Name: ribo-seq in bacteria: a sample collection and library preparation protocol for ngs sequencing
Uploaded: 2021-08-07T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about RIBO-seq in Bacteria: a Sample Collection and Library Preparation Protocol for NGS Sequencing at JoVE.com

ALS רוצה להכיר בתמיכה הכספית של EMBO התקנה מענקים IG 3914, ו POIR. 04.04.00-00-3E9C/17-00 שבוצע במסגרת תוכנית TEAM הראשונה של הקרן למדע פולני במימון משותף של האיחוד האירופי תחת הקרן האירופית לפיתוח אזורי.

1. אוסף לדוגמה
<ol><li>הכינו תרבות חיידקים. אנו ממליצים על נפח תרבות של 100 מ"ל לכל מדגם.</li>
	<li>הכן ציוד ריאגנטים לאיסוף מדגם: שתי כפות מדידה לדגימה, סטרילי 0.45 מיקרומטר מעורב אסטרים תאית ממברנה (MCE) מסננים, 50 מ"ל צינורות סטריליים, חנקן נוזלי, 50 מ"ג / מ"ל כלוראמפניקול ב 70% (vol / vol) אתנול (אופציונלי). לנקב א...

האתגר הטכני העיקרי של פרופיל הריבוזום הוא הצורך לעכב במהירות את התרגום על מנת ללכוד תמונת מצב של ריבוזומים על mRNAs במצב פיזיולוגי מסוים של עניין. כדי להשיג זאת, מעכבי תרגום, קציר מהיר והקפאת פלאש בחנקן נוזלי משמשים בדרך כלל. החלת אנטיביוטיקה היא אופציונלית שכן הם יכולים לגרום חפצים. כלוראמפ?...

