Name: ribo-seq in bacteria: a sample collection and library preparation protocol for ngs sequencing
Uploaded: 2021-08-07T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about RIBO-seq in Bacteria: a Sample Collection and Library Preparation Protocol for NGS Sequencing at JoVE.com

La SLA tient à souligner le soutien financier des subventions d’installation DE L’EMBO IG 3914 et du POIR. 04.04.00-00-3E9C/17-00 réalisé dans le cadre du programme First TEAM de la Fondation pour la science polonaise cofinancé par l’Union européenne au titre du Fonds européen de développement régional.

1. Prélèvement d’échantillons
<ol><li>Préparer une culture bactérienne. Nous recommandons un volume de culture de 100 mL par échantillon.</li>
	<li>Préparer l’équipement et les réactifs pour le prélèvement des échantillons : deux scoopulas par échantillon, filtres à membrane d’esters de cellulose (ECM) mélangés stériles de 0,45 μm, tubes stériles de 50 mL, azote liquide, chloramphénicol à 50 mg/mL dans de l’éthanol à 70 % (vol/vol) (facultatif). Percer le couvercle des tubes de 50 mL pour...

Le principal défi technique du profilage des ribosomes est la nécessité d’inhiber rapidement la traduction afin de capturer un instantané des ribosomes sur les ARNm à un état physiologique d’intérêt particulier. Pour ce faire, les inhibiteurs de traduction, la récolte rapide et la congélation instantanée dans l’azote liquide sont couramment utilisés. L’application d’antibiotiques est facultative car ils peuvent causer des artefacts. Le chloramphénicol est un médicament couramment utilisé pour arr...

