Name: ribo-seq in bacteria: a sample collection and library preparation protocol for ngs sequencing
Uploaded: 2021-08-07T14:00:00
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ALS desidera riconoscere il sostegno finanziario delle sovvenzioni per l'installazione EMBO IG 3914 e POIR. 04.04.00-00-3E9C/17-00 realizzato nell'ambito del programma First TEAM della Fondazione per la scienza polacca cofinanziato dall'Unione europea nell'ambito del Fondo europeo di sviluppo regionale.

1. Raccolta dei campioni
<ol><li>Preparare una coltura batterica. Si consiglia un volume di coltura di 100 mL per campione.</li>
	<li>Preparare attrezzature e reagenti per la raccolta dei campioni: due scoopula per campione, filtri sterili a membrana di cellulosa mista (MCE) da 0,45 μm, tubi sterili da 50 ml, azoto liquido, 50 mg/mL di cloramfenicolo nel 70% (vol/vol) di etanolo (facoltativo). Forare il coperchio di tubi da 50 ml per consentire l'evaporazione dell'azoto liquido e prevenire l'esplosione di tubi chiusi....

La sfida tecnica chiave della profilazione ribosoma è la necessità di inibire rapidamente la traduzione al fine di catturare un'istantanea dei ribosomi sugli mRNA in un particolare stato fisiologico di interesse. A tal fine, vengono comunemente utilizzati inibitori della traduzione, raccolta rapida e congelamento flash nell'azoto liquido. L'applicazione di antibiotici è facoltativa poiché possono causare artefatti. Il cloramfenicolo è un farmaco comunemente usato per arrestare i ribosomi allunganti nel ribo-seq batt...

La tecnica di profilazione ribosoma (RIBO-seq) è stata sviluppata nel laboratorio di Jonathan Weissman presso l'Università della California, San Francisco1. Rispetto ad altri metodi usati per studiare l'espressione genica a livello traslazionale, RIBO-seq si concentra su ogni legame ribosoma all'mRNA e fornisce informazioni sulla sua posizione e sul numero relativo di ribosomi su una trascrizione. Consente di monitorare il processo di sintesi proteica in vivo e può fornire una risoluzione e una precisione del codone singolo consentendo la misurazione della densità ribosoma su entrambi, il singolo mRNA e lungo l'intero trascrittame nella cellula. Alla base della tecnica RIBO-seq si trova il fatto che durante la traduzione il ribosoma lega la molecola di mRNA e quindi protegge il frammento sepolto della trascrizione da una digestione della ribonucleasi. Dopo l'aggiunta della ribonucleasi, l'mRNA non protetto viene digerito e i frammenti racchiusi da ribosomi - tipicamente lunghi ~28-30 nt - rimangono intatti. Questi frammenti, chiamati impronte ribosomiali (RF), possono quindi essere isolati, sequenziati e mappati sulla trascrizione da cui hanno avuto origine con conseguente rilevamento della posizione esatta dei ribosomi. Infatti, la capacità ribosoma di proteggere i frammenti di mRNA è stata utilizzata dagli anni '60 per studiare i siti di rilegatura ribosomiale e iniziazione alla traduzione (TIS)2,3,4. Tuttavia, con l'avanzamento della tecnologia di sequenziamento profondo, RIBO-seq è diventato un gold standard per il monitoraggio dellatraduzione 5 che, attraverso l'impegno ribosoma, può fornire informazioni a livello genomico sulla sintesi proteica6. La profilazione ribosoma ha colmato il divario tecnologico esistente tra la quantificazione del trascrittame e il proteoma6.