טכניקת פרופיל הריבוזום (RIBO-seq) פותחה במעבדתו של ג'ונתן וייסמן באוניברסיטת קליפורניה בסן פרנסיסקו1. בהשוואה לשיטות אחרות המשמשות לחקר ביטוי גנים ברמה התרגומית, RIBO-seq מתמקד בכל מחייב ריבוזום ל- mRNA ומספק מידע על מיקומו ועל המספר היחסי של ריבוזומים בתעתיק. זה מאפשר ניטור התהליך של סינתזת חלבון vivo והוא יכול לספק רזולוציה קודון יחיד ודיוק המאפשר מדידה של צפיפות ריבוזום על שניהם, mRNA הפרט לאורך התמלול כולו בתא. בבסיס טכניקת RIBO-seq טמונה העובדה כי במהלך התרגום הריבוזום קושר את מולקולת mRNA ובכך מגן על החלק הקבור של התמליל מעיכול ריבונוקלאאז. עם תוספת של ribonuclease, mRNA לא מוגן מתעכל ואת שברים מוקף ריבוזומים - בדרך כלל של ~ 28-30 nt ארוך - להישאר שלם. שברים אלה, הנקראים עקבות ריבוזומליות (RF), יכולים להיות מבודדים, רציפים וממופים לתעתיק שמקורו בזיהוי המיקום המדויק של הריבוזומים. למעשה, היכולת הריבוזום להגן על שברי mRNA שימש מאז 1960 ללמוד אתרי ייזום מחייב ותרגום ריבוזומלי (TIS)2,3,4. עם זאת, עם ההתקדמות בטכנולוגיית רצף עמוק, RIBO-seq הפך תקן זהב לניטור תרגום5 אשר, באמצעות מעורבות ריבוזום, יכול לספק מידע גנומי רחב על סינתזת חלבונים6. פרופיל ריבוזום מילא את הפער הטכנולוגי שהיה קיים בין כימות התמלול לבין פרוטאום6.
כדי לנהל פרופיל ריבוזום אנחנו צריכים להשיג ליזאט התא של האורגניזם שגדל בתנאים שנחקרו. שיבוש תנאים אלה במהלך איסוף תאים ותמוגה עשוי לספק נתונים לא אמינים. כדי למנוע זאת, מעכבי תרגום, קציר מהיר והקפאת פלאש בחנקן נוזלי משמשים בדרך כלל. תאים יכולים להיות lysed על ידי שחיקה קריוגנית homogenizer מכני כמו טחנת מערבל7,8 או מקצף חרוזים9, ועל ידי טריטורציה באמצעות פיפטה10 או עם מחט11. מאגר התמוגה ניתן להוסיף רק לפני או זמן קצר לאחר ריסוק של התאים. בפרוטוקול שלנו אנו משתמשים חנקן נוזלי כדי מרגמה precool ועלי, כמו גם תחמוצת אלומיניום כגישה עדינה יותר להפרעה של דופן התא החיידקי, אשר מונע גזירה RNA לעתים קרובות נתקל כאשר שיטות כגון sonification מוחלים. לאחר ריסוק, אנו מוסיפים חיץ תמוגה קר כקרח לתכולת המרגמה מקוררת. בחירה של מאגר תמוגה מתאים חשוב להשגת הרזולוציה הטובה ביותר של עקבות ריבוזומליות. מאז חוזק יוני משפיע הן על גודל RF ואת דיוק מסגרת הקריאה, מומלץ כיום להשתמש מאגרי תמוגה עם חוזק יוני נמוך קיבולת חיץ, גם אם נראה כי הרכב המאגר אינו משפיע על תפוסה ריבוזואלית על mRNAs11,12. מרכיבים חשובים של מאגר התמוגה הם יוני מגנזיום, שנוכחותם מונעת ניתוק של יחידות המשנה הריבוזומליות ומעכבת שינויים קונפורמיים ספונטניים בריבוזומים החיידקיים11,13. יוני סידן גם לשחק תפקיד משמעותי והם חיוניים לפעילות של גרעין מיקרוקוקאלי (MNase) המשמש בשיטת פרופיל ריבוזום חיידקי14. תוספת של גואנוסין 5′-[β,γ-imido]טריפוספט (GMP-PNP), אנלוגי שאינו הידרוליזה של GTP, יחד עם כלוראמפניקול מעכב תרגום במהלך תמוגה15.
כאשר מתקבל הליסנט, מובהר על ידי צנטריפוגה ומחולק לשני חלקים, כל אחד עבור RIBO-seq ורצף mRNA כולל בעל תפוקה גבוהה (RNA-seq) שכן הם מבוצעים בו זמנית (איור 1). RNA-seq מספק נקודת התייחסות המאפשרת השוואה של נתונים הן RIBO-seq והן RNA-seq במהלך ניתוח נתונים. התרגום שנחקר מוגדר על ידי נורמליזציה של עקבות ריבוזומליות לשפע mRNA16. נתונים מ-RNA-seq יכולים גם לסייע בזיהוי שיבוט או רצף של חפצים17.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62544/62544fig01.jpg"> איור 1. שרטוטים של הכנת דגימת mRNA עבור ריבו-seq ו- RNA-seq. להכנת ספריית RIBO-seq, RNA מתעכל עם MNase (A), ואחריו מבחר הגודל של RF של ~ 28-30 nt אורך (B); עבור RNA-seq RNA מבודד (C), מדולדל של rRNA (D), ואת mRNA וכתוצאה מכך הוא מקוטע באופן אקראי לרסיסים באורכים משתנים (E). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62544/62544fig01large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
השלבים הראשוניים של הליך ההכנה לדוגמה עבור RIBO-seq ו- RNA-seq שונים במקצת (איור 1). עבור פרופיל ריבוזומלי, lysate צריך להיות מתעכל על ידי אנדונוקלאאז מסוים כדי להשפיל את מולקולות mRNA לא מוגן על ידי ריבוזומים. בפרוטוקולים סטנדרטיים, מונוזומים המתקבלים הם התאוששו על ידי אולטרה צנטריפוגציה כרית סוכרוז או אולטרה צנטריפוגציה שיפוע סוכרוז8,14. במאמר זה, אנו מראים כי שלב זה אינו הכרחי כדי לבודד RF הנדרש עבור RIBO-seq בחיידקים, כמו כן עבור תאים אוקריוטיים18, וכי מבחר גודל של שברי mRNA אורך המתאים מן ג'ל polyacrylamide מספיק.
עבור RNA-seq, mRNA מתקבל על ידי דלדול של rRNA מן RNA הכולל - מולקולות rRNA הכלאה לבדיקות אוליגונוקלאוטיד biotinylated אשר נקשרים חרוזים מגנטיים מצופים סטרפטבידין. קומפלקסים rRNA-oligonucleotide-חרוזים מוסרים לאחר מכן מן המדגם עם מגנט וכתוצאה מכך מדגם מדולדל rRNA19,20. מולקולות mRNA מטוהרים לאחר מכן מפוצלים באופן אקראי על ידי הידרוליזה אלקליין. שברי ה-mRNA המתקבלים, כמו גם עקבות הריבוזומליות, מומרים לספריות cDNA ומוכנים לריצוף עמוק(איור 2). זה כרוך בתיקון מסתיים הדרוש לאחר הידרוליזה אלקליין (עבור mRNA) ועיכול אנזימטי (עבור RF): dephosphorylation של 3 ' קצוות ואחריו זרחון של קצוות 5 '. השלבים הבאים הם קשירת מתאמים ואת התמלול ההפוך כדי ליצור מוסיף cDNA ממוסגר על ידי רצפים הנדרשים עבור ריצוף הדור הבא (NGS) באמצעות פלטפורמת Illumina. השלב האחרון של הכנת הספרייה הוא תגובת PCR שבה המבנים מוגברים ומתויגים עם ברקודים ספציפיים לדוגמה כדי לאפשר multiplexing רצף דגימות שונות בערוץ אחד. לפני הרצף, האיכות והכמות של הספריות מוערכים על ידי אלקטרופורזה DNA רגישות גבוהה על השבב. לאחר מכן ניתן לאגד ולרצף ספריות cDNA עם פרמטרים מתאימים. ניתן לבצע רצף בפלטפורמות שונות של Illumina, כגון MiSeq, NextSeq או HighSeq, בהתאם למספר הספריות, אורך הקריאה הנדרש ועומק הרצף. לאחר הרצף מבוצע הניתוח הביואינפורמטי.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62544/62544fig02.jpg"> איור 2. הכנת ספרייה. הכנת הספרייה כוללת את תיקון הקצוות, קשירת מתאמים, שעתוק הפוך והגברה עם ברקודינג. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62544/62544fig02large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
פרופיל הריבוזום הוא שיטה אוניברסלית אשר ניתן לשנות ולהתאים בקלות על פי השאלה המדעית. במקור הוא שימש שמרים1, אבל זמן קצר לאחר מכן הוחל על תאים חיידקיים21, כמו גם אורגניזמים מודל אוקריוטי כולל עכבר10, זברה דג22, זבוב פירות23 ו Arabidopsis thaliana24. הוא שימש גם לחקר סוגים שונים של ריבוזומים: ציטופלסמי, מיטוכונדריאלי25,26 וכלורופלסט27,28. באיקריוטים RIBO-seq מותאם ומעודן בדרך כלל כדי לחקור היבטים ספציפיים של התרגום, כולל חניכה10,11,29,30,31,32, התארכות 1,10,11,31,33, ריבוזום השתהות33 ושינוי קונפורמציה33. רוב השינויים כרוכים בשימוש במעכבי תרגום שונים. בחיידקים עם זאת, מחקרים מקבילים היו קשים לביצוע בגלל מחסור במעכבים עם מנגנון הפעולה הנדרש34. מעכב התרגום הנפוץ ביותר בחיידקים הוא כלוראמפניקול (CAM) הנקשר למרכז הפפטידיל טרנספראז (PTC) ומונע מיקום נכון של האמינואציל-tRNA באתר A. כתוצאה מכך, CAM מונע היווצרות של קשר פפטיד אשר מוביל למעצר ריבוזומים מוארכים35. דוגמאות אחרות של מעכבי תרגום בחיידקים הם טטרציקלין (TET)36, retapamulin (RET)34 ו Onc11237 אשר שימשו כדי לחקור אתרי ייזום תרגום. TET, אשר מונע משלוח tRNA לריבוזום על ידי חפיפה ישירה עם לולאת גזע אנטיקודון של tRNA באתר A, הוחל במקור כדי לאמת את התוצאות שהתקבלו מטיפול CAM שכן שניהם אנטיביוטיקה מעכבת התארכות תרגום38. TET נמצא לזהות TIS ראשי, עם זאת לא הצליח לחשוף פנימי TIS36. RET נקשר PTC של ריבוזום חיידקי, ומונע היווצרות של הקשר פפטיד הראשון על ידי הפרעה עם aminoacyl-tRNA מוארך באתר. החלת תוצאות RET במעצר ריבוזומים הן ראשי, כמו גם פנימי TISS34. Onc112, פפטיד אנטי מיקרוביאלי עשיר בפרולין, נקשר במנהרת היציאה וחוסם את כריכת aminoacyl-tRNA באתר ריבוזומלי A. כתוצאה מכך, Onc112 מונע ממתחמי חניכה להיכנס לשלב התארכות37.
