Name: ribo-seq in bacteria: a sample collection and library preparation protocol for ngs sequencing
Uploaded: 2021-08-07T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about RIBO-seq in Bacteria: a Sample Collection and Library Preparation Protocol for NGS Sequencing at JoVE.com

ALS는 EMBO 설치 보조금 IG 3914 및 POIR의 재정 지원을 인정하고 싶습니다. 04.04.00-00-3E9C/17-00은 유럽 지역 개발 기금에 따라 유럽 연합이 공동 자금을 지원하는 폴란드 과학 재단의 첫 번째 팀 프로그램 내에서 수행되었습니다.

1. 샘플 컬렉션
<ol><li>세균 문화를 준비하십시오. 샘플당 100mL의 배양량을 권장합니다.</li>
	<li>샘플 수집을 위한 장비 및 시약 준비: 시료 당 스푸뮬라 2개, 멸균 0.45 μm 혼합 셀룰로오스 에스테르 멤브레인(MCE) 필터, 50mL 멸균 튜브, 액체 질소, 50 mg/mL 클로람페니콜 70% (vol/vol) 에탄올(선택 사항). 액체 질소 증발을 허용하고 폐쇄 튜브의 폭발을 방지하기 위해 50 mL 튜브의 뚜껑을 펑크. 실험실 세제와 7...

리보솜 프로파일링의 주요 기술적 과제는 특정 생리학적 인 관심 상태에서 mRNA에 리보솜의 스냅 샷을 캡처하기 위해 번역을 신속하게 억제 할 필요가있다. 이를 달성하기 위해, 번역 억제제, 액체 질소의 신속한 수확 및 플래시 동결이 일반적으로 사용됩니다. 항생제를 적용하는 것은 유물을 일으킬 수 있기 때문에 선택 사항입니다. 클로람페니콜은 세균RIBO-seq에서 길쭉한 리보솜을 체포하기 위해...

