Name: ribo-seq in bacteria: a sample collection and library preparation protocol for ngs sequencing
Uploaded: 2021-08-07T14:00:00
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ALS möchte die finanzielle Unterstützung der EMBO Installation Grants IG 3914 und POIR anerkennen. 04.04.00-00-3E9C/17-00 durchgeführt im Rahmen des Programms First TEAM der Stiftung für polnische Wissenschaft, das von der Europäischen Union im Rahmen des Europäischen Fonds für regionale Entwicklung kofinanziert wird.

1. Probenentnahme
<ol><li>Bereiten Sie eine Bakterienkultur vor. Wir empfehlen ein Kulturvolumen von 100 ml pro Probe.</li>
	<li>Vorbereitung von Geräten und Reagenzien für die Probenentnahme: zwei Messlöffel pro Probe, sterile 0,45 μm McE-Filter (Mixed Cellulose esters Membrane), 50 ml sterile Röhrchen, flüssiger Stickstoff, 50 mg/ml Chloramphenicol in 70% (vol/vol) Ethanol (optional). Durchstechen Sie den Deckel von 50-ml-Rohren, um die Verdunstung von flüssigem Stickstoff zu ermöglichen und die Explosion ges...

Die wichtigste technische Herausforderung des Ribosomen-Profilings besteht in der Notwendigkeit, die Translation schnell zu hemmen, um eine Momentaufnahme von Ribosomen auf mRNAs in einem bestimmten physiologischen Zustand von Interesse zu erfassen. Um dies zu erreichen, werden häufig Translationsinhibitoren, schnelle Ernte und Schockgefrieren in flüssigem Stickstoff verwendet. Die Anwendung von Antibiotika ist optional, da sie Artefakte verursachen können. Chloramphenicol ist ein häufig verwendetes Medikament, um l?...