La technique de profilage des ribosomes (RIBO-seq) a été développée dans le laboratoire de Jonathan Weissman à l’Université de Californie à San Francisco1. En comparaison avec d’autres méthodes utilisées pour étudier l’expression des gènes au niveau translationnel, RIBO-seq se concentre sur chaque ribosome se liant à l’ARNm et fournit des informations sur son emplacement et le nombre relatif de ribosomes sur une transcription. Il permet de surveiller le processus de synthèse des protéines in vivo et peut fournir une résolution et une précision de codon unique permettant la mesure de la densité du ribosome sur les deux, l’ARNm individuel et le long de l’ensemble du transcriptome dans la cellule. A la base de la technique RIBO-seq se trouve le fait que lors de la traduction le ribosome lie la molécule d’ARNm et protège ainsi le fragment enfoui de la transcription d’une digestion ribonucléase. Lors de l’ajout de la ribonucléase, l’ARNm non protégé est digéré et les fragments enfermés par des ribosomes - généralement de ~ 28-30 nt de long - restent intacts. Ces fragments, appelés empreintes ribosomiques (RF), peuvent ensuite être isolés, séquencés et cartographiés sur la transcription dont ils sont issus, ce qui a permis de détecter la position exacte des ribosomes. En fait, la capacité du ribosome à protéger les fragments d’ARNm est utilisée depuis les années 1960 pour étudier les sites ribosomiques de liaison et d’initiation de traduction (TIS)2,3,4. Cependant, avec les progrès de la technologie de séquençage en profondeur, RIBO-seq est devenu une référence pour la surveillance de la traduction5 qui, grâce à l’engagement du ribosome, peut fournir une information à l’échelle du génome sur la synthèse des protéines6. Le profilage du ribosome a comblé le fossé technologique qui existait entre la quantification du transcriptome et le protéome6.
Pour effectuer le profilage du ribosome, nous devons obtenir le lysat cellulaire de l’organisme qui s’était développé dans les conditions étudiées. La perturbation de ces conditions pendant la collecte et la lyse cellulaires peut fournir des données peu fiables. Pour éviter cela, les inhibiteurs de traduction, la récolte rapide et la congélation instantanée dans l’azote liquide sont couramment utilisés. Les cellules peuvent être lysées par broyage cryogénique dans un homogénéisateur mécanique tel qu’un mélangeur7,8 ou un batteur de perles9,et par trituration à travers une pipette10 ou avec une aiguille11. Le tampon de lyse peut être ajouté juste avant ou peu de temps après la pulvérisation des cellules. Dans notre protocole, nous utilisons de l’azote liquide pour pré-refroidir le mortier et le pilon, ainsi que de l’oxyde d’aluminium comme une approche plus douce de la perturbation de la paroi cellulaire bactérienne, ce qui empêche le cisaillement de l’ARN souvent rencontré lorsque des méthodes telles que la sonification sont appliquées. Après pulvérisation, nous ajoutons un tampon de lyse glacé dans le contenu refroidi du mortier. La sélection d’un tampon de lyse approprié est importante pour obtenir la meilleure résolution des empreintes ribosomiques. Étant donné que la force ionique affecte à la fois la taille rf et la précision du cadre de lecture, il est actuellement recommandé d’utiliser des tampons de lyse à faible force ionique et capacité tampon, même s’il apparaît que la composition tampon n’affecte pas l’occupation ribosomique sur les ARNm11,12. Les composants importants du tampon de lyse sont les ions magnésium, dont la présence empêche la dissociation des sous-unités ribosomiques et inhibe les changements conformationnels spontanés dans les ribosomes bactériens11,13. Les ions calcium jouent également un rôle important et sont essentiels pour l’activité de la nucléase micrococcique (MNase) utilisée dans la méthode de profilage des ribosomes bactériens14. L’addition de guanosine 5′-[β,γ-imido]triphosphate (GMP-PNP), un analogue non hydrolysable du GTP, avec le chloramphénicol inhibe la traduction pendant la lyse15.
Lorsque le lysat est obtenu, il est clarifié par centrifugation et divisé en deux parties, chacune pour un RIBO-seq et un séquençage total à haut débit de l’ARNm (RNA-seq) puisqu’ils sont effectués simultanément(figure 1). RNA-seq fournit un point de référence qui permet la comparaison des données de RIBO-seq et RNA-seq lors de l’analyse des données. Le translatome étudié est défini par la normalisation des empreintes ribosomiques à l’abondance de l’ARNm16. Les données de RNA-seq peuvent également aider à identifier le clonage ou le séquençage d’artefacts17.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62544/62544fig01.jpg"> Figure 1. Schémas de préparation d’échantillons d’ARNm pour RIBO-seq et RNA-seq. Pour la préparation de la bibliothèque RIBO-seq, l’ARN est digéré avec de la MNase (A), suivie de la sélection de la taille de RF d’une longueur d’environ 28-30 nt (B); pour l’ARN-seq, l’ARN est isolé (C), appauvri en ARNr (D), et l’ARNm résultant est fragmenté aléatoirement en fragments de longueurs variables (E). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62544/62544fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a>
Les étapes initiales de la procédure de préparation de l’échantillon pour RIBO-seq et RNA-seq diffèrent légèrement(Figure 1). Pour le profilage ribosomique, le lysat doit être digéré par une endonucléase spécifique pour dégrader les molécules d’ARNm non protégées par les ribosomes. Dans les protocoles standards, les monosomes obtenus sont récupérés par un coussin de saccharose ultracentrifugation ou un gradient de saccharose d’ultracentrifugation8,14. Dans cet article, nous montrons que cette étape n’est pas nécessaire pour isoler le RF requis pour le RIBO-seq dans les bactéries, de même pour les cellules eucaryotes18,et que la sélection de taille des fragments d’ARNm de longueur appropriée à partir du gel de polyacrylamide est suffisante.
Pour l’ARN-seq, l’ARNm est obtenu par épuisement de l’ARNr à partir de l’ARN total - les molécules d’ARNr s’hybrident aux sondes oligonucléotidiques biotinylées qui se lient aux billes magnétiques recouvertes de streptavidine. Les complexes ARNr-oligonucléotide-billes sont ensuite retirés de l’échantillon avec un aimant aboutissant à un arnr appauvri échantillon19,20. Les molécules d’ARNm purifiées sont ensuite fragmentées aléatoirement par hydrolyse alcaline. Les fragments d’ARNm obtenus ainsi que les empreintes ribosomiques sont convertis en bibliothèques d’ADNc et préparés pour le séquençage en profondeur (Figure 2). Cela implique la réparation des extrémités nécessaires après hydrolyse alcaline (pour l’ARNm) et la digestion enzymatique (pour RF): déphosphorylation des extrémités 3' suivie d’une phosphorylation des extrémités 5'. Les étapes suivantes sont la ligature des adaptateurs et la transcription inverse pour créer des inserts d’ADNc encadrés par des séquences requises pour le séquençage de nouvelle génération (NGS) à l’aide de la plate-forme Illumina. La dernière phase de la préparation de la bibliothèque est une réaction pcr dans laquelle les constructions sont amplifiées et étiquetées avec des codes à barres spécifiques à l’échantillon pour permettre le multiplexage et le séquençage de divers échantillons sur un canal. Avant le séquençage, la qualité et la quantité des bibliothèques sont évaluées par électrophorèse sur puce à haute sensibilité de l’ADN. Les bibliothèques d’ADNc avec les paramètres appropriés peuvent ensuite être regroupées et séquencées. Le séquençage peut être effectué sur différentes plates-formes Illumina, telles que MiSeq, NextSeq ou HighSeq, en fonction du nombre de bibliothèques, de la longueur de lecture requise et de la profondeur de séquençage. Après le séquençage, l’analyse bioinformatique est effectuée.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62544/62544fig02.jpg"> Figure 2. Préparation de la bibliothèque. La préparation de la bibliothèque comprend la réparation des extrémités, la ligature des adaptateurs, la transcription inverse et l’amplification avec codage à barres. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62544/62544fig02large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a>