리보솜 프로파일링 기법 (RIBO-seq)은 캘리포니아 대학, 샌프란시스코1의조나단 바이스만의 실험실에서 개발되었다. 번역 수준에서 유전자 발현을 연구하는 데 사용되는 다른 방법과 비교하여, RIBO-seq는 mRNA에 각각의 리보솜 결합에 초점을 맞추고 성적 증명서에 리보솜의 위치와 상대적 수에 대한 정보를 제공합니다. 생체 내에서 단백질 합성 공정을 모니터링할 수 있으며 단일 코돈 분해능 및 정확도를 제공하여 개별 mRNA 및 세포 내 전체 전사체를 따라 리보솜 밀도를 측정할 수 있습니다. RIBO-seq 기술의 기초에 리보솜은 mRNA 분자를 결합하고 따라서 ribonuclease 소화에서 녹취록의 매장 된 조각을 보호한다는 사실을 거짓말. 리보나클로스를 첨가하면 보호되지 않은 mRNA가 소화되고 리보솜에 의해 동봉된 파편(일반적으로 ~28-30nt 길이)은 그대로 유지됩니다. 리보솜 발자국(RF)이라고 불리는 이러한 조각들은 리보솜의 정확한 위치를 감지하여 유래한 녹취록에 격리, 시퀀스 및 매핑될 수 있다. 실제로, mRNA 단편을 보호하는 리보솜 능력은 리보솜 결합 및 번역 개시 사이트(TIS)2,3,4를연구하기 위해 1960년대부터 사용되어 왔다. 그러나, 심층시퀀싱 기술의 발전과 함께, RIBO-seq는 번역모니터링을 위한 금 본위제가 되어 있으며, 이는 리보솜 교전을 통해 단백질 합성6에대한 게놈 차원의 정보를 제공할 수 있다. 리보솜 프로파일링은 전사와 프로테오메6을정량화하는 사이에 존재하는 기술적 격차를 채웠다.
리보솜 프로파일링을 수행하려면 조사 된 조건하에서 성장 한 유기체의 세포 리세이트를 얻어야합니다. 세포 수집 및 lysis 동안 이러한 조건을 방해하는 것은 신뢰할 수없는 데이터를 제공 할 수 있습니다. 이를 방지하기 위해, 번역 억제제, 액체 질소의 신속한 수확 및 플래시 동결이 일반적으로 사용됩니다. 세포는 믹서 밀7,8 또는 비드 비터9와같은 기계적 균질화로 극저온 연삭에 의해 용해될 수 있으며, 파이펫 10을 통해 또는바늘(11)을통해 트리튜션에 의해 서두를 수 있다. 리시스 버퍼는 세포의 분쇄 직전 또는 직후에 추가할 수 있습니다. 우리의 프로토콜에서 우리는 모르타르와 유봉을 미리 냉각하기 위해 액체 질소뿐만 아니라 알루미늄 산화물을 세균 세포 벽의 중단에 대한 부드러운 접근 법으로 사용하며, 이는 소화와 같은 방법이 적용될 때 종종 발생하는 RNA 전단을 방지합니다. 분쇄 후, 우리는 박격포의 냉각 된 내용물으로 얼음 차가운 용해 버퍼를 추가합니다. 리보소말 발자국의 최상의 해상도를 얻는 데 적합한 용해 버퍼를 선택하는 것이 중요합니다. 이온 강도는 RF 크기와 판독 프레임 정밀도 모두에 영향을 미치기 때문에, 버퍼 조성이 mRNA11,12에리보소피 점유에 영향을 미치지 않는 것으로 나타나더라도, 현재 낮은 이온 강도 및 버퍼 용량을 가진 용해 버퍼를 사용하는 것이 좋습니다. 리시스 완충제의 중요한 성분은 마그네슘 이온이며, 그 존재는 리보솜 서브유닛의 해리를 방지하고 세균리보솜(11,13)의자발적인 형성 변화를 억제한다. 칼슘 이온은 또한 중요한 역할을 하며 세균성 리보솜 프로파일링방법(14)에사용되는 소우주 뉴클레아제(MNase)의 활성에 필수적이다. 과노신 5′-[β,γ-이미도]triphosphate (GMP-PNP), GTP의 비 가수분해성 아날로그, 클로람페니콜과 함께 리시스15동안 번역을 억제한다.
용해가 얻어지면, 원심분리에 의해 명확화되고, RIBO-seq 및 고처리량 총 mRNA 시퀀싱(RNA-seq)에 대해 각각 두 부분으로 나뉘며 동시에 수행되기때문에(도 1). RNA-seq는 데이터 분석 중에 RIBO-seq 및 RNA-seq 모두에서 데이터를 비교할 수 있는 기준점을 제공합니다. 조사된 경질은 mRNA 풍부(16)로리보소말발자국의 정상화에 의해 정의된다. RNA-seq의 데이터는 복제 또는 시퀀싱아티팩트(17)를식별하는 데 도움이 될 수 있다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62544/62544fig01.jpg"> 그림 1. RIBO-seq 및 RNA-seq를 위한 mRNA 견본 제제의 회로도. RIBO-seq 라이브러리 제제의 경우 RNA는 MNase(A)로 소화되고, 그 다음으로 ~28-30nt 길이(B)의 RF 크기 선택; RNA-seq RNA는 절연(C), rRNA(D)의 고갈, 및 결과 mRNA는 임의로 다양한 길이(E)의 단편으로 단편화된다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62544/62544fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
RIBO-seq 및 RNA-seq에 대한 시료 제제의 초기 단계는 약간 다릅니다(도1). 리보솜 프로파일링을 위해, 리보솜에 의해 보호되지 않는 mRNA 분자를 저하시키기 위하여 특정 엔소나트리에 의해 소화될 필요가 있습니다. 표준 프로토콜에서, 얻어진 단량은 자당 쿠션 초원심분리 또는 자당 그라데이션 초원심분리8,14에의해 회수된다. 본 기사에서는, 이러한 단계가진핵세포(18)에대해 마찬가지로, 박테리아에서 RIBO-seq에 필요한 RF를 분리할 필요가 없으며, 폴리아크릴아미드 겔로부터 적절한 길이 mRNA 단편의 크기 선택이 충분하다는 것을 보여준다.
RNA-seq의 경우, mRNA는 전체 RNA로부터 rRNA의 고갈에 의해 얻어진다- rRNA 분자는 연쇄타비딘 코팅 자기 구슬에 결합하는 생체개화 된 올리고뉴클레오티드 프로브에 혼성화된다. rRNA-올리고뉴클레오티드-비드 복합체는 자석으로 샘플에서 제거되어 rRNA 고갈된샘플(19,20)이된다. 정제 된 mRNA 분자는 알칼리성 가수 분해에 의해 무작위로 단편화됩니다. mRNA의 얻어진 단편뿐만 아니라 리보소말 발자국은 cDNA 라이브러리로 변환되고 깊은 시퀀싱(그림2)에대비한다. 이것은 알칼리성 가수 분해 (mRNA용) 및 효소 소화 (RF에 대한) 후에 필요한 수리를 종료합니다 : 3'끝의 탈포질화 는 5'끝의 인산화에 선행됩니다. 다음 단계는 일루미나 플랫폼을 사용하여 차세대 시퀀싱(NGS)에 필요한 서열에 의해 프레임된 cDNA 인서트를 만드는 어댑터 결찰 및 역전사이다. 라이브러리 준비의 마지막 단계는 한 채널에서 여러 가지 샘플을 멀티플렉스링하고 시퀀싱할 수 있도록 시료 특정 바코드로 구문이 증폭되고 레이블이 지정된 PCR 반응입니다. 시퀀싱 하기 전에, 라이브러리의 품질 과 수량은 고감도 DNA 온 칩 전기 포에 의해 평가됩니다. 그런 다음 적절한 매개 변수가 있는 cDNA 라이브러리를 풀로 만들고 시퀀싱할 수 있습니다. 시퀀싱은 라이브러리 수에 따라 MiSeq, NextSeq 또는 HighSeq와 같은 다양한 일루미나 플랫폼에서 수행할 수 있으며, 필요한 읽기 길이 및 시퀀싱 깊이를 수행할 수 있습니다. 시퀀싱 후 생체 정보 분석이 수행됩니다.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62544/62544fig02.jpg"> 그림 2. 도서관 준비. 라이브러리 준비에는 엔드 수리, 어댑터 결찰, 역전사 및 바코딩증폭이 포함됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62544/62544fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
리보솜 프로파일링은 과학적 질문에 따라 쉽게 수정하고 조정할 수 있는 보편적인 방법입니다. 원래 효모1에서사용되었지만 곧 세균세포(21)뿐만 아니라 진핵모델 유기체에 마우스10,제브라피쉬(22, 과일 플라이23, 아라비도시스 탈리아나24)를포함한다. 또한 세포질, 미토콘드리아25,26 및 엽록소세포27,28등 다른 리보성 유형을 연구하는 데 사용되었다. 진핵산자RIBO-seq에서 일반적으로 개시 10,11,29,30,31,32,연신1,10,11,31,33,리보솜 실속 33 및 형태 변화33을 포함하여 번역의 특정 측면을 조사하기 위해 적응 및 정제된다. 수정의 대부분은 다른 번역 억제제의 사용을 포함한다. 그러나 박테리아에서는, 유사한 연구는 행동의 필수 기계장치와 억제제의 빈약함 때문에 수행하기 어려웠다(34). 박테리아에서 가장 일반적으로 사용되는 번역 억제제는 펩디딜 트랜스퍼라제 센터(PTC)에 결합하고 A-부위에 아미노아틸-tRNA의 올바른 위치를 방지하는 클로람페니콜(CAM)이다. 그 결과, CAM은 긴리보솜(35)을체포하는 펩티드 결합의 형성을 방지한다. 박테리아에서 번역 억제제의 다른 예는 테트라사이클린 (TET)36,retapamulin (RET)34 및 Onc11237 번역 개시 사이트를 조사하는 데 사용되었습니다. TRNA를 A-부위에서 tRNA의 항코돈 줄기 루프와 직접 겹쳐리게 하여 리보솜에 tRNA 전달을 방지하는 TET는 원래 CAM 치료로부터 얻은 결과를 확인하기위해 적용되었다. TET는 기본 TIS를 검출하는 것으로 밝혀졌지만 내부 TIS36을밝힐 수 없었습니다. RET는 세균성 리보솜의 PTC에 결합하고, A 부위에서 길쭉한 아미노실-tRNA를 방해함으로써 제1 펩티드 결합의 형성을 방지한다. RET를 적용하면 1차 및 내부TISS 34모두에서리보솜이 체포됩니다. Onc112는 프롤린이 풍부한 항균 펩타이드로 출구 터널에 결합하고 리보소말 A 부위에 아미노틸-tRNA 결합을 차단한다. 그 결과, Onc112는 연신단계37에진입하는 개시 복합체를 방지한다.