Per condurre la profilazione ribosoma è necessario ottenere il lisato cellulare dell'organismo che era cresciuto nelle condizioni studiate. Interrompere queste condizioni durante la raccolta e lalisi cellulare può fornire dati inaffidabili. Per evitare ciò, vengono comunemente utilizzati inibitori della traduzione, raccolta rapida e congelamento lampo nell'azoto liquido. Le cellule possono essere lisciviate mediante macinazione criogenica in un omogeneizzatore meccanico come un miscelatore7,8 o un battitore diperline 9e per triturazione attraverso una pipetta10 o con un ago11. Il tampone di lysis può essere aggiunto poco prima o poco dopo la polverizzazione delle cellule. Nel nostro protocollo utilizziamo azoto liquido per preraffreddare malta e pestello, così come l'ossido di alluminio come approccio più delicato all'interruzione della parete cellulare batterica, che impedisce la tosatura dell'RNA spesso riscontrata quando vengono applicati metodi come la sonificazione. Dopo la polverizzazione, aggiungiamo un tampone di lisi ghiacciata nel contenuto raffreddato della malta. La selezione di un buffer di lisi appropriato è importante per ottenere la migliore risoluzione delle impronte ribosomiali. Poiché la forza ionica influisce sia sulla dimensione RF che sulla precisione del fotogramma di lettura, si consiglia attualmente di utilizzare buffer di lisi con bassa forza ionica e capacità tampone, anche se sembra che la composizione tampone non influenzi l'occupazione ribosomiale su mRNA11,12. Componenti importanti del tampone di lisi sono gli ioni di magnesio, la cui presenza previene la dissociazione delle subunità ribosomiali e inibisce i cambiamenti conformazionali spontanei nei ribosomibatterici 11,13. Anche gli ioni di calcio svolgono un ruolo significativo e sono essenziali per l'attività della nucleasi micrococcica (MNasi) utilizzata nel metodo di profilazione ribosomabatterica 14. L'aggiunta di guanosina 5′-[β,γ-imido]trifosfato (GMP-PNP), un analogo non idrolabile di GTP, insieme al cloramfenicolo inibisce la traduzione durante la lisi15.
Quando il lisato viene ottenuto, viene chiarito per centrifugazione e diviso in due porzioni, ognuna per un RIBO-seq e un sequenziamento totale dell'mRNA ad alta produttività (RNA-seq) poiché vengono eseguite simultaneamente(Figura 1). RNA-seq fornisce un punto di riferimento che consente il confronto dei dati sia ribo-seq che RNA-seq durante l'analisi dei dati. Il translatoma studiato è definito dalla normalizzazione delle impronte ribosomiche all'abbondanza di mRNA16. I dati di RNA-seq possono anche aiutare a identificare la clonazione o sequenziare gliartefatti 17.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62544/62544fig01.jpg"> Figura 1. Schemi di preparazione del campione di mRNA per RIBO-seq e RNA-seq. Per la preparazione della libreria RIBO-seq, l'RNA viene digerito con MNasi (A), seguito dalla selezione delle dimensioni di RF di ~28-30 nt di lunghezza (B); per l'RNA RNA-seq è isolato (C), impoverito di rRNA (D), e l'mRNA risultante è frammentato casualmente in frammenti di varie lunghezze (E). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62544/62544fig01large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
I primi passi della procedura di preparazione del campione per RIBO-seq e RNA-seq differiscono leggermente (Figura 1). Per la profilazione ribosomiale, il lisato deve essere digerito da una specifica endonucleasi per degradare le molecole di mRNA non protette dai ribosomi. Nei protocolli standard, i monosomi ottenuti vengono recuperati da un cuscino di saccarosio ultracentrifugato o da un gradiente di saccarosio ultracentrifugazione8,14. In questo articolo, mostriamo che questo passaggio non è necessario per isolare RF richiesto per il RIBO-seq nei batteri, allo stesso modo per le cellule eucariotiche18e che la selezione delle dimensioni dei frammenti di mRNA di lunghezza appropriata dal gel di poliacrilammide è sufficiente.
