Name: ribo-seq in bacteria: a sample collection and library preparation protocol for ngs sequencing
Uploaded: 2021-08-07T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about RIBO-seq in Bacteria: a Sample Collection and Library Preparation Protocol for NGS Sequencing at JoVE.com

ALS ønsker å anerkjenne den økonomiske støtten til EMBO Installation Grants IG 3914 og POIR. 04.04.00-00-3E9C/17-00 utført i First TEAM-programmet til Foundation for Polish Science finansiert av EU under European Regional Development Fund.

1. Eksempelsamling
<ol><li>Forbered en bakteriekultur. Vi anbefaler et kulturvolum på 100 ml per prøve.</li>
	<li>Forbered utstyr og reagenser for prøvetaking: to scoopulas per prøve, sterile 0,45 μm blandede cellulose estere membran (MCE) filtre, 50 ml sterile rør, flytende nitrogen, 50 mg / ml kloramfenikol i 70% (vol / vol) etanol (valgfritt). Punkter lokket på 50 ml rør for å tillate flytende nitrogenfordampning og forhindre eksplosjon av lukkede rør. Dekontaminer scoopulas med laboratorievaskemiddel og 7...

Den viktigste tekniske utfordringen med ribosomet profilering er behovet for å raskt hemme oversettelse for å fange et øyeblikksbilde av ribosomer på mRNAer på en bestemt fysiologisk tilstand av interesse. For å oppnå dette brukes ofte oversettelseshemmere, rask høsting og blitsfrysing i flytende nitrogen. Påføring av antibiotika er valgfritt siden de kan forårsake artefakter. Kloramfenikol er et vanlig brukt stoff for å arrestere forlengelse av ribosomer i bakteriell RIBO-seq. Det forhindrer imidlertid ikke ...