המידע העיקרי פרופיל ריבוזום מספק הוא צפיפות ריבוזומים ואת מיקומם על mRNA. זה יושם בהצלחה לחקור ביטוי גנים דיפרנציאליים ברמת התרגום בתנאי צמיחה שונים1,6, למדוד יעילות תרגום1,38,39 ולזהות אירועי ויסות תרגום כגון השהייה ריבוזומלית10. RIBO-seq מאפשר גם לחשוף את התרגום של ncRNA ביאורים, פסאודוגנים ומסגרות קריאה פתוחות קטנות ללא ביאורים (ORF) המוביל לזיהוי של גנים קידוד חלבון הרומן ו / או קצר מאוד10,12,22,30,37. במקרים כאלה, RIBO-seq יכול לכוונן ולשפר ביאור הגנום. עם הרגישות הגבוהה שלה לזיהוי של ORFs מתורגם ואופיו הכמותי, פרופיל ריבוזום יכול לשמש גם פרוקסי לקביעת פרוטאום או בסיוע מחקרים פרוטאומיקים31,34,39. על ידי מיפוי TIS, פרופיל ריבוזום חושף N-סופני מורחב וקצץ isoforms של חלבונים ידועים10,32. RIBO-seq הותאם גם ללמוד קיפול תרגום משותף של חלבונים14,21,24. שיטה זו מאפשרת מדידה של שיעורי התארכות1,10,39 או מהירויות פענוח של קודונים בודדים6 ומסייעת בפיתוח מודלים כמותיים של תרגום17. שיטת פרופיל ריבוזום הוא גם מסוגל לספק תובנות מכניות לתוך הריבוזום השהיה בחיידקים7,15,17, frameshifting40, עצור קודון readthrough21, סיום / מיחזור פגמים41,42 ו שינויים קונפורמציה ריבוזומלית33 באיקריוטים. RIBO-seq הותאם גם כדי לבחון את ההשפעה של גורמים טרנס-משחקים ספציפיים על תרגום כגון miRNAs6 וחלבונים מחייבי RNA באיקריוטים16,43. עם זאת, חשוב להכיר בכך שהתכנון הניסיוני והרזולוציה המתקבלת של RIBO-seq קובעים את כמות המידע שניתן לחלץ מנתוני הרצףהמתקבלים 12.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10X TBE (powder)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9864</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol, 99%, pure</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>125472500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine 5&#39;-Triphosphate (ATP)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>P0756S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminium oxide calcinated pure p.a.</td>
			<td>Chempur</td>
			<td>114560600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride dihydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C3881-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>190321</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA Clean &#38; Concentrator -5</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>D4004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dnase I recombinant, Rnase-free</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4716728001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA disodium salt</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>E/P140/48</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl Alcohol Absolut 99,8%&#160; Pure-P.A.-Basic</td>
			<td>POCH Avantor Performance Materials Poland S.A</td>
			<td>BA6480111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filtration apparatus</td>
			<td>VWR Collection</td>
			<td>511-0265</td>
			<td>all-glass filtration apparatus, with funnel, fritted base, cap, 47 mm &#216; spring clamp and ground joint flask</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel 40 (19:1)</td>
			<td>Rotiphorese</td>
			<td>3030.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel Loading Dye, Blue, 6X</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E6138G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guanosine 5&#8242;-[&#946;,&#947;-imido]triphosphate trisodium salt hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G0635-25MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>labZAP</td>
			<td>A&#38;A Biotechnology</td>
			<td>040-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium acetate tetrahydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M5661-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MCE membrane fiter</td>
			<td>Alfatec Technology</td>
			<td>M47MCE45GWS</td>
			<td>pore size: 0.45um</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MICROBExpress Bacterial mRNA Purification</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM1905</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiplex Small RNA Library Prep Set for Illumina</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E7300S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-Free Water</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9937</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Acetate Anhydrous Pure P.A.</td>
			<td>POCH Avantor Performance Materials Poland S.A</td>
			<td>744330113</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quick-Load pBR322 DNA-MspI Digest</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E7323A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA Clean &#38; Concentrator -25</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>R1018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2889-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium carbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>223530-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydrogen carbonate pure p.a.</td>
			<td>POCH Avantor Performance Materials Poland S.A</td>
			<td>810530115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR Gold nucleic acid gel stain</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>S11494</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 Polynucleotide Kinase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0201L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 Polynucleotide Kinase Reaction Buffer</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B0201S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBE-Urea Sample Buffer (2x)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>LC6876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris(hydroxymethyl)amino-methane, ultrapure, 99,9%</td>
			<td>AlfaAesar</td>
			<td>J65594</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100, 98%</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>327371000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea G.R.</td>
			<td>lach:ner</td>
			<td>40096-AP0</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ribo-seq in bacteria: a sample collection and library preparation protocol for ngs sequencing