Die Ribosomenprofilierungstechnik (RIBO-seq) wurde im Labor von Jonathan Weissman an der University of California, San Francisco1entwickelt. Im Vergleich zu anderen Methoden zur Untersuchung der Genexpression auf translationaler Ebene konzentriert sich RIBO-seq auf jede Ribosombindung an mRNA und liefert Informationen über seine Position und die relative Anzahl der Ribosomen auf einem Transkript. Es ermöglicht die Überwachung des Prozesses der Proteinsynthese in vivo und kann eine einzelne Codonauflösung und -genauigkeit liefern, die die Messung der Ribosomendichte sowohl auf der einzelnen mRNA als auch entlang des gesamten Transkriptoms in der Zelle ermöglicht. Grundlage der RIBO-seq-Technik ist die Tatsache, dass das Ribosom während der Translation das mRNA-Molekül bindet und so das vergrabene Fragment des Transkripts vor einer Ribonuklease-Verdauung schützt. Nach Zugabe der Ribonuklease wird die ungeschützte mRNA verdaut und die von Ribosomen eingeschlossenen Fragmente - typischerweise von ~28-30 nt lang - bleiben intakt. Diese Fragmente, die als ribosomale Fußabdrücke (RF) bezeichnet werden, können dann isoliert, sequenziert und auf das Transkript abgebildet werden, aus dem sie stammen, was zur Erkennung der genauen Position der Ribosomen führt. Tatsächlich wird die Ribosomenfähigkeit zum Schutz von mRNA-Fragmenten seit den 1960er Jahren verwendet, um ribosomale Bindungs- und Translationsinitiierungsstellen (TIS)2,3,4zu untersuchen. Mit dem Fortschritt in der Tiefensequenzierungstechnologie ist RIBO-seq jedoch zu einem Goldstandard für die Translationsüberwachunggeworden 5, der durch das Ribosomengagement genomweite Informationen über die Proteinsynthese liefern kann6. Ribosomenprofilierung füllte die technologische Lücke, die zwischen der Quantifizierung des Transkriptoms und des Proteoms bestand6.
Um ein Ribosomen-Profiling durchzuführen, müssen wir Zelllysat des Organismus erhalten, der unter den untersuchten Bedingungen gewachsen war. Die Störung dieser Bedingungen während der Zellentnahme und -lyse kann unzuverlässige Daten liefern. Um dies zu verhindern, werden häufig Translationsinhibitoren, schnelle Ernte und Schockgefrieren in flüssigem Stickstoff verwendet. Zellen können durch kryogenes Mahlen in einem mechanischen Homogenisator wie einer Mischermühle7,8 odereinem Perlenschläger9und durch Trituration durch eine Pipette10 oder mit einer Nadel11lysiert werden. Der Lysepuffer kann kurz vor oder kurz nach der Pulverisierung der Zellen zugegeben werden. In unserem Protokoll verwenden wir flüssigen Stickstoff zur Vorkühlung von Mörtel und Stößel sowie Aluminiumoxid als schonenderen Ansatz zur Störung der bakteriellen Zellwand, was eine RNA-Scherung verhindert, die häufig bei Methoden wie sonifikation auftritt. Nach der Pulverisierung fügen wir dem gekühlten Inhalt des Mörtels einen eiskalten Lysepuffer hinzu. Die Auswahl eines geeigneten Lysepuffers ist wichtig, um die beste Auflösung der ribosomalen Fußabdrücke zu erhalten. Da die Ionenstärke sowohl die HF-Größe als auch die Leserahmengenauigkeit beeinflusst, wird derzeit empfohlen, Lysepuffer mit geringer Ionenstärke und Pufferkapazität zu verwenden, auch wenn es den Anschein hat, dass die Pufferzusammensetzung die ribosomale Belegung auf mRNAs11,12nicht beeinflusst. Wichtige Bestandteile des Lysepuffers sind Magnesiumionen, deren Vorhandensein eine Dissoziation der ribosomalen Untereinheiten verhindert und spontane Konformationsveränderungen in den bakteriellen Ribosomen hemmt11,13. Calciumionen spielen ebenfalls eine bedeutende Rolle und sind essentiell für die Aktivität der Mikrokokkennuklease (MNase), die in der bakteriellen Ribosomenprofilierungsmethode verwendet wird14. Die Zugabe von Guanosin 5′-[β,γ-imido]triphosphat (GMP-PNP), einem nicht hydrolysierbaren Analogon von GTP, zusammen mit Chloramphenicol hemmt die Translation während der Lyse15.
Wenn das Lysat erhalten wird, wird es durch Zentrifugation geklärt und in zwei Portionen unterteilt, jeweils für eine RIBO-seq- und eine Hochdurchsatz-Gesamt-mRNA-Sequenzierung (RNA-seq), da sie gleichzeitig durchgeführt werden (Abbildung 1). RNA-seq bietet einen Bezugspunkt, der den Vergleich von Daten sowohl von RIBO-seq als auch von RNA-seq während der Datenanalyse ermöglicht. Das untersuchte Translatom wird durch Normalisierung ribosomaler Fußabdrücke zur mRNA-Häufigkeitdefiniert 16. Daten von RNA-seq können auch helfen, Klon- oder Sequenzierungsartefakte zu identifizieren17.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62544/62544fig01.jpg"> Abbildung 1. Schematische Darstellung der mRNA-Probenvorbereitung für RIBO-seq und RNA-seq. Für die RIBO-seq-Bibliotheksvorbereitung wird RNA mit MNase (A) verdaut, gefolgt von der Größenauswahl von RF von ~ 28-30 nt Länge (B); für RNA-seq wird RNA isoliert (C), von rRNA (D) erschöpft und die resultierende mRNA wird zufällig in Fragmente unterschiedlicher Länge (E) fragmentiert. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62544/62544fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
Die ersten Schritte des Verfahrens der Probenvorbereitung für RIBO-seq und RNA-seq unterscheiden sich geringfügig (Abbildung 1). Für das ribosomale Profiling muss das Lysat durch eine spezifische Endonuklease verdaut werden, um die mRNA-Moleküle abzubauen, die nicht durch die Ribosomen geschützt sind. In Standardprotokollen werden die erhaltenen Monosomen durch eine Saccharosekissen-Ultrazentrifugation oder eine Saccharosegradienten-Ultrazentrifugation8,14zurückgewonnen. In diesem Artikel zeigen wir, dass dieser Schritt nicht notwendig ist, um RF zu isolieren, die für das RIBO-seq in Bakterien erforderlich sind, ebenso für eukaryotische Zellen18, und dass die Größenauswahl der geeigneten mRNA-Fragmente aus dem Polyacrylamid-Gel ausreichend ist.
Für RNA-seq wird mRNA durch die Erschöpfung von rRNA aus der gesamten RNA erhalten - rRNA-Moleküle hybridisieren zu den biotinylierten Oligonukleotidsonden, die an die Streptavidin-beschichteten magnetischen Perlen binden. Die rRNA-Oligonukleotid-Perlenkomplexe werden dann mit einem Magneten aus der Probeentfernt,was zu einer rRNA-erschöpften Probe19,20führt. Die gereinigten mRNA-Moleküle werden dann durch alkalische Hydrolyse zufällig fragmentiert. Die erhaltenen Fragmente der mRNA sowie die ribosomalen Fußabdrücke werden in cDNA-Bibliotheken umgewandelt und für die Tiefensequenzierung vorbereitet (Abbildung 2). Dies beinhaltet die Reparatur der Enden, die nach der alkalischen Hydrolyse (für mRNA) und der enzymatischen Verdauung (für RF) erforderlich ist: Dephosphorylierung von 3'-Enden, gefolgt von Phosphorylierung von 5'-Enden. Die nächsten Schritte sind die Adapterligatur und die umgekehrte Transkription, um cDNA-Inserts zu erstellen, die von Sequenzen umrahmt werden, die für die Next Generation Sequencing (NGS) mit der Illumina-Plattform erforderlich sind. Die letzte Phase der Bibliotheksvorbereitung ist eine PCR-Reaktion, bei der die Konstrukte amplifiziert und mit probenspezifischen Barcodes markiert werden, um multiplexen und sequenzieren zu können, verschiedene Proben auf einem Kanal zu sequenzieren. Vor der Sequenzierung werden Qualität und Quantität der Bibliotheken durch die hochempfindliche DNA-On-Chip-Elektrophorese bewertet. cDNA-Bibliotheken mit entsprechenden Parametern können dann gepoolt und sequenziert werden. Die Sequenzierung kann auf verschiedenen Illumina-Plattformen wie MiSeq, NextSeq oder HighSeq durchgeführt werden, abhängig von der Anzahl der Bibliotheken, der erforderlichen Leselänge und der Sequenzierungstiefe. Nach der Sequenzierung wird die bioinformatische Analyse durchgeführt.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62544/62544fig02.jpg"> Abbildung 2. Bibliotheksvorbereitung. Die Bibliotheksvorbereitung umfasst die Reparatur der Enden, die Ligatur der Adapter, die umgekehrte Transkription und die Verstärkung mit Barcoding. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62544/62544fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