Ribosomprofileringsteknikken (RIBO-seq) ble utviklet i laboratoriet til Jonathan Weissman ved University of California, San Francisco1. Sammenlignet med andre metoder som brukes til å studere genuttrykk på translasjonsnivå, fokuserer RIBO-seq på hvert ribosome som binder seg til mRNA og gir informasjon om plasseringen og det relative antallet ribosomer på en transkripsjon. Det muliggjør overvåking av prosessen med proteinsyntese in vivo og kan gi enkel kodonoppløsning og nøyaktighet som tillater måling av ribosomets tetthet på begge, den enkelte mRNA og langs hele transkripsjonen i cellen. Ved grunnlaget for RIBO-seq-teknikken ligger det faktum at ribbeosomet under oversettelse binder mRNA-molekylet og dermed beskytter det begravde fragmentet av transkripsjonen fra en ribonuklease fordøyelse. Ved tilsetning av ribonuklease fordøyes den ubeskyttede mRNA og fragmentene vedlagt av ribosomer - vanligvis ~ 28-30 nt lange - forblir intakte. Disse fragmentene, kalt ribosomale fotavtrykk (RF), kan deretter isoleres, sekvenseres og kartlegges på transkripsjonen de stammer fra, noe som resulterer i deteksjon av ribosomenes nøyaktige posisjon. Faktisk har ribososom evnen til å beskytte mRNA fragmenter blitt brukt siden 1960-tallet for å studere ribosomal binding og oversettelse initieringssteder (TIS)2,3,4. Men med fremskrittet i dyp sekvenseringsteknologi har RIBO-seq blitt en gullstandard for oversettelsesovervåking5 som gjennom ribosomets engasjement kan gi en genom-bred informasjon om proteinsyntese6. Ribosomprofilering fylte det teknologiske gapet som eksisterte mellom kvantifisering av transkripsjonen og proteomet6.
For å gjennomføre ribosomprofilering må vi få cellelys av organismen som hadde vokst under de undersøkte forholdene. Å forstyrre disse forholdene under celleinnsamling og lysis kan gi upålitelige data. For å forhindre dette brukes ofte oversettelseshemmere, rask høsting og blitsfrysing i flytende nitrogen. Celler kan lyses ved kryogen sliping i en mekanisk homogenisator som en miksermølle7,8 eller en perle beater9, og ved triturasjon gjennom en pipette10 eller med en nål11. Lysisbufferen kan tilsetts like før eller kort tid etter pulverisering av cellene. I vår protokoll bruker vi flytende nitrogen til prekolmørtel og pestle, samt aluminiumoksid som en mildere tilnærming til forstyrrelse av bakteriell cellevegg, noe som forhindrer RNA-skjæring ofte oppstår når metoder som sonifisering påføres. Etter pulverisering legger vi til en iskald lysisbuffer i det avkjølte innholdet i mørtelet. Valg av en passende lysisbuffer er viktig for å oppnå den beste oppløsningen av ribosomale fotavtrykk. Siden ionstyrke påvirker både RF-størrelsen og leserammepresisjonen, anbefales det for tiden å bruke lysisbuffere med lav ionisk styrke og bufferkapasitet, selv om det ser ut til at buffersammensetningen ikke påvirker ribosomal belegg på mRNAs11,12. Viktige komponenter i lysisbufferen er magnesiumioner, hvis tilstedeværelse forhindrer dissosiasjon av ribosomale underenheter og hemmer spontane konformasjonsendringer i bakterielle ribosomer11,13. Kalsiumioner spiller også en betydelig rolle og er avgjørende for aktiviteten til mikrokokkkjerne (MNase) som brukes i bakteriell ribosomprofileringsmetode14. Tillegg av guanosin 5′-[β,γ-imido]triphosfat (GMP-PNP), en ikke-hydrolysert analog av GTP, sammen med kloramfenikol hemmer oversettelse under lysis15.
Når lysatet oppnås, avklares det ved sentrifugering og deles inn i to deler, hver for en RIBO-seq og en total mRNA-sekvensering med høy gjennomstrømning (RNA-seq) siden de utføres samtidig (figur 1). RNA-seq gir et referansepunkt som gjør det mulig å sammenligne data fra både RIBO-seq og RNA-seq under dataanalyse. Den undersøkte translatome er definert ved normalisering av ribosomale fotavtrykk til mRNA overflod16. Data fra RNA-seq kan også bidra til å identifisere kloning eller sekvensering av artefakter17.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62544/62544fig01.jpg"> Figur 1. Skjema for mRNA prøvepreparering for RIBO-seq og RNA-seq. For RIBO-seq bibliotek forberedelse fordøyes RNA med MNase (A), etterfulgt av størrelsesvalget av RF på ~ 28-30 nt lengde (B); for RNA-seq RNA er isolert (C), utarmet av rRNA (D), og den resulterende mRNA fragmenteres tilfeldig i fragmenter av varierende lengde (E). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62544/62544fig01large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
De første trinnene i prosedyren for prøvepreparering for RIBO-seq og RNA-seq varierer noe (figur 1). For ribosomal profilering må lysatet fordøyes av en bestemt endonuklease for å forringe mRNA-molekylene som ikke er beskyttet av ribosomene. I standardprotokoller gjenvinnes de oppnådde monosomene av en sukrosepute ultracentrifugation eller en sukrose gradient ultracentrifugation8,14. I denne artikkelen viser vi at dette trinnet ikke er nødvendig for å isolere RF som kreves for RIBO-seq i bakterier, på samme måte for eukaryote celler18, og at størrelsesvalg av riktig lengde mRNA-fragmenter fra polyakrylamidgelen er tilstrekkelig.