주요 정보 리보솜 프로파일링은 리보솜 밀도와 mRNA에 대한 위치입니다. 다양한 성장 조건에서 번역 수준에서 차등 유전자 발현을 성공적으로적용하였으며,번역 효율1,38,39를 측정하고 리보소말 일시중지(10)와같은 번역 조절 이벤트를 검출하는 데 성공했다. RIBO-seq는 또한 새로운 및/또는 매우 짧은 단백질 코딩 유전자10,12, 22,30,37의식별으로 이어지는 음부된 ncRNA, 의사 유전자 및 잘 통칭되지 않은 작은 독서 프레임(ORF)의 번역을 발견할 수 있다. 이러한 경우, RIBO-seq미세 조정 및 게놈 성화를 향상시킬 수 있습니다. 번역된 ORF및 그 정량적 특성의 식별에 대한 높은 민감도를 가진 리보솜 프로파일링은 프로테오메 결정또는 프로테오믹스 연구31,34,39를돕는 데 도움이 되는 프록시역할을 할 수 있다. TIS를 매핑함으로써 리보솜 프로파일링은 알려진 단백질10,32의N 단말 확장 및 잘린 등형을 밝혀낸다. RIBO-seq는 또한 단백질14,21,24의공동 번역 접이식을 연구하도록 조정되었다. 이 방법은 개별 코돈의 연신율1,10,39 또는 디코딩 속도를 측정할 수 있게 해주며,번역(17)의정량적 모델을 개발하는 데 도움이 된다. 리보솜프로파일링 방법은 또한 박테리아7,15,17,프레임 변속40,스톱 코돈판독21,종단/재활용 결함41, 42 및 리보소말 형성 변화33진핵생물에서 의 리보솜 일시 정지에 대한 기계적 통찰력을 제공할 수 있다. RIBO-seq는 또한 진핵생물(16,43)에서miRNAs6 및 RNA 결합 단백질과 같은 번역에 대한 특정 트랜스 작용 인자의 영향을 검사하도록 조정되었다. 그러나, RIBO-seq의 실험 설계 및 획득된 해상도가 결과 시퀀싱데이터(12)로부터추출될 수 있는 정보의 양을 결정하는 것이 중요하다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10X TBE (powder)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9864</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol, 99%, pure</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>125472500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine 5&#39;-Triphosphate (ATP)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>P0756S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminium oxide calcinated pure p.a.</td>
			<td>Chempur</td>
			<td>114560600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride dihydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C3881-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>190321</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA Clean &#38; Concentrator -5</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>D4004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dnase I recombinant, Rnase-free</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4716728001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA disodium salt</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>E/P140/48</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl Alcohol Absolut 99,8%&#160; Pure-P.A.-Basic</td>
			<td>POCH Avantor Performance Materials Poland S.A</td>
			<td>BA6480111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filtration apparatus</td>
			<td>VWR Collection</td>
			<td>511-0265</td>
			<td>all-glass filtration apparatus, with funnel, fritted base, cap, 47 mm &#216; spring clamp and ground joint flask</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel 40 (19:1)</td>
			<td>Rotiphorese</td>
			<td>3030.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel Loading Dye, Blue, 6X</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E6138G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guanosine 5&#8242;-[&#946;,&#947;-imido]triphosphate trisodium salt hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G0635-25MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>labZAP</td>
			<td>A&#38;A Biotechnology</td>
			<td>040-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium acetate tetrahydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M5661-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MCE membrane fiter</td>
			<td>Alfatec Technology</td>
			<td>M47MCE45GWS</td>
			<td>pore size: 0.45um</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MICROBExpress Bacterial mRNA Purification</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM1905</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiplex Small RNA Library Prep Set for Illumina</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E7300S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-Free Water</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9937</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Acetate Anhydrous Pure P.A.</td>
			<td>POCH Avantor Performance Materials Poland S.A</td>
			<td>744330113</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quick-Load pBR322 DNA-MspI Digest</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E7323A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA Clean &#38; Concentrator -25</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>R1018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2889-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium carbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>223530-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydrogen carbonate pure p.a.</td>
			<td>POCH Avantor Performance Materials Poland S.A</td>
			<td>810530115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR Gold nucleic acid gel stain</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>S11494</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 Polynucleotide Kinase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0201L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 Polynucleotide Kinase Reaction Buffer</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B0201S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBE-Urea Sample Buffer (2x)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>LC6876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris(hydroxymethyl)amino-methane, ultrapure, 99,9%</td>
			<td>AlfaAesar</td>
			<td>J65594</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100, 98%</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>327371000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea G.R.</td>
			<td>lach:ner</td>
			<td>40096-AP0</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ribo-seq in bacteria: a sample collection and library preparation protocol for ngs sequencing