Per l'RNA-seq, l'mRNA è ottenuto dall'esaurimento dell'rRNA dalle molecole totali di RNA - rRNA che si ibridano alle sonde oligonucleotidi biotinylate che si legano alle perline magnetiche rivestite di streptavidina. I complessi rRNA-oligonucleotide-perline vengono quindi rimossi dal campione con un magnete con conseguente campionamento impoverito di rRNA19,20. Le molecole di mRNA purificate vengono quindi frammentate casualmente per idrolisi alcalina. I frammenti ottenuti di mRNA e le impronte ribosomiali vengono convertiti in librerie cDNA e preparati per il sequenziamento profondo (Figura 2). Ciò comporta la riparazione delle estremità necessaria dopo l'idrolisi alcalina (per mRNA) e la digestione enzimatica (per RF): defosforilazione di 3' estremità seguita da fosforilazione di 5' estremità. I passaggi successivi sono la legatura degli adattatori e la trascrizione inversa per creare inserti cDNA incorniciati da sequenze necessarie per il sequenziamento di nuova generazione (NGS) utilizzando la piattaforma Illumina. L'ultima fase della preparazione della libreria è una reazione PCR in cui i costrutti vengono amplificati ed etichettati con codici a barre specifici del campione per consentire il multiplexing e il sequenziamento di vari campioni su un canale. Prima del sequenziamento, la qualità e la quantità delle librerie sono valutate dall'elettroforesi su chip del DNA ad alta sensibilità. Le librerie cDNA con parametri appropriati possono quindi essere raggruppate e sequenziate. Il sequenziamento può essere eseguito su diverse piattaforme Illumina, come MiSeq, NextSeq o HighSeq, a seconda del numero di librerie, della lunghezza di lettura e della profondità di sequenziamento richieste. Dopo il sequenziamento, viene eseguita l'analisi bioinformatica.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62544/62544fig02.jpg"> Figura 2. Preparazione della biblioteca. La preparazione della libreria include la riparazione delle estremità, la legatura degli adattatori, la trascrizione inversa e l'amplificazione con codifica a barre. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62544/62544fig02large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
La profilazione ribosoma è un metodo universale che può essere facilmente modificato e regolato in base alla questione scientifica. Originariamente è stato utilizzato nellievito 1,ma poco dopo è stato applicato alle cellulebatteriche 21 così come agli organismi modello eucariotico tra cui topo10,zebrafish22,mosca dellafrutta 23 e Arabidopsis thaliana24. È stato anche usato per studiare diversi tipi di ribosomi: citoplasmatico, mitocondriale25,26 e cloroplasto27,28. Negli eucarioti RIBO-seq è comunemente adattato e raffinato per indagare aspetti specifici della traduzione, tra cuiiniziazione 10,11,29,30,31,32,allungamento 1,10,11,31,33,ribosoma stallo33 e modifica conformazione33. La maggior parte delle modifiche comporta l'uso di diversi inibitori della traduzione. Nei batteri, tuttavia, studi analoghi sono stati difficili da condurre a causa della scarsità di inibitori con il meccanismo d'azionerichiesto 34. L'inibitore della traduzione più comunemente usato nei batteri è il cloramfenicolo (CAM) che si lega al centro peptidil transferasi (PTC) e impedisce il corretto posizionamento dell'amminoacil-tRNA nel sito A. Di conseguenza, CAM impedisce la formazione di un legame peptidico che porta ad arrestare i ribosomi allunganti35. Altri esempi di inibitori della traduzione nei batteri sono la tetraciclina (TET)36, la retapamulina (RET)34 e l'Onc11237 che sono stati utilizzati per studiare i siti di iniziazione alla traduzione. TET, che impedisce la consegna di tRNA al ribosoma sovrapponendosi direttamente con l'anello staminali anticodonte del tRNA nel sito A, è stato originariamente applicato per verificare i risultati ottenuti dal trattamento CAM poiché sono entrambi antibiotici che inibiscono l'allungamento dellatraslazione 38. Tet è stato trovato per rilevare tis primario, tuttavia non è stato in grado di rivelare tis36 interno. Il RET si lega nel PTC del ribosoma batterico e previene la formazione del primo legame peptidico interferendo con un aminoacil-tRNA allungatore nel sito A. L'applicazione del RET comporta l'arresto dei ribosomi sia al TISs34primario che a quello interno. Onc112, un peptide antimicrobico ricco di prolina, si lega nel tunnel di uscita e blocca il legame amminoacil-tRNA nel sito ribosomiale A. Di conseguenza, Onc112 impedisce ai complessi di iniziazione di entrare nella fase diallungamento 37.