טכניקת פרופיל הריבוזום (RIBO-seq) היא כיום הכלי היעיל ביותר לחקר תהליך סינתזת החלבון ב vivo. היתרון של שיטה זו, בהשוואה לגישות אחרות, הוא היכולת שלה לפקח על התרגום על ידי מיפוי מדויק של המיקום ומספר הריבוזומים בתעתיק mRNA.
במאמר זה אנו מתארים את השלבים העוקבים של איסוף והכנה לדוגמה לשיטת RIBO-seq בחיידקים, ומדגישים את הפרטים הרלוונטיים לתכנון וביצוע הניסוי.
מאז RIBO-seq מסתמך על ריבוזומים שלמים mRNAs הקשורים, הצעד העיקרי הוא עיכוב מהיר של תרגום התפוררות נאותה של תאים. לכן, אנו מציעים סינון והקפאת פלאש בחנקן נוזלי לקצירת תאים עם טיפול מקדים אופציונלי עם כלוראמפניקול כדי לעצור תרגום בחיידקים. להתפוררות, אנו מציעים שחיקה תאים קפואים עם מרגמה ועלי בנוכחות תחמוצת אלומיניום כדי לשבש מכנית את דופן התא. בפרוטוקול זה, כרית סוכרוז או שיפוע סוכרוז ultracentrifugation עבור טיהור מונוזום אינו נדרש. במקום זאת, הפרדת mRNA באמצעות אלקטרופורזה ג'ל פוליאקרילמיד (PAGE) ואחריו כריתת טביעת הרגל ריבוזומלית (28-30 nt הלהקה) מוחל ומספק תוצאות משביעות רצון. פעולה זו מפשטת במידה רבה את השיטה וכן מפחיתה את דרישות הזמן והציוד עבור ההליך. להכנת הספרייה, אנו ממליצים להשתמש בערכת RNA קטנה הזמינה מסחרית לריצוף Illumina מניו אינגלנד Biolabs, בהתאם להנחיות היצרן עם מידה מסוימת של אופטימיזציה.
ספריות ה- cDNA המתקבלות מציגות כמות ואיכות מתאימות הנדרשות לריצוף הדור הבא (NGS). רצף הספריות שהוכנו על פי תוצאות הפרוטוקול המתוארות ב 2 עד 10 mln קריאות ממופה באופן ייחודי לכל מדגם מתן נתונים מספיקים לניתוח ביואינפורמטי מקיף. הפרוטוקול שאנו מציגים מהיר וקל יחסית וניתן לבצעו באמצעות ציוד מעבדה סטנדרטי.