For RNA-seq oppnås mRNA ved uttømming av rRNA fra de totale RNA - rRNA-molekylene hybridiserer til de biotinylerte oligonukleotidsondene som binder seg til de streptavidinbelagte magnetiske perlene. RRNA-oligonukleotid-perlekompleksene fjernes deretter fra prøven med en magnet som resulterer i en rRNA utarmet prøve19,20. De rensede mRNA-molekylene fragmenteres deretter tilfeldig av alkalisk hydrolyse. De oppnådde fragmentene av mRNA samt ribosomale fotavtrykk konverteres til cDNA-biblioteker og fremstilles for dyp sekvensering (figur 2). Dette innebærer reparasjon av ender som trengs etter alkalisk hydrolyse (for mRNA) og enzymatisk fordøyelse (for RF): defosforylering av 3' ender etterfulgt av fosforylering av 5' ender. De neste trinnene er adaptere ligation og omvendt transkripsjon for å lage cDNA innsatser innrammet av sekvenser som kreves for neste generasjon sekvensering (NGS) ved hjelp av Illumina plattform. Den siste fasen av bibliotekforberedelse er en PCR-reaksjon der konstruksjonene forsterkes og merkes med prøvespesifikke strekkoder for å tillate multipleksing og sekvensering av ulike prøver på en kanal. Før sekvensering vurderes kvaliteten og mengden av bibliotekene av høysensitiv DNA on-chip elektroforese. cDNA-biblioteker med riktige parametere kan deretter grupperes og sekvenseres. Sekvensering kan utføres på forskjellige Illumina-plattformer, for eksempel MiSeq, NextSeq eller HighSeq, avhengig av antall biblioteker, nødvendig leselengde og sekvenseringsdybde. Etter sekvensering utføres den bioinformatiske analysen.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62544/62544fig02.jpg"> Figur 2. Klargjøring av biblioteket. Biblioteksforberedelse inkluderer endereparasjon, adaptere ligation, omvendt transkripsjon og forsterkning med barkoding. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62544/62544fig02large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
Ribosomet profilering er en universell metode som lett kan modifiseres og justeres i henhold til det vitenskapelige spørsmålet. Opprinnelig ble den brukt i gjær1, men kort tid etter at den ble brukt på bakterieceller21 samt eukaryote modellorganismer, inkludert mus10, sebrafisk22, fruktflue23 og Arabidopsis thaliana24. Den ble også brukt til å studere forskjellige ribosomtyper: cytoplasmatisk, mitokondrie25,26 og kloroplast27,28. I eukaryoter er RIBO-seq vanligvis tilpasset og raffinert for å undersøke spesifikke aspekter ved oversettelse, inkludert initiering10,11,29,30,31,32, forlengelse1,10,11,31,33, ribosom stalling33 og konformasjonsendring33. De fleste modifikasjonene innebærer bruk av forskjellige oversettelseshemmere. I bakterier har imidlertid analoge studier vært vanskelige å gjennomføre på grunn av hemmeres paucity med den nødvendige virkningsmekanismen34. Den mest brukte oversettelseshemmeren i bakterier er kloramfenikol (CAM) som binder seg til peptidyloverføringssenteret (PTC) og forhindrer riktig posisjonering av aminoacyl-tRNA på A-området. Som et resultat forhindrer CAM dannelsen av en peptidbinding som fører til å arrestere de langstrakte ribosomene35. Andre eksempler på oversettelseshemmere i bakterier er tetracyklin (TET)36, retapamulin (RET)34 og Onc11237 som har blitt brukt til å undersøke oversettelsesinitieringssteder. TET, som forhindrer tRNA-levering til ribosomet ved å overlappe direkte med antikodonstammeløkken til tRNA på A-stedet, ble opprinnelig brukt for å verifisere resultatene oppnådd fra CAM-behandling siden de begge er antibiotika som hemmer oversettelsesforlengelse38. TET ble funnet for å oppdage primær TIS, men kunne ikke avsløre intern TIS36. RET binder seg i PTC av bakteriell ribosom, og forhindrer dannelse av den første peptidbindingen ved å forstyrre en langstrakt aminoacyl-tRNA på A-området. Bruk av RET resulterer i ribosomer arrestasjon på både primære og interne TISs34. Onc112, et prolinrikt antimikrobielt peptid, binder seg i utgangstunnelen og blokkerer aminoacyl-tRNA-binding i ribosomal A-området. Som et resultat forhindrer Onc112 initieringskomplekser fra å komme inn i forlengelsesfasen37.
Hovedinformasjonen ribosomeprofilering gir er ribosomer tetthet og deres posisjon på mRNA. Det ble brukt til å undersøke differensialgenuttrykk på oversettelsesnivå under ulike vekstforhold1,6, måle translasjonell effektivitet1,38,39 og oppdage oversettelsesreguleringshendelser som ribosomal pause10. RIBO-seq gjør det også mulig å avdekke oversettelsen av kommenterte ncRNA, pseudogenes og unannotated små åpne leserammer (ORF) som fører til identifisering av nye og / eller svært korte proteinkodingsgener10,12,22,30,37. I slike tilfeller kan RIBO-seq finjustere og forbedre genommerknaden. Med sin høye følsomhet for identifisering av oversatte ORFer og dens kvantitative natur, kan ribosomprofilering også fungere som proxy for proteombestemmelsen eller i å hjelpe proteomikkstudier31,34,39. Ved å kartlegge TIS avslører ribosomprofilering N-terminalt utvidede og avkortede isoformer av kjente proteiner10,32. RIBO-seq ble også tilpasset for å studere samtidig translasjonell folding av proteiner14,21,24. Denne metoden gjør det mulig å måle forlengelseshastigheter1,10,39 eller dekodingshastigheter for individuelle codons6 og hjelper til med å utvikle kvantitative modeller av oversettelse17. Ribosomet profilering metoden er også i stand til å gi mekanistisk innsikt i ribosomet pause i bakterier7,15,17, frameshifting40, stop-codon readthrough21, terminering / resirkulering defekter41,42 og ribosomal konformasjon endringer33 i eukaryoter. RIBO-seq ble også tilpasset for å undersøke effekten av spesifikke transvirkende faktorer på oversettelse som miRNAs6 og RNA-bindende proteiner i eukaryoter16,43. Det er imidlertid viktig å erkjenne at den eksperimentelle utformingen og den oppnådde oppløsningen av RIBO-seq bestemmer mengden informasjon som kan trekkes ut fra de resulterende sekvenseringsdataene12.