ...

Preparation of High-Temperature Sample Grids for Cryo-EM

Voorbereiding van hoge temperatuur monsterroosters voor Cryo-EM

The sample grids for cryo-electron microscopy (cryo-EM) experiments are usually prepared at a temperature optimal for the storage of biological samples, ...