התוצאות המופתיות שהוצגו כאן התקבלו במחקר שבחן את ויסות התרגום בתאי הסאבטיליס של WT Bacillus. תרבויות לילה היו מדולל OD600 שווה 0.1 ב 100 מ"ל של בינוני עשיר דגירה ב 37 °C (600) עם רעידות נמרצות עד OD600 הגיע 0.5-0.6. המדיום העשיר הוחלף אז במדיום מינימלי כדי לגרום לתהליך ההצטברות והדגירה נמשכה עד ...

Watch this Scientific Journal Video about RIBO-seq in Bacteria: a Sample Collection and Library Preparation Protocol for NGS Sequencing at JoVE.com

RIBO-seq in Bacteria: a Sample Collection and Library Preparation Protocol for NGS Sequencing

כאן אנו מתארים את שלבי איסוף המדגם והכנת RIBO-seq בחיידקים. רצף הספריות שהוכנו על פי הנחיות אלה מביא לנתונים מספיקים לניתוח ביואינפורמטי מקיף. הפרוטוקול שאנו מציגים הוא פשוט, משתמש בציוד מעבדה סטנדרטי ולוקח שבעה ימים מן התזה להשגת ספריות.

RIBO-seq בחיידקים: אוסף לדוגמה ופרוטוקול הכנת ספריה לריצוף NGS

The ribosome profiling technique (RIBO-seq) is currently the most effective tool for studying the process of protein synthesis in vivo. The advantage of ...