Le profilage des ribosomes est une méthode universelle qui peut être facilement modifiée et ajustée en fonction de la question scientifique. À l’origine, il a été utilisé dans la levure1, mais peu de temps après, il a été appliqué sur les cellules bactériennes21 ainsi que sur des organismes modèles eucaryotes, y compris la souris10,le poisson zèbre22,la mouche des fruits23 et Arabidopsis thaliana24. Il a également été utilisé pour étudier différents types de ribosomes: cytoplasmique, mitochondrial25,26 et chloroplaste27,28. Chez les eucaryotes, ribo-seq est couramment adapté et affiné pour étudier des aspects spécifiques de la traduction, y compris l’initiation10,11,29,30,31,32,l’allongement1,10,11,31,33,le ribosome calant33 et le changement de conformation33. La plupart des modifications impliquent l’utilisation de différents inhibiteurs de traduction. Chez les bactéries cependant, des études analogues ont été difficiles à mener en raison de la rareté des inhibiteurs avec le mécanisme d’action requis34. L’inhibiteur de traduction le plus couramment utilisé chez les bactéries est le chloramphénicol (CAM) qui se lie au centre de la peptidyl transférase (PTC) et empêche le positionnement correct de l’aminoacyl-ARNt dans le site A. En conséquence, cam empêche la formation d’une liaison peptidique qui conduit à arrêter les ribosomes allongés35. D’autres exemples d’inhibiteurs de traduction chez les bactéries sont la tétracycline (TET)36,la retapamuline (RET)34 et l’Onc11237 qui ont été utilisés pour étudier les sites d’initiation de la traduction. Le TET, qui empêche la livraison de tRNA au ribosome en chevauchant directement avec l’anticodon tige-boucle du tRNA au A-site, a été à l’origine appliqué pour vérifier les résultats obtenus du traitement de CAM puisqu’ils sont les deux antibiotiques inhibant l’élongation de traduction38. TET s’est avéré pour détecter tis primaire, cependant n’a pas pu indiquer TISinterne 36. RET se lie au PTC du ribosome bactérien, et empêche la formation de la première liaison peptidique en interférant avec un aminoacyl-ARNt allongé dans le site A. L’application de RET entraîne l’arrêt des ribosomes à la fois primaires et internesTIS 34. Onc112, un peptide antimicrobien riche en proline, se lie dans le tunnel de sortie et bloque la liaison aminoacyl-ARNt dans le site A ribosomique. En conséquence, Onc112 empêche les complexes d’initiation d’entrer dans la phase d’allongement37.
La principale information que fournit le profilage des ribosomes est la densité des ribosomes et leur position sur l’ARNm. Il a été appliqué avec succès pour étudier l’expression différentielle des gènes au niveau de la traduction dans diverses conditions de croissance1,6,mesurer l’efficacité translationnelle1,38,39 et détecter les événements de régulation de la traduction tels que la suspension ribosomique10. Ribo-seq permet également de découvrir la traduction d’ARNc annotés, de pseudogènes et de petits cadres de lecture ouverts non annotés (ORF) conduisant à l’identification de gènes codant des protéines nouvelles et/ou très courtes10,12,22,30,37. Dans de tels cas, RIBO-seq peut affiner et améliorer l’annotation du génome. Avec sa grande sensibilité pour l’identification des ORF traduits et sa nature quantitative, le profilage des ribosomes peut également servir d’indicateur pour la détermination du protéome ou pour faciliter les études protéomiques31,34,39. En cartographiant le TIS, le profilage des ribosomes révèle des isoformes N-terminalement étendues et tronquées de protéines connues10,32. Ribo-seq a également été adapté pour étudier le repliement co-traductionnel des protéines14,21,24. Cette méthode permet de mesurer des vitesses d’allongement1,10,39 ou de décoder des codons individuels6 et aide à développer des modèles quantitatifs de translation17. La méthode de profilage du ribosome est également capable de fournir des informations mécanistes sur le ribosome en pause chez les bactéries7,15,17,le déphasage40,la lecture stop-codon21,les défauts de terminaison/recyclage41,42 et les changements de conformation ribosomique33 chez les eucaryotes. Ribo-seq a également été adapté pour examiner l’impact de facteurs trans-agissants spécifiques sur la traduction tels que les miARN6 et les protéines de liaison à l’ARN chez les eucaryotes16,43. Cependant, il est important de reconnaître que le plan expérimental et la résolution obtenue de RIBO-seq déterminent la quantité d’informations qui peuvent être extraites des données de séquençage résultantes12.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10X TBE (powder)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9864</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol, 99%, pure</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>125472500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine 5&#39;-Triphosphate (ATP)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>P0756S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminium oxide calcinated pure p.a.</td>
			<td>Chempur</td>
			<td>114560600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride dihydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C3881-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>190321</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA Clean &#38; Concentrator -5</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>D4004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dnase I recombinant, Rnase-free</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4716728001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA disodium salt</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>E/P140/48</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl Alcohol Absolut 99,8%&#160; Pure-P.A.-Basic</td>
			<td>POCH Avantor Performance Materials Poland S.A</td>
			<td>BA6480111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filtration apparatus</td>
			<td>VWR Collection</td>
			<td>511-0265</td>
			<td>all-glass filtration apparatus, with funnel, fritted base, cap, 47 mm &#216; spring clamp and ground joint flask</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel 40 (19:1)</td>
			<td>Rotiphorese</td>
			<td>3030.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel Loading Dye, Blue, 6X</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E6138G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guanosine 5&#8242;-[&#946;,&#947;-imido]triphosphate trisodium salt hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G0635-25MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>labZAP</td>
			<td>A&#38;A Biotechnology</td>
			<td>040-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium acetate tetrahydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M5661-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MCE membrane fiter</td>
			<td>Alfatec Technology</td>
			<td>M47MCE45GWS</td>
			<td>pore size: 0.45um</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MICROBExpress Bacterial mRNA Purification</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM1905</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiplex Small RNA Library Prep Set for Illumina</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E7300S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-Free Water</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9937</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Acetate Anhydrous Pure P.A.</td>
			<td>POCH Avantor Performance Materials Poland S.A</td>
			<td>744330113</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quick-Load pBR322 DNA-MspI Digest</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E7323A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA Clean &#38; Concentrator -25</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>R1018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2889-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium carbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>223530-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydrogen carbonate pure p.a.</td>
			<td>POCH Avantor Performance Materials Poland S.A</td>
			<td>810530115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR Gold nucleic acid gel stain</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>S11494</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 Polynucleotide Kinase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0201L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 Polynucleotide Kinase Reaction Buffer</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B0201S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBE-Urea Sample Buffer (2x)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>LC6876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris(hydroxymethyl)amino-methane, ultrapure, 99,9%</td>
			<td>AlfaAesar</td>
			<td>J65594</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100, 98%</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>327371000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea G.R.</td>
			<td>lach:ner</td>
			<td>40096-AP0</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ribo-seq in bacteria: a sample collection and library preparation protocol for ngs sequencing

