Name: ribo-seq in bacteria: a sample collection and library preparation protocol for ngs sequencing
Uploaded: 2021-08-07T14:00:00
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एएलएस एम्बो इंस्टॉलेशन ग्रांट आईजी 3914 और पीओआईआर की वित्तीय सहायता को स्वीकार करना चाहेगा। 04.04.00-00-3E9C/17-00 यूरोपीय क्षेत्रीय विकास कोष के तहत यूरोपीय संघ द्वारा सह-वित्तपोषित पोलिश विज्ञान के लिए फाउंडेशन की पहली टीम कार्यक्रम के भीतर किया गया ।

1. नमूना संग्रह
<ol><li>एक बैक्टीरियल कल्चर तैयार करें। हम प्रति नमूना 100 एमएल की संस्कृति की मात्रा की सलाहते हैं।</li>
	<li>नमूना संग्रह के लिए उपकरण और अभिकर्मक तैयार करें: प्रति नमूना दो स्कूपुला, बाँझ 0.45 माइक्?...

राइबोसोम प्रोफाइलिंग की प्रमुख तकनीकी चुनौती एक विशेष शारीरिक स्थिति में mRNAs पर राइबोसोम्स के स्नैपशॉट पर कब्जा करने के लिए तेजी से अनुवाद को बाधित करने की आवश्यकता है। इसे पूरा करने के लिए, अनुवाद अवर?...

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10X TBE (powder)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9864</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol, 99%, pure</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>125472500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine 5&#39;-Triphosphate (ATP)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>P0756S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminium oxide calcinated pure p.a.</td>
			<td>Chempur</td>
			<td>114560600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride dihydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C3881-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>190321</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA Clean &#38; Concentrator -5</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>D4004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dnase I recombinant, Rnase-free</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4716728001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA disodium salt</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>E/P140/48</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl Alcohol Absolut 99,8%&#160; Pure-P.A.-Basic</td>
			<td>POCH Avantor Performance Materials Poland S.A</td>
			<td>BA6480111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filtration apparatus</td>
			<td>VWR Collection</td>
			<td>511-0265</td>
			<td>all-glass filtration apparatus, with funnel, fritted base, cap, 47 mm &#216; spring clamp and ground joint flask</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel 40 (19:1)</td>
			<td>Rotiphorese</td>
			<td>3030.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel Loading Dye, Blue, 6X</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E6138G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guanosine 5&#8242;-[&#946;,&#947;-imido]triphosphate trisodium salt hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G0635-25MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>labZAP</td>
			<td>A&#38;A Biotechnology</td>
			<td>040-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium acetate tetrahydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M5661-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MCE membrane fiter</td>
			<td>Alfatec Technology</td>
			<td>M47MCE45GWS</td>
			<td>pore size: 0.45um</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MICROBExpress Bacterial mRNA Purification</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM1905</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiplex Small RNA Library Prep Set for Illumina</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E7300S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-Free Water</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9937</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Acetate Anhydrous Pure P.A.</td>
			<td>POCH Avantor Performance Materials Poland S.A</td>
			<td>744330113</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quick-Load pBR322 DNA-MspI Digest</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E7323A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA Clean &#38; Concentrator -25</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>R1018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2889-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium carbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>223530-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydrogen carbonate pure p.a.</td>
			<td>POCH Avantor Performance Materials Poland S.A</td>
			<td>810530115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR Gold nucleic acid gel stain</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>S11494</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 Polynucleotide Kinase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0201L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 Polynucleotide Kinase Reaction Buffer</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B0201S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBE-Urea Sample Buffer (2x)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>LC6876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris(hydroxymethyl)amino-methane, ultrapure, 99,9%</td>
			<td>AlfaAesar</td>
			<td>J65594</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100, 98%</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>327371000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea G.R.</td>
			<td>lach:ner</td>
			<td>40096-AP0</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ribo-seq in bacteria: a sample collection and library preparation protocol for ngs sequencing