리보솜 프로파일링 기법(RIBO-seq)은 현재 생체 내에서단백질 합성 과정을 연구하는 가장 효과적인 도구이다. 이 방법의 장점은 다른 접근법과 비교하여 mRNA 성적 증명서에서 리보솜의 위치와 수를 정확하게 매핑하여 번역을 모니터링할 수 있다는 것입니다.
본 기사에서는 실험의 계획 및 실행과 관련된 세부 사항을 강조하여 박테리아에서 RIBO-seq 방법에 대한 샘플 수집 및 준비의 연속 단계를 설명합니다.
RIBO-seq는 그대로 리보솜 및 관련 mRNAs에 의존하기 때문에, 중요한 단계는 번역의 급속한 억제 및 세포의 적당한 붕괴입니다. 따라서, 우리는 박테리아에서 번역을 체포하는 클로람페니콜과 선택적 전처리와 함께 세포 수확을위한 액체 질소에 여과 및 플래시 동결을 제안한다. 붕괴를 위해, 우리는 기계적으로 세포 벽을 방해하기 위해 알루미늄 산화물의 존재에 박격포와 유봉냉동 세포를 분쇄 제안한다. 이 프로토콜에서, 자당 쿠션 또는 단량 정화를 위한 자당 그라데이션 초원심분리가 필요하지 않다. 대신, 폴리아크릴아미드 겔 전기포고증(PAGE)을 이용한 mRNA 분리가 리보소탈 발자국 절제(28-30 nt band)를 적용하고 만족스러운 결과를 제공한다. 이렇게 하면 메서드가 크게 간소화될 뿐만 아니라 절차에 대한 시간과 장비 요구 사항을 줄일 수 있습니다. 도서관 준비를 위해, 우리는 최적화의 어느 정도 제조 업체의 지침에 따라, 뉴 잉글랜드 생물 연구소에서 일루미나 염기서열에 대한 상업적으로 사용할 수있는 작은 RNA 키트를 사용하는 것이 좋습니다.
생성된 cDNA 라이브러리는 차세대 시퀀싱(NGS)에 필요한 적절한 수량과 품질을 제공합니다. 설명된 프로토콜에 따라 제조된 라이브러리의 시퀀싱은 샘플당 2~10mln고유매핑된 판독으로 포괄적인 생물정보 분석을 위한 충분한 데이터를 제공한다. 우리가 제시하는 프로토콜은 빠르고 상대적으로 쉬우며 표준 실험실 장비로 수행 할 수 있습니다.