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10X TBE (powder)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9864</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol, 99%, pure</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>125472500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine 5&#39;-Triphosphate (ATP)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>P0756S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminium oxide calcinated pure p.a.</td>
			<td>Chempur</td>
			<td>114560600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride dihydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C3881-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>190321</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA Clean &#38; Concentrator -5</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>D4004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dnase I recombinant, Rnase-free</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4716728001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA disodium salt</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>E/P140/48</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl Alcohol Absolut 99,8%&#160; Pure-P.A.-Basic</td>
			<td>POCH Avantor Performance Materials Poland S.A</td>
			<td>BA6480111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filtration apparatus</td>
			<td>VWR Collection</td>
			<td>511-0265</td>
			<td>all-glass filtration apparatus, with funnel, fritted base, cap, 47 mm &#216; spring clamp and ground joint flask</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel 40 (19:1)</td>
			<td>Rotiphorese</td>
			<td>3030.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel Loading Dye, Blue, 6X</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E6138G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guanosine 5&#8242;-[&#946;,&#947;-imido]triphosphate trisodium salt hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G0635-25MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>labZAP</td>
			<td>A&#38;A Biotechnology</td>
			<td>040-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium acetate tetrahydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M5661-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MCE membrane fiter</td>
			<td>Alfatec Technology</td>
			<td>M47MCE45GWS</td>
			<td>pore size: 0.45um</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MICROBExpress Bacterial mRNA Purification</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM1905</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiplex Small RNA Library Prep Set for Illumina</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E7300S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-Free Water</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9937</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Acetate Anhydrous Pure P.A.</td>
			<td>POCH Avantor Performance Materials Poland S.A</td>
			<td>744330113</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quick-Load pBR322 DNA-MspI Digest</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E7323A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA Clean &#38; Concentrator -25</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>R1018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2889-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium carbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>223530-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydrogen carbonate pure p.a.</td>
			<td>POCH Avantor Performance Materials Poland S.A</td>
			<td>810530115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR Gold nucleic acid gel stain</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>S11494</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 Polynucleotide Kinase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0201L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 Polynucleotide Kinase Reaction Buffer</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B0201S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBE-Urea Sample Buffer (2x)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>LC6876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris(hydroxymethyl)amino-methane, ultrapure, 99,9%</td>
			<td>AlfaAesar</td>
			<td>J65594</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100, 98%</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>327371000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea G.R.</td>
			<td>lach:ner</td>
			<td>40096-AP0</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ribo-seq in bacteria: a sample collection and library preparation protocol for ngs sequencing