राइबोसोम प्रोफाइलिंग तकनीक (RIBO-seq) वर्तमान में वीवो मेंप्रोटीन संश्लेषण की प्रक्रिया का अध्ययन करने के लिए सबसे प्रभावी उपकरण है। इस विधि का लाभ, अन्य दृष्टिकोणों की तुलना में, एमआरएनए ट्रांसक्रिप्ट पर राइबोसोम्स की स्थिति और संख्या को ठीक से मैप करके अनुवाद की निगरानी करने की क्षमता है।
इस लेख में, हम नमूना संग्रह के लगातार चरणों और बैक्टीरिया में RIBO-seq विधि के लिए तैयारी का वर्णन करते हैं, जो प्रयोग की योजना और निष्पादन के लिए प्रासंगिक विवरणों को उजागर करते हैं।
चूंकि RIBO-seq बरकरार राइबोसोम्स और संबंधित mRNAs पर निर्भर करता है, महत्वपूर्ण कदम अनुवाद और कोशिकाओं के पर्याप्त विघटन के तेजी से अवरोध है । इस प्रकार, हम बैक्टीरिया में अनुवाद को रोकने के लिए क्लोरम्फेनिकोल के साथ एक वैकल्पिक पूर्वउपचार के साथ सेल हार्वेस्टिंग के लिए तरल नाइट्रोजन में छानने और फ्लैश-फ्रीजिंग का सुझाव देते हैं। विघटन के लिए, हम यांत्रिक रूप से सेल की दीवार को बाधित करने के लिए एल्यूमीनियम ऑक्साइड की उपस्थिति में मोर्टार और मूसल के साथ जमे हुए कोशिकाओं को पीसने का प्रस्ताव करते हैं। इस प्रोटोकॉल में, मोनोसोम शुद्धिकरण के लिए सुक्रोज कुशन या सुक्रोज रेडिएंट अल्ट्रासेंट्रफ्यूजन की आवश्यकता नहीं है। इसके बजाय, पॉलीएक्रीलैमाइड जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस (पेज) का उपयोग करके एमआरएनए सेपरेशन लागू किया जाता है और इसके बाद राइबोसोमल पदचिह्न एक्ससेशन (28-30 एनटी बैंड) लागू होता है और संतोषजनक परिणाम प्रदान करता है। यह काफी हद तक विधि को सरल बनाता है और साथ ही प्रक्रिया के लिए समय और उपकरण आवश्यकताओं को कम करता है। पुस्तकालय की तैयारी के लिए, हम कुछ हद तक अनुकूलन के साथ निर्माता के दिशानिर्देशों का पालन करते हुए न्यू इंग्लैंड बायोलैब्स से इलुमिना अनुक्रमण के लिए व्यावसायिक रूप से उपलब्ध छोटे आरएनए किट का उपयोग करने की सलाह देते हैं।
परिणामस्वरूप सीडीएनए पुस्तकालयों उचित मात्रा और अगली पीढ़ी अनुक्रमण (NGS) के लिए आवश्यक गुणवत्ता मौजूद हैं । 2 से 10 एमएलएन विशिष्ट रूप से मैप किए गए नमूने में वर्णित प्रोटोकॉल परिणामों के अनुसार तैयार पुस्तकालयों की अनुक्रमण व्यापक जैव सूचनात्मक विश्लेषण के लिए पर्याप्त डेटा प्रदान करने वाले प्रति नमूने को पढ़ता है। प्रोटोकॉल हम मौजूद है जल्दी और अपेक्षाकृत आसान है और मानक प्रयोगशाला उपकरणों के साथ किया जा सकता है ।

यहां प्रस्तुत अनुकरणीय परिणाम डब्ल्यूटी बैसिलस सबटिलिस कोशिकाओं में अनुवाद विनियमन की जांच करने वाले अध्ययन में प्राप्त किए गए थे । रातोंरात संस्कृतियों को अमीर माध्यम के१०० मिलीएल में ०.१ क...