Die Ribosomenprofilierung ist eine universelle Methode, die sich leicht modifizieren und entsprechend der wissenschaftlichen Fragestellung anpassen lässt. Ursprünglich wurde es in Hefe1verwendet, aber kurz darauf wurde es auf Bakterienzellen21 sowie eukaryotische Modellorganismen wie Maus10,Zebrafisch22,Fruchtfliege23 und Arabidopsis thaliana24aufgetragen. Es wurde auch für die Untersuchung verschiedener Ribosomentypen verwendet: zytoplasmatische, mitochondriale25,26 und Chloroplast27,28. Bei Eukaryoten wird RIBO-seq üblicherweise angepasst und verfeinert, um spezifische Aspekte der Translation zu untersuchen, einschließlich Initiation10,11,29,30,31,32, Dehnung1,10,11,31,33, Ribosomenabwürgen33 und Konformationsänderung33. Die meisten Modifikationen beinhalten die Verwendung verschiedener Translationsinhibitoren. Bei Bakterien waren analoge Studien jedoch aufgrund des Mangels an Inhibitoren mit dem erforderlichen Wirkmechanismus schwierigdurchzuführen 34. Der am häufigsten verwendete Translationsinhibitor in Bakterien ist Chloramphenicol (CAM), das an das Peptidyltransferase-Zentrum (PTC) bindet und eine korrekte Positionierung der Aminoacyl-tRNA in der A-Stelle verhindert. Infolgedessen verhindert CAM die Bildung einer Peptidbindung, die dazu führt, dass die länglichen Ribosomen35blockiert werden. Weitere Beispiele für Translationsinhibitoren in Bakterien sind Tetracyclin (TET)36, Retapamulin (RET)34 und Onc11237, die zur Untersuchung von Translationsinitiierungsstellen verwendet wurden. TET, das die tRNA-Abgabe an das Ribosom verhindert, indem es sich direkt mit der Anticodon-Stammschleife der tRNA an der A-Stelle überschneidet, wurde ursprünglich angewendet, um die Ergebnisse der CAM-Behandlung zu überprüfen, da beide Antibiotika sind, die die Translationsdehnung hemmen38. Es wurde festgestellt, dass TET primäre TIS erkennt, konnte jedoch kein internes TIS36aufdecken. RET bindet im PTC des bakteriellen Ribosoms und verhindert die Bildung der ersten Peptidbindung, indem es mit einer Elongator-Aminoacyl-tRNA an der A-Stelle interferiert. Die Anwendung von RET führt zu einem Ribosomen-Arrest sowohl bei primären als auch bei internen TISs34. Onc112, ein prolinreiches antimikrobielles Peptid, bindet im Austrittstunnel und blockiert die Aminoacyl-tRNA-Bindung an der ribosomalen A-Stelle. Dadurch verhindert Onc112, dass Initiationskomplexe in die Dehnungsphase37eintreten.
Die Hauptinformation, die das Ribosomen-Profiling liefert, ist die Ribosomendichte und ihre Position auf der mRNA. Es wurde erfolgreich angewendet, um die differentielle Genexpression auf der Ebene der Translation in verschiedenen Wachstumsbedingungen1,6zu untersuchen, die translationale Effizienz1,38,39 zu messen und Translationsregulationsereignisse wie ribosomale Pausierung10zu erkennen. RIBO-seq ermöglicht auch die Aufdeckung der Translation von annotierter ncRNA, Pseudogenen und unangekündigten kleinen offenen Leserahmen (ORF), die zur Identifizierung neuer und/oder sehr kurzer proteinkodierender Gene10,12,22,30,37führen. In solchen Fällen kann RIBO-seq die Genomannotation verfeinern und verbessern. Mit seiner hohen Sensitivität für die Identifizierung übersetzter ORFs und seiner quantitativen Natur kann das Ribosomen-Profiling auch als Proxy für die Proteombestimmung oder zur Unterstützung von Proteomik-Studiendienen 31,34,39. Durch die Kartierung von TIS zeigt das Ribosomen-Profiling N-terminal ausgedehnte und abgeschnittene Isoformen bekannter Proteine10,32. RIBO-seq wurde auch angepasst, um die co-translationale Faltung der Proteine14,21,24zu untersuchen. Diese Methode ermöglicht die Messung von Dehnungsraten1,10,39 oder Dekodierungsgeschwindigkeiten einzelner Codons6 und hilft bei der Entwicklung quantitativer Modelle der Übersetzung17. Die Ribosomen-Profiling-Methode ist auch in der Lage, mechanistische Einblicke in die Ribosomen-Pause bei Bakterien7,15,17, Frameshifting40, Stop-Codon-Readthrough21, Abschluss- / Recyclingdefekte41,42 und ribosomale Konformationsänderungen33 in Eukaryoten zu liefern. RIBO-seq wurde auch angepasst, um den Einfluss spezifischer trans-wirkender Faktoren auf die Translation wie miRNAs6 und RNA-bindende Proteine in Eukaryoten16,43zuuntersuchen. Es ist jedoch wichtig anzuerkennen, dass das experimentelle Design und die erhaltene Auflösung von RIBO-seq die Menge an Informationen bestimmen, die aus den resultierenden Sequenzierungsdaten extrahiert werden können12.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10X TBE (powder)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9864</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol, 99%, pure</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>125472500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine 5&#39;-Triphosphate (ATP)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>P0756S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminium oxide calcinated pure p.a.</td>
			<td>Chempur</td>
			<td>114560600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride dihydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C3881-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>190321</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA Clean &#38; Concentrator -5</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>D4004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dnase I recombinant, Rnase-free</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4716728001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA disodium salt</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>E/P140/48</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl Alcohol Absolut 99,8%&#160; Pure-P.A.-Basic</td>
			<td>POCH Avantor Performance Materials Poland S.A</td>
			<td>BA6480111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filtration apparatus</td>
			<td>VWR Collection</td>
			<td>511-0265</td>
			<td>all-glass filtration apparatus, with funnel, fritted base, cap, 47 mm &#216; spring clamp and ground joint flask</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel 40 (19:1)</td>
			<td>Rotiphorese</td>
			<td>3030.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel Loading Dye, Blue, 6X</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E6138G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guanosine 5&#8242;-[&#946;,&#947;-imido]triphosphate trisodium salt hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G0635-25MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>labZAP</td>
			<td>A&#38;A Biotechnology</td>
			<td>040-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium acetate tetrahydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M5661-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MCE membrane fiter</td>
			<td>Alfatec Technology</td>
			<td>M47MCE45GWS</td>
			<td>pore size: 0.45um</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MICROBExpress Bacterial mRNA Purification</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM1905</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiplex Small RNA Library Prep Set for Illumina</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E7300S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-Free Water</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9937</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Acetate Anhydrous Pure P.A.</td>
			<td>POCH Avantor Performance Materials Poland S.A</td>
			<td>744330113</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quick-Load pBR322 DNA-MspI Digest</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E7323A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA Clean &#38; Concentrator -25</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>R1018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2889-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium carbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>223530-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydrogen carbonate pure p.a.</td>
			<td>POCH Avantor Performance Materials Poland S.A</td>
			<td>810530115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR Gold nucleic acid gel stain</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>S11494</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 Polynucleotide Kinase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0201L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 Polynucleotide Kinase Reaction Buffer</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B0201S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBE-Urea Sample Buffer (2x)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>LC6876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris(hydroxymethyl)amino-methane, ultrapure, 99,9%</td>
			<td>AlfaAesar</td>
			<td>J65594</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100, 98%</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>327371000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea G.R.</td>
			<td>lach:ner</td>
			<td>40096-AP0</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ribo-seq in bacteria: a sample collection and library preparation protocol for ngs sequencing