טכניקת פרופיל הריבוזום, הנקראת גם RIBO-seq, היא כיום הכלי היעיל ביותר לחקר תהליך סינתזת החלבון ב- vivo. היתרון של שיטה זו הוא היכולת שלה לפקח על התרגום על ידי מיפוי מדויק של המיקום ומספר הריבוזומים. RIBO-seq מבוסס על העובדה כי הריבוזום, על ידי קשירה למולקולת mRNA, מגן על השבר הקבור של התמליל על עיכול ריבונוקלאאז.ניתן לרצף את השברים שהושגו, הנקראים עקבות ריבוזומליות, על גבי התמליל שממנו הגיעו, וכתוצאה מכך לקבוע את המיקום המדויק של הריבוזומים. במקביל ל- RIBO-seq, רצף mRNA כולל בעל תפוקה גבוהה מבוצע כדי לספק נקודת התייחסות ולאפשר השוואת נתונים הן מ- RIBO-seq והן מ- RNA-seq במהלך ניתוח נתונים. לפני קצירת תאים, אתה יכול אופציונלי להוסיף כלוראמפניקול לתרבות החיידקים, לריכוז הסופי של 100 מיקרוגרם למיליליטר, כדי לעכב את התרגום.דגירה את התרבות עם אנטיביוטיקה במשך דקה אחת. שלב זה חשוב אם הקציר לוקח יותר זמן מהרגיל, כמו עיכוב תרגום מאפשר להאריך את זמן איסוף מדגם. לאסוף את הדגימות עם מערכת סינון מחומם מראש.אתה יכול להציג רעידות על מנת לחקות את תנאי הצמיחה. הפסק לסנן כאשר כל המדיה עברה דרך הממברנה, אך אל תאפשר למסנן להתייבש לחלוטין. לאסוף כדורי חיידקים על ידי גירוד מהיר את התאים של דיסק המסנן באמצעות מראש מחומם, חיטוי scoopula.מיד למקם את הסקופולה כולה עם התאים שנקטפו בצינור 50 מיליליטר מלא חנקן נוזלי. גלולה שנקטפו צריך להיות מכוסה לחלוטין חנקן נוזלי. תן גלולה להקפיא ביסודיות, ולעקור תאים קפואים באמצעות scoopula מקורר בעבר.סגור את המכסה, וודא שהוא מנוקב. זה חשוב, כמו חנקן נוזלי יכול לגרום מיכלים סגורים להתפוצץ עקב שינוי הלחץ על אידוי. הכינו GMPP, ספוגית דנ"א וצינורות אפנדורף טריים המוקדשים לליסאז.הכן מאגר תמוגה עם תוספת של כלוראמפניקול במידת הצורך. להקצות 500 מיקרוליטרים של מאגר תמוגה לכל מדגם לתוך צינורות Eppendorf נפרדים, ומניחים אותם על קרח. נטרף מרגמה ועלי עם חיטוי מעבדה ו-70% אתנול.מצננים מרגמה ועלי על ידי שפיכת חנקן נוזלי לתוך המרגמה. מעבירים את גלולת החיידקים הקפואים למרגמה צוננת מראש וטוחנים אותה לאבקה. מוסיפים כנפח אחד של תחמוצת אלומיניום וממשיכים לטחון.שמור מרגמה, עלה, ואת התאים להתקרר על ידי שפיכת חנקן נוזלי בעת הצורך, לא לתת את התוכן של מרגמה להפשיר. ממש לפני השימוש, להוסיף GMPPNP ו DNA ספוגית לתוך aliquot מאגר תמוגה. מעבירים את הפתרון למרגמה וממשיכים לטחון.תן לליסאז להפשיר לאט תוך כדי שחיקה. כאשר הליסאז מפשיר לחלוטין, מעבירים את התערובת לצינור אפנדורף המצונן מראש וחוזרים לקרח. צנטריפוגה lysase ב 20, 0000 G במשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס.מעבירים את הסופרנטנטים לצינורות אפנדורף טריים ומצוננים מראש ומניחים אותם על קרח. למדוד את ריכוז RNA בכל מדגם מדולל עם NanoDrop. מחלקים כל lysate לשתי מנות, 0.5 עד 1 מיליגרם של RNA עבור RIBO-seq, והשאר עבור RNA-seq.למיליגרם אחד של ה-RNA, הוסיפו 3.8 מיקרוליטרים של MNase ב-Tris pH 8, ומעליו מאגר תמוגה לנפח הכולל של 500 מיקרוליטרים. דגירה ב 25 מעלות צלזיוס, 300 סיבובים לדקה, במשך 45 דקות. כאשר הדגירה מסתיימת, לנקות את הדגימות עם ערכת ניקוי RNA זמין מסחרית.הכינו 15% ג'ל TBE פוליאקרילמיד עם שמונה אוריאה טוחנת, והניחו אותו במיכל עם חיץ TBE. לרוץ מראש במשך מינימום של 10 דקות במתח קבוע של 200 וולט. מערבבים את הדגימות עם מאגר מדגם TBE-Urea.דנאטורה ב 95 מעלות צלזיוס לדקה אחת ומניחים אותם מיד על קרח. לשטוף את אוריאה על ידי הזרקת חיץ TBE לתוך בארות ג'ל באמצעות מזרק. לטעון את הדגימות, משאיר רווח באר אחד ביניהם כדי להפריד כל מדגם ולמנוע זיהום צולב.השתמשו באוליגו באורך 29 נוקלאוטידים, ובתערובת של אוליגו באורך 26 ו-32 נוקלאוטידים כסמנים. הפעל את האלקטרופורזה במתח קבוע של 180 וולט. הכינו חיץ סטרילי להדגרת לילה.לאחר שהאלקטרופורזה מסתיימת, הכתימו את הג'ל בזהב SYBR. בלו שברים של הג'ל בין 26 ל 32 נוקלאוטידים עם מחט סטרילית או סכין גילוח, ומניחים את שברי הג'ל בצינורות Eppendorf נפרדים. לשנות את המחט או סכין הגילוח בין הדגימות.הוסף 200 מיקרוליטרים של מאגר דגירה לילה לכל Eppendorf ולהדגיר את הדגימות ב 10 מעלות צלזיוס, 1000 סיבובים לדקה, לילה. למחרת, לנקות את הדגימות עם ערכת ניקוי RNA, ו elute אותם 18 microliters של מים ללא גרעינים. העקבות הריבוזומליות המתקבלות מוכנות להכנת הספרייה.