La principale profilazione ribosoma delle informazioni fornisce la densità dei ribosomi e la loro posizione sull'mRNA. È stato applicato con successo per studiare l'espressione genica differenziale a livello di traduzione in varie condizioni dicrescita 1,6,misurare l'efficienza traslazionale1,38,39 e rilevare eventi di regolazione della traduzione come la pausa ribosomiale10. RIBO-seq consente inoltre di scoprire la traduzione di ncRNA annotato, pseudogeni e piccoli telai di lettura aperti senza preavviso (ORF) che portano all'identificazione di geni di codifica proteica nuovi e/o molto brevi10,12,22,30,37. In questi casi, RIBO-seq può perfezionare e migliorare l'annotazione del genoma. Con la sua elevata sensibilità per l'identificazione degli ORF tradotti e la sua natura quantitativa, la profilazione ribosoma può anche servire da proxy per la determinazione del proteoma o per aiutare gli studi di proteomica31,34,39. Mappando TIS, la profilazione ribosoma rivela isoforme estese e troncate N-terminale di proteinenote 10,32. RIBO-seq è stato anche adattato per studiare il ripiegamento co-traslazionaledelle proteine 14,21,24. Questo metodo consente di misurare i tassi diallungamento 1,10,39 o velocità di decodifica dei singolicodoni 6 e aiuta a sviluppare modelli quantitativi ditraduzione 17. Il metodo di profilazione ribosoma è anche in grado di fornire approfondimenti meccanicistici sulla pausa ribosoma neibatteri 7,15,17,frameshifting40,stop-codon readthrough21,difetti di terminazione /riciclaggio41,42 e modifiche alla conformazione ribosomiale33 negli eucarioti. RIBO-seq è stato anche adattato per esaminare l'impatto di specifici fattori trans-acting sulla traduzione come le miRNA6 e le proteine leganti l'RNA negli eucarioti16,43. Tuttavia, è importante riconoscere che il progetto sperimentale e la risoluzione ottenuta di RIBO-seq determinano la quantità di informazioni che possono essere estratte dai dati di sequenziamentorisultanti 12.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10X TBE (powder)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9864</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol, 99%, pure</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>125472500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine 5&#39;-Triphosphate (ATP)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>P0756S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminium oxide calcinated pure p.a.</td>
			<td>Chempur</td>
			<td>114560600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride dihydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C3881-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>190321</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA Clean &#38; Concentrator -5</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>D4004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dnase I recombinant, Rnase-free</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4716728001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA disodium salt</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>E/P140/48</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl Alcohol Absolut 99,8%&#160; Pure-P.A.-Basic</td>
			<td>POCH Avantor Performance Materials Poland S.A</td>
			<td>BA6480111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filtration apparatus</td>
			<td>VWR Collection</td>
			<td>511-0265</td>
			<td>all-glass filtration apparatus, with funnel, fritted base, cap, 47 mm &#216; spring clamp and ground joint flask</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel 40 (19:1)</td>
			<td>Rotiphorese</td>
			<td>3030.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel Loading Dye, Blue, 6X</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E6138G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guanosine 5&#8242;-[&#946;,&#947;-imido]triphosphate trisodium salt hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G0635-25MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>labZAP</td>
			<td>A&#38;A Biotechnology</td>
			<td>040-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium acetate tetrahydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M5661-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MCE membrane fiter</td>
			<td>Alfatec Technology</td>
			<td>M47MCE45GWS</td>
			<td>pore size: 0.45um</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MICROBExpress Bacterial mRNA Purification</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM1905</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiplex Small RNA Library Prep Set for Illumina</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E7300S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-Free Water</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9937</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Acetate Anhydrous Pure P.A.</td>