Die Ribosomenprofilierungstechnik (RIBO-seq) ist derzeit das effektivste Werkzeug, um den Prozess der Proteinsynthese in vivo zuuntersuchen. Der Vorteil dieser Methode im Vergleich zu anderen Ansätzen ist ihre Fähigkeit, die Translation zu überwachen, indem die Position und Anzahl der Ribosomen auf einem mRNA-Transkript genau abgebildet wird.
In diesem Artikel beschreiben wir die aufeinanderfolgenden Phasen der Probenentnahme und Vorbereitung für die RIBO-seq-Methode bei Bakterien und heben die Details hervor, die für die Planung und Durchführung des Experiments relevant sind.
Da das RIBO-seq auf intakte Ribosomen und verwandte mRNAs angewiesen ist, ist der Schlüsselschritt eine schnelle Hemmung der Translation und ein adäquater Zerfall der Zellen. Daher empfehlen wir die Filtration und das Schockgefrieren in flüssigem Stickstoff für die Zellernte mit einer optionalen Vorbehandlung mit Chloramphenicol, um die Translation in Bakterien zu unterbrechen. Für den Zerfall schlagen wir vor, gefrorene Zellen mit Mörtel und Stößel in Gegenwart von Aluminiumoxid zu mahlen, um die Zellwand mechanisch zu stören. In diesem Protokoll ist kein Saccharosekissen oder eine Saccharosegradienten-Ultrazentrifugation zur Monosomenreinigung erforderlich. Stattdessen wird die mRNA-Trennung mittels Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE) gefolgt von der ribosomalen Fußabdruckexzision (28-30 nt-Band) angewendet und liefert zufriedenstellende Ergebnisse. Dies vereinfacht die Methode weitgehend und reduziert den Zeit- und Geräteaufwand für das Verfahren. Für die Bibliotheksvorbereitung empfehlen wir die Verwendung des kommerziell erhältlichen kleinen RNA-Kits für die Illumina-Sequenzierung von New England Biolabs, das den Richtlinien des Herstellers mit einem gewissen Grad an Optimierung folgt.
Die resultierenden cDNA-Bibliotheken stellen eine angemessene Quantität und Qualität dar, die für Next Generation Sequencing (NGS) erforderlich ist. Die Sequenzierung der nach dem beschriebenen Protokoll erstellten Bibliotheken führt zu 2 bis 10 Mio. eindeutig abgebildeten Lesevorgängen pro Probe, die ausreichende Daten für eine umfassende bioinformatische Analyse liefern. Das Protokoll, das wir präsentieren, ist schnell und relativ einfach und kann mit Standard-Laborgeräten durchgeführt werden.