La technique de profilage des ribosomes (RIBO-seq) est actuellement l’outil le plus efficace pour étudier le processus de synthèse des protéines in vivo. L’avantage de cette méthode, par rapport à d’autres approches, est sa capacité à surveiller la traduction en cartographiant précisément la position et le nombre de ribosomes sur une transcription d’ARNm.
Dans cet article, nous décrivons les étapes consécutives de la collecte d’échantillons et de la préparation de la méthode RIBO-seq chez les bactéries, en soulignant les détails pertinents à la planification et à l’exécution de l’expérience.
Puisque le RIBO-seq repose sur des ribosomes intacts et des ARNm connexes, l’étape clé est l’inhibition rapide de la traduction et la désintégration adéquate des cellules. Ainsi, nous suggérons la filtration et le flash-congélation dans l’azote liquide pour la récolte cellulaire avec un prétraitement facultatif avec le chloramphénicol pour arrêter la traduction dans les bactéries. Pour la désintégration, nous proposons de broyer les cellules congelées avec du mortier et du pilon en présence d’oxyde d’aluminium pour perturber mécaniquement la paroi cellulaire. Dans ce protocole, un coussin de saccharose ou une ultracentrifugation à gradient de saccharose pour la purification par monosomes n’est pas nécessaire. Au lieu de cela, la séparation d’ADN messagère utilisant l’électrophorèse de gel de polyacrylamide (PAGE) suivie de l’excision ribosomique d’empreinte (bande 28-30 nt) est appliquée et fournit des résultats satisfaisants. Cela simplifie en grande partie la méthode et réduit le temps et les exigences d’équipement pour la procédure. Pour la préparation de la bibliothèque, nous vous recommandons d’utiliser le petit kit d’ARN disponible dans le commerce pour le séquençage Illumina à partir de New England Biolabs, en suivant les directives du fabricant avec un certain degré d’optimisation.
Les bibliothèques d’ADNc qui en résultent présentent la quantité et la qualité appropriées requises pour le séquençage de nouvelle génération (NGS). Le séquençage des bibliothèques préparées selon le protocole décrit donne 2 à 10 mln lectures cartographiées de manière unique par échantillon fournissant des données suffisantes pour une analyse bioinformatique complète. Le protocole que nous présentons est rapide et relativement facile et peut être réalisé avec un équipement de laboratoire standard.