			<td>POCH Avantor Performance Materials Poland S.A</td>
			<td>744330113</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quick-Load pBR322 DNA-MspI Digest</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E7323A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA Clean &#38; Concentrator -25</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>R1018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2889-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium carbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>223530-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydrogen carbonate pure p.a.</td>
			<td>POCH Avantor Performance Materials Poland S.A</td>
			<td>810530115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR Gold nucleic acid gel stain</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>S11494</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 Polynucleotide Kinase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0201L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 Polynucleotide Kinase Reaction Buffer</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B0201S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBE-Urea Sample Buffer (2x)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>LC6876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris(hydroxymethyl)amino-methane, ultrapure, 99,9%</td>
			<td>AlfaAesar</td>
			<td>J65594</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100, 98%</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>327371000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea G.R.</td>
			<td>lach:ner</td>
			<td>40096-AP0</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ribo-seq in bacteria: a sample collection and library preparation protocol for ngs sequencing

La tecnica di profilazione ribosoma (RIBO-seq) è attualmente lo strumento più efficace per studiare il processo di sintesi proteica in vivo. Il vantaggio di questo metodo, rispetto ad altri approcci, è la sua capacità di monitorare la traduzione mappando con precisione la posizione e il numero di ribosomi su una trascrizione di mRNA.
In questo articolo, descriviamo le fasi consecutive della raccolta e della preparazione dei campioni per il metodo RIBO-seq nei batteri, evidenziando i dettagli rilevanti per la pianificazione e l'esecuzione dell'esperimento.
Poiché il RIBO-seq si basa su ribosomi intatti e mRNA correlati, il passo chiave è la rapida inibizione della traduzione e un'adeguata disintegrazione delle cellule. Pertanto, suggeriamo la filtrazione e il congelamento flash nell'azoto liquido per la raccolta cellulare con un pretrattamento opzionale con cloramfenicolo per arrestare la traduzione nei batteri. Per la disintegrazione, proponiamo la macinazione di cellule congelate con malta e pestello in presenza di ossido di alluminio per interrompere meccanicamente la parete cellulare. In questo protocollo non è richiesto un cuscino di saccarosio o un ultracentrifugazione gradiente di saccarosio per la purificazione monosomatica. Invece, viene applicata la separazione dell'mRNA utilizzando l'elettroforesi del gel di poliacrilammide (PAGE) seguita dall'escissione dell'impronta ribosomiale (banda 28-30 nt) e fornisce risultati soddisfacenti. Ciò semplifica in gran parte il metodo e riduce i tempi e i requisiti delle apparecchiature per la procedura. Per la preparazione della biblioteca, si consiglia di utilizzare il piccolo kit di RNA disponibile in commercio per il sequenziamento Illumina da New England Biolabs, seguendo le linee guida del produttore con un certo grado di ottimizzazione.
Le librerie cDNA risultanti presentano la quantità e la qualità appropriate necessarie per il sequenziamento di nuova generazione (NGS). Il sequenziamento delle librerie preparate secondo il protocollo descritto comporta da 2 a 10 mln letture mappate in modo univoco per campione fornendo dati sufficienti per un'analisi bioinformatica completa. Il protocollo che presentiamo è rapido e relativamente semplice e può essere eseguito con apparecchiature di laboratorio standard.

I risultati esemplari qui presentati sono stati ottenuti in uno studio che esamina la regolazione della traduzione nelle cellule subtili sporulate di Bacillus bacillus. Le colture notturne sono state diluite in OD600 pari a 0,1 in 100 mL di mezzo ricco e incubate a 37 °C con scuotimenti vigorosi fino a quando L'OD600 ha raggiunto 0,5-0,6. Il ricco mezzo è stato quindi sostituito con un mezzo minimo per indurre il processo di sporulazione e l'incubazione è stata continuata per un massimo ...