Die hier vorgestellten exemplarischen Ergebnisse wurden in einer Studie zur Translationsregulation in sporulierenden WT Bacillus subtilis Zellen erzielt. Über Nachtkulturen wurden auf OD600 entsprechend 0,1 in 100 ml reichhaltigem Medium verdünnt und bei 37 °C unter kräftigem Schütteln inkubiert, bis OD600 0,5-0,6 erreichte. Das reichhaltige Medium wurde dann durch minimales Medium ersetzt, um den Sporulationsprozess zu induzieren, und die Inkubation wurde für bis zu vier Stunden fort...

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RIBO-seq in Bacteria: a Sample Collection and Library Preparation Protocol for NGS Sequencing

Hier beschreiben wir die Phasen der Probenentnahme und Vorbereitung für RIBO-seq in Bakterien. Die Sequenzierung der nach diesen Richtlinien erstellten Bibliotheken liefert ausreichende Daten für eine umfassende bioinformatische Analyse. Das Protokoll, das wir präsentieren, ist einfach, verwendet Standard-Laborgeräte und dauert sieben Tage von der Lyse bis zur Beschaffung von Bibliotheken.

RIBO-seq in Bakterien: ein Probensammlungs- und Bibliotheksvorbereitungsprotokoll für die NGS-Sequenzierung

The ribosome profiling technique (RIBO-seq) is currently the most effective tool for studying the process of protein synthesis in vivo. The advantage of ...