Les résultats exemplaires présentés ici ont été obtenus dans une étude examinant la régulation de traduction dans les cellules sporulantes de Bacillus subtilis de WT. Pendant la nuit, les cultures ont été diluées à600 DO égales à 0,1 dans 100 mL de milieu riche et incubées à 37 °C avec des secousses vigoureuses jusqu’à ce que la DO600 atteigne 0,5-0,6. Le milieu riche a ensuite été remplacé par un milieu minimal pour induire le processus de sporulation et l’incubatio...

Watch this Scientific Journal Video about RIBO-seq in Bacteria: a Sample Collection and Library Preparation Protocol for NGS Sequencing at JoVE.com

RIBO-seq in Bacteria: a Sample Collection and Library Preparation Protocol for NGS Sequencing

Nous décrivons ici les étapes de la collecte d’échantillons et de la préparation pour RIBO-seq chez les bactéries. Le séquençage des bibliothèques préparées conformément à ces lignes directrices donne suffisamment de données pour une analyse bioinformatique complète. Le protocole que nous présentons est simple, utilise un équipement de laboratoire standard et prend sept jours de la lyse à l’obtention des bibliothèques.

The ribosome profiling technique (RIBO-seq) is currently the most effective tool for studying the process of protein synthesis in vivo. The advantage of ...