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RIBO-seq in Bacteria: a Sample Collection and Library Preparation Protocol for NGS Sequencing

Qui descriviamo le fasi di raccolta e preparazione dei campioni per RIBO-seq nei batteri. Il sequenziamento delle biblioteche elaborate secondo queste linee guida si traduce in dati sufficienti per un'analisi bioinformatica completa. Il protocollo che presentiamo è semplice, utilizza attrezzature di laboratorio standard e richiede sette giorni dalla lisi all'ottenimento delle biblioteche.

RIBO-seq in Bacteria: un protocollo di raccolta dei campioni e preparazione della biblioteca per il sequenziamento NGS

The ribosome profiling technique (RIBO-seq) is currently the most effective tool for studying the process of protein synthesis in vivo. The advantage of ...

La tecnica di profilazione ribosoma, chiamata anche RIBO-seq, è attualmente lo strumento più efficace per studiare il processo di sintesi proteica in vivo. Il vantaggio di questo metodo è la sua capacità di monitorare la traduzione mappando con precisione la posizione e il numero di ribosomi. RIBO-seq si basa sul fatto che il ribosoma, legando alla molecola di mRNA, protegge il frammento sepolto della trascrizione sulla digestione della ribonucleasi.I frammenti ottenuti, chiamati impronte ribosomiali, possono essere sequenziati e mappati sulla trascrizione da cui hanno avuto origine, determinando l'esatta posizione dei ribosomi. Contemporaneamente al RIBO-seq, viene eseguito il sequenziamento totale dell'mRNA ad alta velocità effettiva per fornire un punto di riferimento e consentire il confronto dei dati sia da RIBO-seq che da RNA-seq durante l'analisi dei dati. Prima della raccolta delle cellule, è possibile aggiungere facoltativamente il cloramfenicolo alla coltura batterica, alla concentrazione finale di 100 microgrammi per millilitro, per inibire la traduzione.Incubare la coltura con l'antibiotico per un minuto. Questo passaggio è importante se la raccolta richiede più tempo del solito, poiché l'inibizione della traduzione consente di prolungare il tempo di raccolta del campione. Raccogliere i campioni con un sistema di filtrazione prerifapidito.È possibile introdurre lo scuotimento per imitare le condizioni di crescita. Interrompere il filtraggio quando tutti i supporti sono passati attraverso la membrana, ma non lasciare asciugare completamente il filtro. Raccogliere pellet batterici raschiando rapidamente le cellule dal disco filtrante utilizzando una scoopula preri warmed e disinfettata.Posizionare immediatamente l'intera scoopula con le cellule raccolte in un tubo da 50 millilitri riempito con azoto liquido. Il pellet raccolto deve essere completamente ricoperto di azoto liquido. Lasciare congelare accuratamente il pellet e spodedare le cellule congelate utilizzando una scoopula precedentemente raffreddata.Chiudere il coperchio e assicurarsi che sia perforato. Questo è importante, poiché l'azoto liquido può causare l'esplosione di contenitori chiusi a causa del cambiamento di pressione all'evaporazione. Preparare tubi GMPP, DNA e Eppendorf freschi dedicati alla llysase.Preparare il tampone di lysis con l'aggiunta di cloramfenicolo, se necessario. Assegnare 500 microlitri di tampone di lisi per campione in tubi Eppendorf separati e metterli sul ghiaccio. Mortaio decontaminato e pestello con disinfettante da laboratorio e 70% di etanolo.Raffreddare malta e pestello versando azoto liquido nella malta. Trasferire il pellet batterico congelato in una malta prerimente refrigerata e macinarlo in polvere. Aggiungere circa un volume di ossido di alluminio e continuare la macinazione.Mantenere malta, pestello e le cellule raffreddare versando azoto liquido quando necessario, per non lasciare che il contenuto