여기에 제시된 모범적인 결과는 WT 바실러스 subtilis 세포를 포자하는 번역 규정을 검토하는 연구 결과에서 얻어졌습니다. 야간 배양물은 풍부한 배지의 100mL에서 0.1에 해당하는 OD600으로 희석되었고, 37°C에서 배양하여 OD600이 0.5-0.6에 도달할 때까지 격렬한 흔들림을 하였다. 그 후 풍부한 배지는 포자 공정을 유도하기 위해 최소한의 매체로 대체되었고 인큐베이션은 최대 4시...

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RIBO-seq in Bacteria: a Sample Collection and Library Preparation Protocol for NGS Sequencing

여기에서 우리는 박테리아에 있는 RIBO-seq를 위한 견본 수집 및 준비의 단계를 기술합니다. 이러한 지침에 따라 준비된 라이브러리의 시퀀싱은 포괄적인 생물정보 분석을 위한 충분한 데이터를 생성합니다. 우리가 제시하는 프로토콜은 간단하고 표준 실험실 장비를 사용하며 리시스에서 라이브러리 획득까지 7 일이 걸립니다.

박테리아의 RIBO-seq: NGS 시퀀싱을 위한 샘플 수집 및 라이브러리 준비 프로토콜

The ribosome profiling technique (RIBO-seq) is currently the most effective tool for studying the process of protein synthesis in vivo. The advantage of ...