Die Ribosomen-Profiling-Technik, auch RIBO-seq genannt, ist derzeit das effektivste Werkzeug, um den Prozess der Proteinsynthese in vivo zu untersuchen. Der Vorteil dieser Methode ist ihre Fähigkeit, die Translation zu überwachen, indem die Position und Anzahl der Ribosomen genau abgebildet wird. RIBO-seq basiert auf der Tatsache, dass das Ribosom durch die Bindung an das mRNA-Molekül das vergrabene Fragment des Transkripts bei der Ribonuklease-Verdauung schützt.Die erhaltenen Fragmente, ribosomale Fußabdrücke genannt, können sequenziert und auf das Transkript abgebildet werden, aus dem sie stammen, was zur Bestimmung der genauen Position der Ribosomen führt. Gleichzeitig mit dem RIBO-seq wird eine Hochdurchsatz-Gesamt-mRNA-Sequenzierung durchgeführt, um einen Bezugspunkt zu bieten und den Vergleich von Daten aus RIBO-seq und RNA-seq während der Datenanalyse zu ermöglichen. Vor der Zellernte können Sie der Bakterienkultur optional Chloramphenicol bis zur Endkonzentration von 100 Mikrogramm pro Milliliter hinzufügen, um die Translation zu hemmen.Inkubieren Sie die Kultur mit dem Antibiotikum für eine Minute. Dieser Schritt ist wichtig, wenn die Ernte länger als üblich dauert, da die Translationshemmung eine Verlängerung der Probensammelzeit ermöglicht. Sammeln Sie die Proben mit einem vorgewärmten Filtersystem.Sie können Schütteln einführen, um Wachstumsbedingungen nachzuahmen. Stoppen Sie die Filterung, wenn alle Medien die Membran passiert haben, aber lassen Sie den Filter nicht vollständig trocknen. Sammeln Sie Bakterienpellets, indem Sie die Zellen mit einer vorgewärmten, desinfizierten Schaufel schnell von der Filterscheibe abkratzen.Legen Sie sofort die gesamte Schaufel mit den geernteten Zellen in ein 50-Milliliter-Röhrchen, das mit flüssigem Stickstoff gefüllt ist. Das geerntete Pellet sollte vollständig mit flüssigem Stickstoff bedeckt sein. Lassen Sie das Pellet gründlich einfrieren und entdrängen Sie gefrorene Zellen mit einer zuvor abgekühlten Schaufel.Schließen Sie den Deckel und stellen Sie sicher, dass er durchstochen ist. Dies ist wichtig, da flüssiger Stickstoff aufgrund der Druckänderung bei der Verdampfung dazu führen kann, dass geschlossene Behälter explodieren. Bereiten Sie GMPP, DNA-Abstrich und frische Eppendorf-Röhrchen für Lysase vor.Bereiten Sie den Lysepuffer bei Bedarf unter Zugabe von Chloramphenicol vor. 500 Mikroliter Lysepuffer pro Probe in separate Eppendorf-Röhrchen zuordnen und auf Eis legen. Dekontaminieren Sie Mörser und Stößel mit einem Labordesinfektionsmittel und 70% Ethanol.Kühlen Sie Mörser und Stößel, indem Sie flüssigen Stickstoff in den Mörser gießen. Das gefrorene Bakterienpellet in einen vorgekühlten Mörser überführen und zu einem Pulver mahlen. Fügen Sie ungefähr ein Volumen Aluminiumoxid hinzu und schleifen Sie weiter.Halten Sie Mörser, Stößel und die Zellen kühl, indem Sie bei Bedarf flüssigen Stickstoff gießen, um den Inhalt des Mörtels nicht auftauen zu lassen. Kurz vor der Verwendung GMPPNP und DNA-Abstrich in das Lysepuffer-Aliquot geben. Die Lösung in den Mörtel überführen und weiter mahlen.Lassen Sie die Lysase beim Schleifen langsam auftauen. Wenn die Lysase vollständig auftaut, die Mischung in das vorgekühlte Eppendorf-Rohr geben und zum Eis zurückkehren. Zentrifugenlysase bei 20.0000 G für fünf Minuten bei vier Grad Celsius.Überstände in frische, vorgekühlte Eppendorf-Röhren geben und auf Eis legen. Messen Sie die RNA-Konzentration in jeder verdünnten Probe mit NanoDrop. Teilen Sie jedes Lysat in zwei Portionen, 0,5 bis 1 Milligramm RNA für RIBO-seq und den Rest für RNA-seq.Zu einem Milligramm der RNA fügen Sie 3,8 Mikroliter MNase in Tris pH 8 hinzu und ergänzen Sie es mit Lysepuffer auf das Gesamtvolumen von 500 Mikrolitern. Bei 25 Grad Celsius, 300 Schuss pro Minute, für 45 Minuten inkubieren. Wenn die Inkubation abgeschlossen ist, reinigen Sie die Proben mit einem handelsüblichen RNA-Reinigungskit.Bereiten Sie 15% Polyacrylamid-FSME-Gel mit acht molaren Harnstoff vor und legen Sie es in einen Tank mit FSME-Puffer. Mindestens 10 Minuten bei einer konstanten Spannung von 200 Volt vorlaufen. Mischen Sie die Proben mit dem TSME-Harnstoff-Probenpuffer.Denaturieren Sie bei 95 Grad Celsius für eine Minute und legen Sie sie sofort auf Eis. Waschen Sie den Harnstoff aus, indem Sie TSME-Puffer mit einer Spritze in Gelbrunnen injizieren. Laden Sie die Proben und lassen Sie einen Vertiefungsraum zwischen ihnen, um jede Probe zu trennen und Kreuzkontaminationen zu verhindern.Verwenden Sie 29 Nukleotide-lange Oligos und eine Mischung aus 26 und 32 Nukleotiden-langen Oligos als Marker. Führen Sie die Elektrophorese mit einer konstanten Spannung von 180 Volt durch. Bereiten Sie einen sterilen Puffer für die Inkubation über Nacht vor.Sobald die Elektrophorese abgeschlossen ist, färben Sie das Gel mit SYBR Gold. Fragmente des Gels zwischen 26 und 32 Nukleotiden mit einer sterilen Nadel oder einer Rasierklinge herausschneiden und die Gelfragmente in separate Eppendorf-Röhrchen geben. Wechseln Sie die Nadel oder Rasierklinge zwischen den Proben.Fügen Sie jedem Eppendorf 200 Mikroliter Übernachtinkubationspuffer hinzu und inkubieren Sie die Proben bei 10 Grad Celsius, 1000 Schuss pro Minute, über Nacht. Reinigen Sie die Proben am nächsten Tag mit einem RNA-Reinigungskit und eluieren Sie sie in 18 Mikrolitern nukleasefreiem Wasser. Die erhaltenen ribosomalen