della malta si scongeli. Poco prima dell'uso, aggiungere GMPPNP e tampone di DNA nell'aliquota del tampone di lisi. Trasferire la soluzione nella malta e continuare la rettifica.Lasciare che la llysase si scongeli lentamente durante la macinazione. Quando la llysase si scongela completamente, trasferire la miscela nel tubo Eppendorf pre-refrigerato e tornare sul ghiaccio. Centrifuga la lisasi a 20.0000 G per cinque minuti a quattro gradi Celsius.Trasferire i supernatanti in tubi Eppendorf freschi e pre-refrigerati e metterli sul ghiaccio. Misurare la concentrazione di RNA in ogni campione diluito con NanoDrop. Dividere ogni lisato in due porzioni, da 0,5 a 1 milligrammo di RNA per RIBO-seq e il resto per RNA-seq.A un milligrammo dell'RNA, aggiungere 3,8 microlitri di MNasi in Tris pH 8 e completarlo con tampone di lysis al volume totale di 500 microlitri. Incubare a 25 gradi Celsius, 300 colpi al minuto, per 45 minuti. Al termine dell'incubazione, pulire i campioni con un kit di pulizia dell'RNA disponibile in commercio.Preparare il gel TBE poliacrilammide al 15% con otto urea molare e posizionare in un serbatoio con tampone TBE. Pre-eseguire per un minimo di 10 minuti ad una tensione costante di 200 volt. Mescolare i campioni con il buffer di esempio TBE-Urea.Denaturare a 95 gradi Celsius per un minuto e metterli immediatamente sul ghiaccio. Lavare l'urea iniettando il tampone TBE in pozzi di gel usando una siringa. Caricare i campioni, lasciando uno spazio ben tra di loro per separare ogni campione e prevenire la contaminazione incrociata.Usa 29 oligo lunghi 29 nucleotidi e un mix di oligo lunghi 26 e 32 nucleotidi come marcatori. Eseguire l'elettroforesi ad una tensione costante di 180 volt. Preparare tampone sterile per l'incubazione notturna.Una volta terminata l'elettroforesi, macchiare il gel con SYBR Gold. Asportare frammenti del gel tra 26 e 32 nucleotidi con un ago sterile o una lama di rasoio, e posizionare i frammenti di gel in tubi Eppendorf separati. Cambiare l'ago o la lama del rasoio tra i campioni.Aggiungere 200 microlitri di tampone di incubazione notturno a ogni Eppendorf e incubare i campioni a 10 gradi Celsius, 1000 colpi al minuto, durante la notte. Il giorno dopo, pulire i campioni con il kit di pulizia dell'RNA ed eluirli in 18 microlitri di acqua priva di nucleasi. Le impronte ribosomiali ottenute sono pronte per la preparazione della biblioteca.Eseguire l'esaurimento dell'RNA ribosomiale per campioni per RNA-seq utilizzando un kit disponibile in commercio. Quindi, pulire i campioni con il kit di pulizia dell'RNA. Eseguire l'idrolisi alcalina come segue;preparare il tampone di idrolisi alcalina, aggiungere un volume del tampone a un volume del campione e incubare a 95 gradi Celsius per 25 minuti.Aggiungere cinque microlitri di 3 molare acetato di sodio pH 5,5 a ciascun campione per interrompere la reazione. Pulire i campioni con kit di pulizia dell'RNA ed eluirli in 18 microlitri di acqua priva di nucleasi. L'RNA frammentato casualmente ottenuto è pronto per la preparazione della libreria.Aggiungere 10 microlitri di tampone di reazione 10x e cinque microlitri di polinucleotidi chinasi T4 a ciascun campione. Incubare a 37 gradi Celsius per un'ora e mezza. Dopo questo tempo, aggiungere tre microlitri di un ATP millimolare e incubare a 37 gradi Celsius per un'ora.Quindi, pulire i campioni con il kit di pulizia dell'RNA. Eseguire la preparazione della biblioteca utilizzando il kit disponibile in commercio, secondo il protocollo qui fornito. Eseguire PAGE utilizzando il gel di poliacrilammide al 6%.Macchiare il gel con SYBR Gold. Frammenti di gel di accisa contenenti le biblioteche. Per i campioni di RNA-seq, la libreria è compresa tra 135 e 180 nucleotidi, e per RIBO-seq, tra 135 e 170 