בצע דלדול RNA ריבוזומלי עבור דגימות עבור RNA-seq באמצעות ערכה זמינה מסחרית. לאחר מכן, לנקות את הדגימות עם ערכת ניקוי RNA. בצע הידרוליזה אלקליין כדלקמן;להכין את מאגר הידרוליזה אלקליין, להוסיף נפח אחד של המאגר לנפח אחד של המדגם, ולהדגיר ב 95 מעלות צלזיוס במשך 25 דקות.הוסף חמישה microliters של 3 Molar נתרן אצטט pH 5.5 לכל מדגם על מנת לעצור את התגובה. נקו את הדגימות בערכת ניקוי רנ"א, ושחררו אותן ב-18 מיקרוליטרים של מים נטולי גרעין. RNA מקוטע באופן אקראי המתקבל מוכן להכנת הספרייה.הוסף 10 מיקרוליטרים של חיץ תגובה 10x וחמישה microliters של קינאז פולינוקלאוטידים T4 לכל מדגם. דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעה וחצי. לאחר מכן, להוסיף שלושה microliters של ATP מילימולאר אחד דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעה אחת.לאחר מכן, לנקות את הדגימות עם ערכת ניקוי RNA. בצע את הכנת הספרייה באמצעות הערכה המסחרית הזמינה, בהתאם לפרוטוקול המפורט כאן. בצע PAGE באמצעות ג'ל פוליאקרילמיד 6%."הכתים את הג'ל בזהב SYBR. Excise שברי ג'ל המכילים את הספריות. עבור דגימות RNA-seq, הספרייה היא בין 135 ל 180 נוקלאוטידים, ועבור RIBO-seq, בין 135 ל 170 נוקלאוטידים.השתמש מחטים סטריליות או סכיני גילוח ומניחים את שברי ג'ל מגורש בצינורות Eppendorf נפרדים. זכור לשנות את המחט או סכין הגילוח בין הדגימות. הוסיפו 100 מיקרוליטרים של מים נטולי גרעין לכל שבר ג'ל שנכרת.ותדגיר אותם ב-10 מעלות צלזיוס, 450 כדורים לדקה, בן לילה. למחרת, לנקות את הדגימות עם ערכת ניקוי DNA. הספריות המתקבלות מוכנות לבקרת איכות וכמות ברגישות גבוהה, אלקטרופורזה על שבב DNA, ולאחר מכן לריצוף הדור הבא.ספריות cDNA וכתוצאה מכך להציג כמות ואיכות מתאימים הנדרשים עבור רצף הדור הבא, כפי שאומת על ידי רגישות גבוהה, DNA על שבב אלקטרופורזה. הרצועות והפסגות המייצגות את ספריות RIBO-seq צרות ומוגדרות טוב יותר, בהשוואה לספריות RNA-seq. על פי האלקטרופורזה על השבב, לספריות יש את העדשה הצפויה.הפסגות הנוספות הקרובות יותר ל-200 זוגות בסיסים הנמצאים בספריות RIBO-seq עשויות להצביע על ריבוזומים של שנת חורף, לא על עקבות ריבוזומליות מתעכלות לחלוטין, או על ממצאים, לדוגמה, rRNA, וניתן למחוק אותם במהלך ניתוח ביואינפורמטי כאשר הנתונים המתקבלים מריסוק נחתכים ו- rRNA מסונן. הכמות הממוצעת של cDNA שנוצר בהכנת הספרייה היא 32 ננוגרם, מתן כמות מספקת של חומר הנדרש עבור רצף הדור הבא. לאחר בקרת איכות על ידי אלקטרופורזה על השבב, ספריות נמשכו לריצוף יחיד ו -50 זוגות בסיסים בפלטפורמת NextSeq 500 של אילומינה.קיצוץ המתאמים ורצפים באיכות ירודה הביא 25 עד 47 מיליון קריאות לכל מדגם עבור דגימות RNA-seq, ו 25 עד 50 מיליון קריאות לכל מדגם עבור דגימות RIBO-seq. הנתונים שהושגו היו בקרת איכות נבדקה עם FastQC. שתי דגימות RNA-seq ו RIBO-seq הציגו איכות טובה מאוד.מיפוי הספריות שהוכנו על פי הפרוטוקול המתואר הניב 2.4 עד 9.6 מיליון קריאות ממופה באופן ייחודי לכל מדגם לדגימות RNA-seq, ו-2.3 עד 10.4 מיליון קריאות ממופה באופן ייחודי עבור דגימות RIBO-seq. נתוני RIBO-seq מציגים מחזוריות משולשת ופסגה גבוהה וצרה, המתאימה לריבוזומים היוזמים ומאפיינים את עקבות הריבוזומה, שאינה נצפית בנתוני ה- RNA-seq. יתר על כן, העלילה המציגה את הפרופילים של כיסוי ממוצע של עקבות ריבוזומליות ושברי mRNA ברצפי הקידוד חושפת את השיעור הגבוה יותר של קריאות הממופות לתקליטורים בערכת הנתונים RIBO-seq, כצפוי.ההדמיה של עקבות הריבוזומליות הממופות הראתה דפוסים דומים מאוד בהשוואה לתוצאות שהתקבלו מאותו ניסוי שבוצע בהתאם להליך RIBO-seq הסטנדרטי, הכולל התאוששות מונוזום על ידי שיפוע סוכרוז אולטרה-צנטריפוגציה. הפרוטוקול שלנו שימש לבדיקת ויסות תרגום בתנאי צמיחה שונים, אך ניתן ליישמו כדי ללמוד היבטים אחרים של תרגום, כמו זיהוי אתרי ייזום תרגום וגנים חדשניים של קידוד חלבונים. רצף הספריות שהוכנו על פי ההנחיות שלנו מביא לנתונים מספיקים לניתוח ביואינפורמטי מקיף.הפרוטוקול שאנו מציגים כאן הוא מהיר, קל וחסכוני, וניתן לבצעו באמצעות ציוד מעבדה סטנדרטי.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