Ribosomets profileringsteknikk (RIBO-seq) er for tiden det mest effektive verktøyet for å studere prosessen med proteinsyntese in vivo. Fordelen med denne metoden, sammenlignet med andre tilnærminger, er dens evne til å overvåke oversettelse ved å kartlegge nøyaktig plasseringen og antall ribosomer på en mRNA-transkripsjon.
I denne artikkelen beskriver vi de påfølgende stadiene av prøveinnsamling og forberedelse for RIBO-seq-metoden i bakterier, og fremhever detaljene som er relevante for planlegging og gjennomføring av eksperimentet.
Siden RIBO-seq er avhengig av intakte ribosomer og relaterte mRNAer, er nøkkeltrinnet rask hemming av oversettelse og tilstrekkelig oppløsning av celler. Dermed foreslår vi filtrering og flash-frysing i flytende nitrogen for cellehøsting med en valgfri forbehandling med kloramfenikol for å arrestere oversettelse i bakterier. For oppløsningen foreslår vi sliping av frosne celler med mørtel og pestle i nærvær av aluminiumoksid for å forstyrre celleveggen mekanisk. I denne protokollen er det ikke nødvendig med sukrosepute eller en sukrose gradient ultracentrifugation for monosom rensing. I stedet påføres mRNA-separasjon ved hjelp av polyakrylamidgelelektroforese (PAGE) etterfulgt av det ribosomale fotavtrykket (28-30 nt-bånd) og gir tilfredsstillende resultater. Dette forenkler i stor grad metoden, samt reduserer tids- og utstyrskravene for prosedyren. For bibliotekforberedelse anbefaler vi at du bruker det kommersielt tilgjengelige lille RNA-settet for Illumina-sekvensering fra New England Biolabs, etter produsentens retningslinjer med en viss grad av optimalisering.
De resulterende cDNA-bibliotekene presenterer passende mengde og kvalitet som kreves for neste generasjons sekvensering (NGS). Sekvensering av bibliotekene utarbeidet i henhold til de beskrevne protokollresultatene i 2 til 10 mln unikt kartlagte lesninger per prøve som gir tilstrekkelige data for omfattende bioinformatisk analyse. Protokollen vi presenterer er rask og relativt enkel og kan utføres med standard laboratorieutstyr.