Fußabdrücke sind bereit für die Bibliotheksvorbereitung.Führen Sie eine ribosomale RNA-Depletion für Proben für RNA-seq mit einem kommerziell erhältlichen Kit durch. Als nächstes reinigen Sie die Proben mit einem RNA-Reinigungskit. Führen Sie die alkalische Hydrolyse wie folgt durch; bereiten Sie den alkalischen Hydrolysepuffer vor, fügen Sie ein Volumen des Puffers zu einem Volumen der Probe hinzu und inkubieren Sie bei 95 Grad Celsius für 25 Minuten.Fügen Sie fünf Mikroliter von 3 molaren Natriumacetat pH 5,5 zu jeder Probe hinzu, um die Reaktion zu stoppen. Reinigen Sie die Proben mit einem RNA-Reinigungskit und eluieren Sie sie in 18 Mikrolitern nukleasefreiem Wasser. Die erhaltene zufällig fragmentierte RNA ist bereit für die Bibliotheksvorbereitung.Fügen Sie jeder Probe 10 Mikroliter 10x Reaktionspuffer und fünf Mikroliter T4-Polynukleotidkinase hinzu. Eineinhalb Stunden bei 37 Grad Celsius inkubieren. Nach dieser Zeit drei Mikroliter mit einem millimolaren ATP hinzufügen und eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius inkubieren.Als nächstes reinigen Sie die Proben mit einem RNA-Reinigungskit. Führen Sie die Bibliotheksvorbereitung mit dem handelsüblichen Kit gemäß dem hier bereitgestellten Protokoll durch. Führen Sie PAGE mit 6% Polyacrylamid-Gel durch.Das Gel mit SYBR Gold beflecken. Verbrauchen Sie Gelfragmente, die die Bibliotheken enthalten. Für RNA-seq-Proben liegt die Bibliothek zwischen 135 und 180 Nukleotiden, für RIBO-seq zwischen 135 und 170 Nukleotiden.Verwenden Sie sterile Nadeln oder Rasierklingen und legen Sie die herausgeschnittenen Gelfragmente in separate Eppendorf-Röhrchen. Denken Sie daran, die Nadel oder Rasierklinge zwischen den Proben zu wechseln. Fügen Sie jedem herausgeschnittenen Gelfragment 100 Mikroliter nukleasefreies Wasser hinzu.Und inkubieren Sie sie bei 10 Grad Celsius, 450 Schuss pro Minute, über Nacht. Reinigen Sie die Proben am nächsten Tag mit einem DNA-Reinigungsset. Die erhaltenen Bibliotheken sind bereit für die Qualitäts- und Quantitätskontrolle mit hoher Empfindlichkeit, DNA-On-Chip-Elektrophorese und dann für die Sequenzierung der nächsten Generation.Die resultierenden cDNA-Bibliotheken stellen eine angemessene Quantität und Qualität dar, die für die Sequenzierung der nächsten Generation erforderlich ist, wie durch hochempfindliche DNA-On-Chip-Elektrophorese bestätigt wird. Die Bänder und Peaks, die die RIBO-seq-Bibliotheken repräsentieren, sind enger und besser definiert, verglichen mit denen, die die RNA-seq-Bibliotheken darstellen. Nach der On-Chip-Elektrophorese haben die Bibliotheken die erwartete Linse.Die zusätzlichen Peaks, die näher an 200 Basenpaaren in RIBO-seq-Bibliotheken vorhanden sind, können auf überwinternde Ribosomen, nicht vollständig verdaute ribosomale Fußabdrücke oder Artefakte, z. B. rRNA, hinweisen und können während der bioinformatischen Analyse verworfen werden, wenn die aus der Sequenzierung gewonnenen Daten getrimmt und rRNA tRNA gefiltert wird. Die durchschnittliche Menge an cDNA, die bei der Bibliotheksvorbereitung erzeugt wird, beträgt 32 Nanogramm, was eine ausreichende Menge an Material liefert, die für die Sequenzierung der nächsten Generation benötigt wird. Nach der Qualitätskontrolle durch On-Chip-Elektrophorese wurden Bibliotheken für die Einzel- und 50-Basenpaar-Sequenzierung auf der NextSeq 500-Plattform von Illumina gezogen.Das Trimmen der Adapter und Sequenzen von schlechter Qualität führte zu 25 bis 47 Millionen Lesevorgängen pro Probe für RNA-seq-Proben und 25 bis 50 Millionen Lesevorgängen pro Probe für RIBO-seq-Proben. Die gewonnenen Daten wurden mit FastQC qualitätskontrolliert. Sowohl RNA-seq- als auch RIBO-seq-Proben wiesen eine sehr gute Qualität auf.Die Kartierung der nach dem beschriebenen Protokoll erstellten Bibliotheken ergab 2,4 bis 9,6 Millionen eindeutig zugeordnete Lesevorgänge pro Probe für RNA-seq-Proben und 2,3 bis 10,4 Millionen eindeutig zugeordnete Lesevorgänge für RIBO-seq-Proben. RIBO-seq-Daten weisen eine dreifache Periodizität und einen hohen, schmalen Peak auf, der den initiierenden Ribosomen entspricht und für die ribosomalen Fußabdrücke charakteristisch ist, was in den RNA-seq-Daten nicht beobachtet wird. Darüber hinaus zeigt das Diagramm, das die Profile der durchschnittlichen Abdeckung von ribosomalen Fußabdrücken und mRNA-Fragmenten auf den kodierenden Sequenzen zeigt, den höheren Anteil der Lesevorgänge, die den CDS im RIBO-seq-Datensatz zugeordnet sind, wie erwartet.Die Visualisierung der kartierten ribosomalen Fußabdrücke zeigte sehr ähnliche Muster im Vergleich zu den Ergebnissen desselben Experiments, das entsprechend dem Standard-RIBO-seq-Verfahren durchgeführt wurde, das die Monosomenrückgewinnung durch Saccharosegradienten-Ultrazentrifugation umfasst. Unser Protokoll wurde verwendet, um die Translationsregulation unter verschiedenen Wachstumsbedingungen zu untersuchen, kann aber angewendet werden, um andere Aspekte der Translation zu untersuchen, wie den Nachweis von Translationsinitiierungsstellen und neuartige proteinkodierende Gene. Die Sequenzierung der nach unseren Richtlinien erstellten Bibliotheken liefert ausreichende Daten für eine umfassende bioinformatische Analyse.Das Protokoll, das wir hier vorstellen, ist schnell, einfach und kostengünstig und kann mit Standardlaborgeräten durchgeführt werden.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