La technique de profilage des ribosomes, également appelée RIBO-seq, est actuellement l’outil le plus efficace pour étudier le processus de synthèse des protéines in vivo. L’avantage de cette méthode est sa capacité à surveiller la traduction en cartographiant précisément la position et le nombre de ribosomes. Ribo-seq est basé sur le fait que le ribosome, en se liant à la molécule d’ARNm, protège le fragment enfoui de la transcription lors de la digestion de la ribonucléase.Les fragments obtenus, appelés empreintes ribosomiques, peuvent être séquencés et cartographiés sur la transcription dont ils proviennent, ce qui entraîne la détermination de la position exacte des ribosomes. Simultanément au RIBO-seq, le séquençage de l’ARNm total à haut débit est effectué pour fournir un point de référence et permettre la comparaison des données du RIBO-seq et du RNA-seq lors de l’analyse des données. Avant la récolte des cellules, vous pouvez éventuellement ajouter du chloramphénicol à la culture bactérienne, à la concentration finale de 100 microgrammes par millilitre, pour inhiber la traduction.Incuber la culture avec l’antibiotique pendant une minute. Cette étape est importante si la récolte prend plus de temps que d’habitude, car l’inhibition de la traduction permet de prolonger le temps de prélèvement des échantillons. Prélever les échantillons à l’aide d’un système de filtration préchauffé.Vous pouvez introduire des secousses afin d’imiter les conditions de croissance. Arrêtez le filtrage lorsque tous les supports ont traversé la membrane, mais ne laissez pas le filtre sécher complètement. Recueillir les granulés bactériens en grattant rapidement les cellules du disque filtrant à l’aide d’une scoopula préchauffée et désinfectée.Placez immédiatement toute la scoopula avec les cellules récoltées dans un tube de 50 millilitres rempli d’azote liquide. Le granulé récolté doit être complètement recouvert d’azote liquide. Laissez le granulé geler à fond et déloger les cellules congelées à l’aide d’une scoopula préalablement refroidie.Fermez le couvercle et assurez-vous qu’il est perforé. Ceci est important, car l’azote liquide peut faire exploser les récipients fermés en raison du changement de pression lors de l’évaporation. Préparez le GMPP, l’écouvillon d’ADN et les tubes Eppendorf frais dédiés à la lysase.Préparer le tampon de lyse avec l’ajout de chloramphénicol si nécessaire. Allouer 500 microlitres de tampon de lyse par échantillon dans des tubes Eppendorf séparés et les placer sur de la glace. Décontaminer le mortier et le pilon avec un désinfectant de laboratoire et de l’éthanol à 70%.Refroidir le mortier et le pilon en versant de l’azote liquide dans le mortier. Transférer la pastille bactérienne congelée dans un mortier pré-réfrigéré et la broyer en poudre. Ajouter environ un volume d’oxyde d’aluminium et continuer le meulage.Gardez le mortier, le pilon et les cellules au frais en versant de l’azote liquide au besoin, pour ne pas laisser le contenu du mortier décongeler. Juste avant l’utilisation, ajoutez le GMPPNP et l’écouvillon d’ADN dans la partie aliquote du tampon de lyse. Transférer la solution dans le mortier et continuer le broyage.Laissez la lysase dégeler lentement pendant le broyage. Lorsque la lysase dégèle complètement, transférer le mélange dans le tube Eppendorf pré-refroidi et retourner à la glace. Centrifuger lysase à 20 0000 G pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius.Transférer les surnageants dans des tubes Eppendorf frais et pré-réfrigérés et les placer sur de la glace. Mesurer la concentration d’ARN dans chaque échantillon dilué avec NanoDrop. Divisez chaque lysat en deux parties, 0,5 à 1 milligramme d’ARN pour RIBO-seq, et le reste pour RNA-seq.À un milligramme de l’ARN, ajoutez 3,8 microlitres de MNase dans Tris pH 8, et rechargez-le avec un tampon de lyse au volume total de 500 microlitres. Incuber à 25 degrés Celsius, 300 tours par minute, pendant 45 minutes. Une fois l’incubation terminée, nettoyez les échantillons à l’avec une trousse de nettoyage de l’ARN disponible dans le commerce.Préparez un gel de TBE à 15% de polyacrylamide avec huit urées molaires et placez-le dans un réservoir avec tampon TBE. Pré-exécution pendant un minimum de 10 minutes à une tension constante de 200 volts. Mélanger les échantillons avec un tampon d’échantillon de TBE-Urée.Dénaturez à 95 degrés Celsius pendant une minute et placez-les immédiatement sur la glace. Lavez l’urée en injectant du tampon TBE dans des puits de gel à l’aide d’une seringue. Chargez les échantillons, en laissant un espace de puits entre eux pour séparer chaque échantillon et prévenir la contamination croisée.Utilisez 29 nucléotides-long oligo, et un mélange de 26 et 32 nucléotides-long oligos comme marqueurs. Exécutez l’électrophorèse à une tension constante de 180 volts. Préparer un tampon stérile pour l’incubation pendant la nuit.Une fois l’électrophorèse terminée, tachez le gel avec SYBR Gold. Exciser les fragments du gel entre 26 et 32 nucléotides avec une aiguille stérile ou une lame de rasoir, et placer les fragments de gel dans des tubes Eppendorf séparés. Changez l’aiguille ou la lame de rasoir entre les échantillons.Ajoutez 200 microlitres de tampon d’incubation de nuit à chaque Eppendorf et incuber les échantillons à 10 degrés Celsius, 1000 tours par minute, pendant la nuit. Le lendemain, nettoyez les échantillons avec un kit de nettoyage de l’ARN et éluez-les dans 18 microlitres d’eau sans