RIBO-seq라고도 불리는 리보솜 프로파일링 기법은 현재 생체 내에서 단백질 합성 과정을 연구하는 가장 효과적인 도구입니다. 이 방법의 장점은 리보솜의 위치와 수를 정확하게 매핑하여 번역을 모니터링할 수 있다는 점입니다. RIBO-seq는 리보솜이 mRNA 분자에 결합하여, 리보누엘리스 소화시 녹취록의 매장된 조각을 보호한다는 사실에 근거한다.리보솜 발자국이라고 불리는 얻어진 조각은 리보솜의 정확한 위치를 결정하는 결과로 서열화하여 원래의 성적증명서에 매핑될 수 있습니다. RIBO-seq에 동시에, 높은 처리량 총 mRNA 시퀀싱은 기준점을 제공하고 데이터 분석 중에 RIBO-seq 및 RNA-seq 모두에서 데이터의 비교를 가능하게 하기 위해 수행된다. 세포 수확 전에, 번역을 억제하기 위해, 밀리리터 당 100 마이크로 그램의 최종 농도에, 세균 문화에 클로람페니콜을 추가 할 수 있습니다.1 분 동안 항생제로 문화를 배양하십시오. 이 단계는 수확이 평소보다 오래 걸리는 경우 중요합니다, 번역 억제는 샘플 수집 시간을 연장 할 수 있기 때문에. 미리 데워진 여과 시스템으로 샘플을 수집합니다.성장 조건을 모방하기 위해 흔들림을 도입할 수 있습니다. 모든 미디어가 멤브레인을 통과했을 때 필터링을 중지하지만 필터가 완전히 건조되는 것을 허용하지 않습니다. 미리 따뜻해지고 소독된 스쿠뮬라를 사용하여 필터 디스크에서 세포를 빠르게 긁어내어 세균성 펠릿을 수집합니다.즉시 액체 질소로 채워진 50 밀리리터 튜브에 수확 된 세포와 함께 전체 스쿠쿨라를 배치합니다. 수확된 펠릿은 액체 질소로 완전히 덮여 있어야 합니다. 펠릿을 철저히 얼게 하고 이전에 냉각된 스쿠쿨라를 사용하여 냉동 된 세포를 제거하십시오.뚜껑을 닫고 구멍이 뚫렸는지 확인합니다. 이는 액체 질소가 증발 시 압력 변화로 인해 밀폐된 용기가 폭발할 수 있기 때문에 중요합니다. GMPP, DNA 면봉, 리사스를 위한 신선한 엡펜도르프 튜브를 준비하십시오.필요한 경우 클로람페니콜을 추가하여 리시스 버퍼를 준비합니다. 샘플당 500마이크로리터의 리시스 버퍼를 별도의 Eppendorf 튜브에 할당하고 얼음 위에 놓습니다. 실험실 소독제와 70%에탄올로 박격포와 유봉을 오염 제거합니다.박격포를 식히고 액체 질소를 박격포에 부어 유봉하십시오. 냉동 세균성 펠릿을 미리 차가운 박격포로 옮기고 분말로 갈아줍니다. 약 1부의 알루미늄 산화물을 추가하고 연삭을 계속합니다.필요할 때 액체 질소를 부어 박격포, 유봉 및 세포를 냉각시키고 박격포의 내용이 해동되지 않도록하십시오. 사용하기 직전에, 리시스 버퍼 알리쿼트에 GMPPNP 및 DNA 면봉을 추가합니다. 솔루션을 박격포로 옮기고 계속 연마합니다.연마하는 동안 리사즈가 천천히 해동하자. 리사스가 완전히 해동되면 혼합물을 미리 식힌 엡펜도르프 튜브로 옮기고 얼음으로 돌아갑니다. 원심분리기 는 섭씨 4도에서 5분 동안 20, 0000 G에서 리사스.수퍼네이너트는 신선하고 미리 차가운 엡펜도르프 튜브로 옮기고 얼음 위에 놓습니다. NanoDrop을 사용하여 각 희석 된 샘플의 RNA 농도를 측정합니다. 각 용액을 두 부분으로 나누고, RIBO-seq를 위한 RNA의 0.5- 1 밀리그램, RNA-seq에 대한 나머지를 나눈다.RNA의 1 밀리그램에, Tris pH 8에 있는 MNase의 3.8 마이크로리터를 추가하고, 500 마이크로리터의 총 부피에 용해 버퍼로 위로 얹습니다. 섭씨 25도, 분당 300발의 배양하여 45분간 배양합니다. 인큐베이션이 완료되면 시판되는 RNA 정리 키트로 샘플을 청소하십시오.8개의 어금니우레아로 15%의 폴리아크릴아미드 TBE 젤을 준비하고 TBE 버퍼가 있는 탱크에 놓습니다. 200볼트의 일정한 전압에서 최소 10분 동안 사전 실행합니다. 샘플을 TBE-Urea 샘플 버퍼와 혼합합니다.1 분 동안 섭씨 95섭씨도에서 자연을 변성하고 즉시 얼음 위에 놓습니다. 주사기를 사용하여 TBE 버퍼를 젤 웰에 주입하여 우레아를 씻어 내보라고 합니다. 샘플을 로드하여 각 샘플을 분리하고 교차 오염을 방지하기 위해 샘플 사이에 하나의 우물 공간을 남깁니다.29 뉴클레오티드 긴 올리고를 사용 하 여, 그리고 26 및 32 뉴클레오티드 긴 올리고의 혼합 마커로. 전기 전도를 180 볼트의 일정한 전압으로 실행합니다. 하룻밤 잠복식을 위해 멸균 버퍼를 준비합니다.전기전도가 끝나면 SYBR 골드로 젤을 얼룩지게 합니다. 멸균 바늘 또는 면도날을 가진 26그리고 32개의 뉴클레오티드 사이 젤의 조각을 소비하고, 별도의 Eppendorf 관에 젤 조각을 놓습니다. 샘플 사이에 바늘이나 면도날을 변경합니다.각 Eppendorf에 하룻밤 인큐베이션 버퍼 200 마이크로리터를 추가하고 하룻밤 사이에 10 섭씨, 분당 1000 라운드에서 샘플을 배양합니다. 다음 날, RNA 정화 키트로 샘플을 청소하고 18 개의 핵리터가없는 물에서 그들을 엘테하십시오. 