nucleotidi.Utilizzare aghi sterili o lamette da barba e posizionare i frammenti di gel asportati in tubi Eppendorf separati. Ricordarsi di cambiare l'ago o la lama del rasoio tra i campioni. Aggiungere 100 microlitri di acqua priva di nucleasi a ogni frammento di gel accisa.E incubarli a 10 gradi Celsius, 450 colpi al minuto, durante la notte. Il giorno dopo, pulisci i campioni con il kit di pulizia del DNA. Le librerie ottenute sono pronte per il controllo della qualità e della quantità con alta sensibilità, elettroforesi dna su chip e quindi per il sequenziamento di nuova generazione.Le librerie cDNA risultanti presentano una quantità e una qualità adeguate richieste per il sequenziamento di nuova generazione, come verificato da alta sensibilità, elettroforesi dna su chip. Le bande e i picchi che rappresentano le librerie RIBO-seq sono più stretti e meglio definiti, rispetto a questo che rappresentano le librerie RNA-seq. Secondo l'elettroforesi su chip, le librerie hanno l'obiettivo previsto.I picchi aggiuntivi più vicini a 200 coppie di basi presenti nelle librerie RIBO-seq possono indicare ribosomi ibernanti, impronte ribosomiali non completamente digerite, o artefatti, ad esempio, rRNA, e possono essere scartati durante l'analisi bioinformatica quando i dati ottenuti dal sequenziamento vengono tagliati e il tRNA rRNA viene filtrato. La quantità media di cDNA generata nella preparazione della libreria è di 32 nanogrammi, fornendo una quantità sufficiente di materiale necessaria per il sequenziamento di nuova generazione. Dopo il controllo di qualità mediante elettroforesi su chip, le librerie sono state tirate per il sequenziamento a coppia singola e a 50 basi sulla piattaforma NextSeq 500 di un Illumina.Il taglio degli adattatori e delle sequenze di scarsa qualità ha comportato da 25 a 47 milioni di letture per campione per campioni di RNA-seq e da 25 a 50 milioni di letture per campione per campioni RIBO-seq. I dati ottenuti sono stati controllati con FastQC. Sia i campioni di RNA-seq che ribo-seq hanno presentato un'ottima qualità.La mappatura delle librerie preparate secondo il protocollo descritto ha prodotto da 2,4 a 9,6 milioni di letture mappate in modo univoco per campione per campioni RNA-seq e da 2,3 a 10,4 milioni di letture mappate in modo univoco per campioni RIBO-seq. I dati RIBO-seq mostrano una periodicità triplicata e un picco alto e stretto, corrispondente ai ribosomi di avvio e caratteristico delle impronte ribosomiche, che non è osservato nei dati RNA-seq. Inoltre, il grafico che mostra i profili di copertura media delle impronte ribosomiali e dei frammenti di mRNA sulle sequenze di codifica rivela la maggiore proporzione di letture mappate ai CDS nel set di dati RIBO-seq, come previsto.La visualizzazione delle impronte ribosomiche mappate ha mostrato modelli molto simili rispetto ai risultati ottenuti dallo stesso esperimento eseguito di conseguenza alla procedura RIBO-seq standard, che include il recupero monosoma per ultracentrifugazione del gradiente di saccarosio. Il nostro protocollo è stato utilizzato per studiare la regolazione della traduzione in varie condizioni di crescita, ma può essere applicato per studiare altri aspetti della traduzione, come il rilevamento di siti di iniziazione alla traduzione e nuovi geni codificanti proteine. Il sequenziamento delle biblioteche preparate secondo le nostre linee guida si traduce in dati sufficienti per un'analisi bioinformatica completa.Il protocollo che presentiamo qui è rapido, facile ed economico e può essere eseguito con apparecchiature di laboratorio standard.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

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Biochimica

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