nucléase. Les empreintes ribosomiques obtenues sont prêtes pour la préparation de la bibliothèque.Effectuer l’épuisement de l’ARN ribosomique pour les échantillons d’ARN-seq à l’aide d’un kit disponible dans le commerce. Ensuite, nettoyez les échantillons avec un kit de nettoyage de l’ARN. Effectuez l’hydrolyse alcaline comme suit;préparer le tampon d’hydrolyse alcaline, ajouter un volume du tampon à un volume de l’échantillon et incuber à 95 degrés Celsius pendant 25 minutes.Ajouter cinq microlitres de 3 molaires d’acétate de sodium pH 5,5 à chaque échantillon afin d’arrêter la réaction. Nettoyez les échantillons avec un kit de nettoyage de l’ARN et éluez-les dans 18 microlitres d’eau sans nucléase. L’ARN fragmenté aléatoirement obtenu est prêt pour la préparation de la bibliothèque.Ajouter 10 microlitres de tampon de réaction 10x et cinq microlitres de polynucléotide kinase T4 à chaque échantillon. Incuber à 37 degrés Celsius pendant une heure et demie. Passé ce délai, ajouter trois microlitres d’un ATP millimolaire et incuber à 37 degrés Celsius pendant une heure.Ensuite, nettoyez les échantillons avec un kit de nettoyage de l’ARN. Effectuez la préparation de la bibliothèque à l’aide du kit disponible dans le commerce, conformément au protocole fourni ici. Effectuez PAGE en utilisant du gel à 6% de polyacrylamide.Tachez le gel avec SYBR Gold. Fragments de gel d’accise contenant les bibliothèques. Pour les échantillons d’ARN-seq, la bibliothèque est comprise entre 135 et 180 nucléotides, et pour ribo-seq, entre 135 et 170 nucléotides.Utilisez des aiguilles stériles ou des lames de rasoir et placez les fragments de gel excisés dans des tubes Eppendorf séparés. N’oubliez pas de changer l’aiguille ou la lame de rasoir entre les échantillons. Ajouter 100 microlitres d’eau sans nucléase à chaque fragment de gel excisé.Et les incuber à 10 degrés Celsius, 450 tours par minute, pendant la nuit. Le lendemain, nettoyez les échantillons avec une trousse de nettoyage de l’ADN. Les bibliothèques obtenues sont prêtes pour le contrôle de la qualité et de la quantité avec une sensibilité élevée, l’électrophorèse de l’ADN sur puce, puis pour le séquençage de nouvelle génération.Les bibliothèques d’ADNc qui en résultent présentent une quantité et une qualité appropriées requises pour le séquençage de nouvelle génération, tel que vérifié par électrophorèse de l’ADN sur puce à haute sensibilité. Les bandes et les pics représentant les bibliothèques RIBO-seq sont plus étroits et mieux définis, par rapport à cela représentant les bibliothèques RNA-seq. Selon l’électrophorèse sur puce, les bibliothèques ont la lentille attendue.Les pics supplémentaires plus proches de 200 paires de bases présents dans les bibliothèques RIBO-seq peuvent indiquer des ribosomes hibernants, des empreintes ribosomiques non complètement digérées ou des artefacts, par exemple, l’ARNr, et peuvent être écartés lors de l’analyse bioinformatique lorsque les données obtenues à partir du séquençage sont coupées et que l’ARNt arnr est filtré. La quantité moyenne d’ADNc générée lors de la préparation de la bibliothèque est de 32 nanogrammes, ce qui fournit une quantité suffisante de matériel nécessaire au séquençage de nouvelle génération. Après le contrôle de la qualité par électrophorèse sur puce, les bibliothèques ont été extraites pour le séquençage d’une seule paire et de 50 paires de bases sur la plate-forme NextSeq 500 d’Illumina.Le découpage des adaptateurs et des séquences de mauvaise qualité a donné lieu à 25 à 47 millions de lectures par échantillon pour les échantillons d’ARN-seq, et à 25 à 50 millions de lectures par échantillon pour les échantillons RIBO-seq. Les données obtenues ont été vérifiées avec FastQC. Les échantillons d’ARN-seq et de RIBO-seq présentaient de très bonne qualité.La cartographie des bibliothèques préparées selon le protocole décrit a donné 2,4 à 9,6 millions de lectures mappées de manière unique par échantillon pour les échantillons d’ARN-seq, et 2,3 à 10,4 millions de lectures mappées de manière unique pour les échantillons RIBO-seq. Les données RIBO-seq présentent une périodicité triplée et un pic grand et étroit, correspondant aux ribosomes initiateurs et caractéristiques des empreintes ribosomiques, ce qui n’est pas observé dans les données RNA-seq. De plus, le graphique montrant les profils de couverture moyenne des empreintes ribosomiques et des fragments d’ARNm sur les séquences codantes révèle la proportion plus élevée de lectures mappées aux CDS dans l’ensemble de données RIBO-seq, comme prévu.La visualisation des empreintes ribosomiques cartographiées a montré des modèles très similaires par rapport aux résultats obtenus à partir de la même expérience réalisée en conséquence à la procédure ribo-seq standard, qui inclut la récupération monosome par ultracentrifugation de gradient de saccharose. Notre protocole a été utilisé pour étudier la régulation de la traduction dans diverses conditions de croissance, mais peut être appliqué pour étudier d’autres aspects de la traduction, comme la détection de sites d’initiation de la traduction et de nouveaux gènes codant pour les protéines. Le séquençage des bibliothèques préparées selon nos lignes directrices donne suffisamment de données pour une analyse bioinformatique complète.Le protocole que nous présentons ici est rapide, facile et rentable, et peut être exécuté avec un équipement de laboratoire standard.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