획득한 리보소말 발자국은 라이브러리 준비를 위한 준비가 되어 있습니다.상용 키트를 사용하여 RNA-seq용 시료에 대한 리보소말 RNA 고갈을 수행한다. 다음으로 RNA 정리 키트로 샘플을 청소하십시오. 다음과 같이 알칼리성 가수 분해를 수행;알칼리성 가수 분해 버퍼를 준비하고, 한 부피의 버퍼를 샘플의 한 부피에 추가하고, 25분 동안 95°C에서 배양한다.반응을 중지하기 위해 각 샘플에 3 개의 Molar 나트륨 아세테이트 pH 5.5의 5 마이크로 리터를 추가합니다. RNA 정화 키트로 샘플을 청소하고 18 개의 핵산염 수분으로 이 샘플을 엘테하십시오. 얻어진 무작위로 단편화된 RNA는 라이브러리 준비를 위한 준비가 되어 있습니다.각 샘플에 10x 반응 버퍼10마이크로리터와 T4 폴리뉴클레오티드 키나아제 5마이크로리터를 추가합니다. 1시간 반 동안 섭씨 37도에서 배양합니다. 이 시간 후, 1 밀리머 ATP의 3 마이크로 리터를 추가하고 1 시간 동안 37 섭씨 도에서 배양.다음으로 RNA 정리 키트로 샘플을 청소하십시오. 여기에 제공된 프로토콜에 따라 시판되는 키트를 사용하여 라이브러리 준비를 수행합니다. 6% 폴리아크릴아미드 젤을 사용하여 페이지를 수행합니다.SYBR 골드로 젤을 얼룩지게 합니다. 라이브러리를 포함하는 절제 젤 조각. RNA-seq 샘플의 경우, 라이브러리는 135와 180뉴클레오티드 사이이며, RIBO-seq의 경우 135~170개의 뉴클레오티드 사이이다.멸균 바늘이나 면도날을 사용하고 절제된 젤 조각을 별도의 엡펜도르프 튜브에 놓습니다. 샘플 사이에 바늘이나 면도날을 교체해야 합니다. 각 절제된 젤 단편에 100마이크로리터의 뉴클레아제 없는 물을 넣습니다.그리고 하룻밤 사이에 10섭씨, 분당 450라운드로 배양합니다. 다음 날, DNA 정리 키트로 샘플을 청소하십시오. 획득한 라이브러리는 고감도, DNA 온칩 전기전경, 그리고 차세대 시퀀싱을 통해 품질 및 수량 제어를 위한 준비가 되어 있습니다.생성된 cDNA 라이브러리는 고감도, DNA 온칩 전기포고증으로 확인된 차세대 시퀀싱에 필요한 적절한 양과 품질을 제시합니다. RIBO-seq 라이브러리를 나타내는 대역과 피크는 RNA-seq 라이브러리를 나타내는 이에 비해 더 좁고 더 잘 정의됩니다. 온칩 전기포에 따르면 라이브러리에는 예상 렌즈가 있습니다.RIBO-seq 라이브러리에 존재하는 200개의 기본 쌍에 가까운 추가 피크는 완전히 소화되지 않는 리보솜, 예를 들어 rRNA, 또는 유물을 최대 절전 모드로 지정할 수 있으며, 시퀀싱에서 얻은 데이터가 트리밍되고 rRNA tRNA가 필터링될 때 생물정보 분석 중에 폐기될 수 있다. 라이브러리 준비에서 생성된 평균 양의 cDNA는 32나노그램으로 차세대 시퀀싱에 필요한 충분한 양의 물질을 제공합니다. 온칩 전기전도에 의한 품질 관리 후 일루미나넥스트세크 500 플랫폼에서 단일 및 50개의 베이스 페어 시퀀싱을 위해 라이브러리를 당겼습니다.어댑터와 품질이 좋지 않은 서열을 트리밍하면 RNA-seq 샘플의 샘플당 25~4,700만 개의 판독이 발생했으며, RIBO-seq 샘플의 경우 샘플당 25~5,000만 개의 판독이 발생했습니다. 획득된 데이터는 FastQC로 확인된 품질 관리였습니다. RNA-seq 및 RIBO-seq 샘플 모두 매우 좋은 품질을 제시했습니다.설명된 프로토콜에 따라 제조된 라이브러리의 매핑은 RNA-seq 샘플에 대한 샘플당 2.4~960만 개의 고유 매핑 된 판독값, RIBO-seq 샘플에 대한 2.3 ~ 1,040 만 개의 고유 매핑 된 판독을 산출했습니다. RIBO-seq 데이터는 RNA-seq 데이터에서 관찰되지 않는 리보솜 및 리보솜 발자국의 시동 리보솜 및 특성에 대응하는 세 배의 주기성과 키가 크고 좁은 피크를 나타낸다. 더욱이, 코딩 시퀀스의 리보소말 발자국 및 mRNA 조각의 평균 커버리지의 프로파일을 보여주는 플롯은 예상대로 RIBO-seq 데이터 세트에서 CDS에 매핑된 판독값의 더 높은 비율을 드러낸다.매핑된 리보솜 발자국의 시각화는 자당 그라데이션 극심분리에 의한 단일화 회수를 포함하는 표준 RIBO-seq 절차에 따라 수행된 동일한 실험에서 얻은 결과에 비해 매우 유사한 패턴을 보였다. 우리의 프로토콜은 다양한 성장 조건에서 번역 조절을 조사하는 데 사용되었지만 번역 개시 부위 및 새로운 단백질 코딩 유전자의 검출과 같은 번역의 다른 측면을 연구하기 위해 적용 될 수 있습니다. 가이드라인에 따라 준비된 라이브러리의 시퀀싱은 포괄적인 생물정보 분석을 위한 충분한 데이터를 생성합니다.여기에 제시하는 프로토콜은 빠르고 쉽고 비용 효율적이며 표준 실험실 장비로 수행 할 수 있습니다.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