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RIBO-seq in Bacteria: a Sample Collection and Library Preparation Protocol for NGS Sequencing

यहां हम बैक्टीरिया में रिबो-सेक्यू के लिए नमूना संग्रह और तैयारी के चरणों का वर्णन करते हैं। इन दिशा-निर्देशों के अनुसार तैयार पुस्तकालयों के अनुक्रमण के परिणामस्वरूप व्यापक जैव सूचना विश्लेषण के लिए पर्याप्त डेटा होता है । प्रोटोकॉल हम मौजूद सरल है, मानक प्रयोगशाला उपकरण का उपयोग करता है और पुस्तकालयों को प्राप्त करने के लिए लाइसिस से सात दिन लगते हैं ।

बैक्टीरिया में RIBO-seq: NGS अनुक्रमण के लिए एक नमूना संग्रह और पुस्तकालय तैयारी प्रोटोकॉल

The ribosome profiling technique (RIBO-seq) is currently the most effective tool for studying the process of protein synthesis in vivo. The advantage of ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

आरएनए-बाइंडिंग क्षेत्रों की सामूहिक स्पेक्ट्रोमेट्री-आधारित पहचान के लिए नमूना तैयारी

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

An All-in-one Sample Holder for Macromolecular X-ray Crystallography with Minimal Background Scattering

न्यूनतम पृष्ठभूमि स्कैटिंग के साथ मैक्रोआण्विक एक्स-रे क्रिस्टलोग्राफी के लिए एक ऑल-इन-वन नमूना धारक

Macromolecular X-ray crystallography (MX) is the most prominent method to obtain high-resolution three-dimensional knowledge of biological macromolecules. ...

A Plasma Sample Preparation for Mass Spectrometry using an Automated Workstation

एक स्वचालित वर्कस्टेशन का उपयोग करके मास स्पेक्ट्रोमेट्री के लिए प्लाज्मा नमूना तैयारी

Sample preparation for mass spectrometry analysis in proteomics requires enzymatic cleavage of proteins into a peptide mixture. This process involves ...

Sample Preparation for Probe Electrospray Ionization Mass Spectrometry

जांच इलेक्ट्रोस्प्रे आयनीकरण मास स्पेक्ट्रोमेट्री के लिए नमूना तैयारी

Mass spectrometry (MS) is a powerful tool in analytical chemistry because it provides very accurate information about molecules, such as mass-to-charge ...

TMT Sample Preparation for Proteomics Facility Submission and Subsequent Data Analysis

प्रोटेओमिक्स सुविधा सबमिशन और बाद के डेटा विश्लेषण के लिए टीएमटी नमूना तैयारी

Proteomic technologies are powerful methodologies that can aid our understanding of mechanisms of action in biological systems by providing a global view ...

MS2-Affinity Purification Coupled with RNA Sequencing in Gram-Positive Bacteria

एमएस 2-आत्मीयता शुद्धि ग्राम-सकारात्मक बैक्टीरिया में आरएनए अनुक्रमण के साथ मिलकर

Although small regulatory RNAs (sRNAs) are widespread among the bacterial domain of life, the functions of many of them remain poorly characterized ...

NMR-Based Fragment Screening in a Minimum Sample but Maximum Automation Mode

न्यूनतम नमूना लेकिन अधिकतम स्वचालन मोड में एनएमआर-आधारित टुकड़ा स्क्रीनिंग

Fragment-based screening (FBS) is a well-validated and accepted concept within the drug discovery process both in academia and industry. The greatest ...

A Sample Preparation Pipeline for Microcrystals at the VMXm Beamline

वीएमएक्सएम बीमलाइन में माइक्रोक्रिस्टल के लिए एक नमूना तैयारी पाइपलाइन

The mounting of microcrystals (&#60;10 &#181;m) for single crystal cryo-crystallography presents a non-trivial challenge. Improvements in data quality ...

Sample Preparation and Transfer Protocol for In-Vacuum Long-Wavelength Crystallography on Beamline I23 at Diamond Light Source

डायमंड लाइट स्रोत पर बीमलाइन I23 पर इन-वैक्यूम लंबी तरंग दैर्ध्य क्रिस्टलोग्राफी के लिए नमूना तैयारी और स्थानांतरण प्रोटोकॉल

Long-wavelength macromolecular crystallography (MX) exploits the anomalous scattering properties of elements, such as sulfur, phosphorus, potassium, ...

Preparation of High-Temperature Sample Grids for Cryo-EM

क्रायो-ईएम के लिए उच्च तापमान नमूना ग्रिड की तैयारी

The sample grids for cryo-electron microscopy (cryo-EM) experiments are usually prepared at a temperature optimal for the storage of biological samples, ...