הכנת הדוגמא לזיהוי מבוססי ספקטרומטר מסה של RNA-איגוד אזורים

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

An All-in-one Sample Holder for Macromolecular X-ray Crystallography with Minimal Background Scattering

מחזיק מדגם All-in-one עבור קריסטלוגרפיה Macromolecular X-ray עם פיזור רקע מינימלי

Macromolecular X-ray crystallography (MX) is the most prominent method to obtain high-resolution three-dimensional knowledge of biological macromolecules. ...

A Plasma Sample Preparation for Mass Spectrometry using an Automated Workstation

הכנה לדגימת פלזמה לספקטרומטר מסה באמצעות תחנת עבודה אוטומטית

Sample preparation for mass spectrometry analysis in proteomics requires enzymatic cleavage of proteins into a peptide mixture. This process involves ...

Sample Preparation for Probe Electrospray Ionization Mass Spectrometry

הכנה לדוגמא לתרסיס אלקטרונון מהמוני ספקטרומטר מונמטריה

Mass spectrometry (MS) is a powerful tool in analytical chemistry because it provides very accurate information about molecules, such as mass-to-charge ...

TMT Sample Preparation for Proteomics Facility Submission and Subsequent Data Analysis

הכנה לדוגמא להגשת מתקנים פרוטאומניקס וניתוח נתונים שלאחר מכן

Proteomic technologies are powerful methodologies that can aid our understanding of mechanisms of action in biological systems by providing a global view ...

MS2-Affinity Purification Coupled with RNA Sequencing in Gram-Positive Bacteria

טיהור MS2-זיקה בשילוב עם רצף RNA בחיידקים גראם חיוביים

Although small regulatory RNAs (sRNAs) are widespread among the bacterial domain of life, the functions of many of them remain poorly characterized ...

NMR-Based Fragment Screening in a Minimum Sample but Maximum Automation Mode

סינון מקטעים מבוסס NMR במדגם מינימלי אך במצב אוטומציה מקסימלי

Fragment-based screening (FBS) is a well-validated and accepted concept within the drug discovery process both in academia and industry. The greatest ...

A Sample Preparation Pipeline for Microcrystals at the VMXm Beamline

צינור הכנה לדוגמה עבור מיקרוקריסטלים בקו הקרן VMXm

The mounting of microcrystals (&#60;10 &#181;m) for single crystal cryo-crystallography presents a non-trivial challenge. Improvements in data quality ...

Sample Preparation and Transfer Protocol for In-Vacuum Long-Wavelength Crystallography on Beamline I23 at Diamond Light Source

פרוטוקול הכנה והעברה לדוגמה לקריסטלוגרפיה באורך גל ארוך בוואקום בקו קרן I23 במקור אור יהלום

Long-wavelength macromolecular crystallography (MX) exploits the anomalous scattering properties of elements, such as sulfur, phosphorus, potassium, ...

Preparation of High-Temperature Sample Grids for Cryo-EM

הכנת רשתות דגימה בטמפרטורה גבוהה עבור Cryo-EM

The sample grids for cryo-electron microscopy (cryo-EM) experiments are usually prepared at a temperature optimal for the storage of biological samples, ...