Probenvorbereitung für Masse Spektrometrie-basierte Identifikation der RNA-bindende Regionen

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

Forschung

Biochemie

An All-in-one Sample Holder for Macromolecular X-ray Crystallography with Minimal Background Scattering

Ein All-in-One-Probenhalter für makromolekulare Röntgenkristallographie mit minimaler Hintergrundstreuung

Macromolecular X-ray crystallography (MX) is the most prominent method to obtain high-resolution three-dimensional knowledge of biological macromolecules. ...

A Plasma Sample Preparation for Mass Spectrometry using an Automated Workstation

Eine Plasma-Probenvorbereitung für die Massenspektrometrie mit einer automatisierten Workstation

Sample preparation for mass spectrometry analysis in proteomics requires enzymatic cleavage of proteins into a peptide mixture. This process involves ...

Sample Preparation for Probe Electrospray Ionization Mass Spectrometry

Probenvorbereitung für Probe Elektrospray-Ionen-Massenspektrometrie

Mass spectrometry (MS) is a powerful tool in analytical chemistry because it provides very accurate information about molecules, such as mass-to-charge ...

TMT Sample Preparation for Proteomics Facility Submission and Subsequent Data Analysis

TMT-Beispielvorbereitung für proteomics Facility Submission und nachfolgende Datenanalyse

Proteomic technologies are powerful methodologies that can aid our understanding of mechanisms of action in biological systems by providing a global view ...

MS2-Affinity Purification Coupled with RNA Sequencing in Gram-Positive Bacteria

MS2-Affinitätsreinigung gekoppelt mit RNA-Sequenzierung in grampositiven Bakterien

Although small regulatory RNAs (sRNAs) are widespread among the bacterial domain of life, the functions of many of them remain poorly characterized ...

NMR-Based Fragment Screening in a Minimum Sample but Maximum Automation Mode

NMR-basiertes Fragment-Screening mit minimaler Probe, aber maximalem Automatisierungsmodus

Fragment-based screening (FBS) is a well-validated and accepted concept within the drug discovery process both in academia and industry. The greatest ...

A Sample Preparation Pipeline for Microcrystals at the VMXm Beamline

Eine Probenvorbereitungspipeline für Mikrokristalle an der VMXm-Beamline

The mounting of microcrystals (&#60;10 &#181;m) for single crystal cryo-crystallography presents a non-trivial challenge. Improvements in data quality ...

Sample Preparation and Transfer Protocol for In-Vacuum Long-Wavelength Crystallography on Beamline I23 at Diamond Light Source

Probenvorbereitungs- und Übertragungsprotokoll für die In-Vakuum-Langwellenkristallographie auf der Beamline I23 an der Diamantlichtquelle

Long-wavelength macromolecular crystallography (MX) exploits the anomalous scattering properties of elements, such as sulfur, phosphorus, potassium, ...

Preparation of High-Temperature Sample Grids for Cryo-EM

Vorbereitung von Hochtemperatur-Probengittern für Kryo-EM

The sample grids for cryo-electron microscopy (cryo-EM) experiments are usually prepared at a temperature optimal for the storage of biological samples, ...