Préparation de l’échantillon d’Identification basé sur la spectrométrie de masse des régions de liaison à l’ARN

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

Recherche

Biochimie

An All-in-one Sample Holder for Macromolecular X-ray Crystallography with Minimal Background Scattering

Un porte-échantillon tout-en-un pour la cristallographie macromoléculaire de rayon X avec la diffusion minimale de fond

Macromolecular X-ray crystallography (MX) is the most prominent method to obtain high-resolution three-dimensional knowledge of biological macromolecules. ...

A Plasma Sample Preparation for Mass Spectrometry using an Automated Workstation

Préparation d’un échantillon de plasma pour la spectrométrie de masse à l’aide d’un poste de travail automatisé

Sample preparation for mass spectrometry analysis in proteomics requires enzymatic cleavage of proteins into a peptide mixture. This process involves ...

Sample Preparation for Probe Electrospray Ionization Mass Spectrometry

Préparation d’échantillons pour la spectrométrie de masse d’ionisation de l’électrospray de sonde

Mass spectrometry (MS) is a powerful tool in analytical chemistry because it provides very accurate information about molecules, such as mass-to-charge ...

TMT Sample Preparation for Proteomics Facility Submission and Subsequent Data Analysis

Préparation de l’échantillon TMT pour la soumission des installations de protéomique et l’analyse subséquente des données

Proteomic technologies are powerful methodologies that can aid our understanding of mechanisms of action in biological systems by providing a global view ...

MS2-Affinity Purification Coupled with RNA Sequencing in Gram-Positive Bacteria

Purification par affinité MS2 couplée au séquençage de l’ARN dans les bactéries à Gram positif

Although small regulatory RNAs (sRNAs) are widespread among the bacterial domain of life, the functions of many of them remain poorly characterized ...

NMR-Based Fragment Screening in a Minimum Sample but Maximum Automation Mode

Criblage de fragments basé sur la RMN dans un échantillon minimum mais un mode d’automatisation maximal

Fragment-based screening (FBS) is a well-validated and accepted concept within the drug discovery process both in academia and industry. The greatest ...

A Sample Preparation Pipeline for Microcrystals at the VMXm Beamline

Un pipeline de préparation d’échantillons pour les microcristaux à la ligne de faisceau VMXm

The mounting of microcrystals (&#60;10 &#181;m) for single crystal cryo-crystallography presents a non-trivial challenge. Improvements in data quality ...

Sample Preparation and Transfer Protocol for In-Vacuum Long-Wavelength Crystallography on Beamline I23 at Diamond Light Source

Protocole de préparation et de transfert d’échantillons pour la cristallographie à longue longueur d’onde sous vide sur la ligne de faisceau I23 à la source lumineuse Diamond

Long-wavelength macromolecular crystallography (MX) exploits the anomalous scattering properties of elements, such as sulfur, phosphorus, potassium, ...

Preparation of High-Temperature Sample Grids for Cryo-EM

Préparation de grilles d’échantillons à haute température pour Cryo-EM

The sample grids for cryo-electron microscopy (cryo-EM) experiments are usually prepared at a temperature optimal for the storage of biological samples, ...