질량 분석 기반 식별 RNA 바인딩 영역에 대 한 샘플 준비

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

연구

생화학

An All-in-one Sample Holder for Macromolecular X-ray Crystallography with Minimal Background Scattering

최소한의 배경 산란을 갖춘 거대 분자 X선 결정학을 위한 올인원 샘플 홀더

Macromolecular X-ray crystallography (MX) is the most prominent method to obtain high-resolution three-dimensional knowledge of biological macromolecules. ...

A Plasma Sample Preparation for Mass Spectrometry using an Automated Workstation

자동화된 워크스테이션을 사용한 질량 분석법을 위한 플라즈마 시료 준비

Sample preparation for mass spectrometry analysis in proteomics requires enzymatic cleavage of proteins into a peptide mixture. This process involves ...

Sample Preparation for Probe Electrospray Ionization Mass Spectrometry

프로브 전기 분무 이온화 질량 분광법을 위한 샘플 준비

Mass spectrometry (MS) is a powerful tool in analytical chemistry because it provides very accurate information about molecules, such as mass-to-charge ...

TMT Sample Preparation for Proteomics Facility Submission and Subsequent Data Analysis

프로테오믹스 시설 제출 및 후속 데이터 분석을 위한 TMT 샘플 준비

Proteomic technologies are powerful methodologies that can aid our understanding of mechanisms of action in biological systems by providing a global view ...

MS2-Affinity Purification Coupled with RNA Sequencing in Gram-Positive Bacteria

그람 양성 박테리아에서 RNA 염기서열분석과 결합된 MS2-선호도 정화

Although small regulatory RNAs (sRNAs) are widespread among the bacterial domain of life, the functions of many of them remain poorly characterized ...

NMR-Based Fragment Screening in a Minimum Sample but Maximum Automation Mode

최소 샘플이지만 최대 자동화 모드에서 NMR 기반 단편 스크리닝

Fragment-based screening (FBS) is a well-validated and accepted concept within the drug discovery process both in academia and industry. The greatest ...

A Sample Preparation Pipeline for Microcrystals at the VMXm Beamline

VMXm 빔라인의 미세 결정을 위한 샘플 준비 파이프라인

The mounting of microcrystals (&#60;10 &#181;m) for single crystal cryo-crystallography presents a non-trivial challenge. Improvements in data quality ...

Sample Preparation and Transfer Protocol for In-Vacuum Long-Wavelength Crystallography on Beamline I23 at Diamond Light Source

다이아몬드 광원에서 빔라인 I23의 진공 장거리 결정예 촬영을 위한 샘플 준비 및 전송 프로토콜

Long-wavelength macromolecular crystallography (MX) exploits the anomalous scattering properties of elements, such as sulfur, phosphorus, potassium, ...

Preparation of High-Temperature Sample Grids for Cryo-EM

Cryo-EM용 고온 시료 그리드 준비

The sample grids for cryo-electron microscopy (cryo-EM) experiments are usually prepared at a temperature optimal for the storage of biological samples, ...