De eksemplariske resultatene som presenteres her, ble oppnådd i en studie som undersøkte oversettelsesregulering i sporadiske WT Bacillus subtilis-celler. Nattkulturer ble fortynnet til OD600 lik 0,1 i 100 ml rikt medium og inkubert ved 37 °C med kraftig risting til OD600 nådde 0,5-0,6. Det rike mediet ble deretter erstattet med minimalt medium for å indusere sporuleringsprosessen, og inkubasjonen ble videreført i opptil fire timer. Celler ble høstet hver time som begynte med T0 - sp...

Watch this Scientific Journal Video about RIBO-seq in Bacteria: a Sample Collection and Library Preparation Protocol for NGS Sequencing at JoVE.com

RIBO-seq in Bacteria: a Sample Collection and Library Preparation Protocol for NGS Sequencing

Her beskriver vi stadier av prøvetaking og forberedelse for RIBO-seq i bakterier. Sekvensering av bibliotekene utarbeidet i henhold til disse retningslinjene resulterer i tilstrekkelige data for omfattende bioinformatisk analyse. Protokollen vi presenterer er enkel, bruker standard laboratorieutstyr og tar syv dager fra lysis til å skaffe biblioteker.

RIBO-seq i bakterier: en prøvesamling og bibliotekforberedelsesprotokoll for NGS-sekvensering

The ribosome profiling technique (RIBO-seq) is currently the most effective tool for studying the process of protein synthesis in vivo. The advantage of ...

Ribosomets profileringsteknikk, også kalt RIBO-seq, er for tiden det mest effektive verktøyet for å studere prosessen med proteinsyntese in vivo. Fordelen med denne metoden er dens evne til å overvåke oversettelse ved å kartlegge nøyaktig posisjon og antall ribosomer. RIBO-seq er basert på det faktum at ribosomet, ved binding til mRNA-molekylet, beskytter det begravde fragmentet av transkripsjonen ved ribonuklease fordøyelse.De oppnådde fragmentene, kalt ribosomale fotavtrykk, kan sekvenseres og kartlegges på utskriften de stammer fra, noe som resulterer i bestemmelse av ribosomenes nøyaktige posisjon. Samtidig med RIBO-seq utføres total mRNA-sekvensering med høy gjennomstrømning for å gi et referansepunkt og muliggjøre sammenligning av data fra både RIBO-seq og RNA-seq under dataanalyse. Før celler høster, kan du eventuelt legge kloramfenikol til bakteriekulturen, til den endelige konsentrasjonen på 100 mikrogram per milliliter, for å hemme oversettelsen.Inkuber kulturen med antibiotika i ett minutt. Dette trinnet er viktig hvis høsting tar lengre tid enn vanlig, da oversettelsesinhibering gjør det mulig å forlenge prøveinnsamlingstiden. Samle prøvene med et forvarmet filtreringssystem.Du kan introdusere risting for å etterligne vekstforhold. Stopp filtreringen når alle medier har passert gjennom membranen, men ikke la filteret tørke helt. Samle bakterielle pellets ved raskt å skrape cellene av filterskiven ved hjelp av en forvarmet, desinfisert scoopula.Plasser umiddelbart hele scoopulaen med de høstede cellene i 50 milliliterrør fylt med flytende nitrogen. Den høstede pelletsen skal være helt dekket av flytende nitrogen. La pelletsen fryse grundig, og løsne frosne celler ved hjelp av en tidligere avkjølt scoopula.Lukk lokket, og pass på at det er punktert. Dette er viktig, da flytende nitrogen kan føre til at lukkede beholdere eksploderer på grunn av trykkendringen ved fordampning. Forbered GMPP, DNA-vattpinne og ferske Eppendorf-rør dedikert til lysase.Forbered lysisbuffer med tilsetning av kloramfenikol om nødvendig. Tildel 500 mikroliter lysisbuffer per prøve i separate Eppendorf-rør, og legg dem på is. Dekontaminer mørtel og pestle med et laboratoriedesinfeksjonsmiddel og 70% etanol.Kjølig mørtel og pestle ved å helle flytende nitrogen i mørtel. Overfør den frosne bakteriell pellet til en forkjølet mørtel og slip den til et pulver. Tilsett omtrent ett volum aluminiumoksid og fortsett slipingen.Hold mørtel, pestle og cellene avkjøles ved å helle flytende nitrogen når det er nødvendig, for ikke å la innholdet i mørtelet tine. Rett før du bruker, legg til GMPPNP og DNA-vattpinne i lysisbufferen aliquot. Overfør løsningen inn i mørtel og fortsett slipingen.La lysasen tine sakte under sliping. Når lysasen tiner helt, overfør blandingen til det forhåndskjølte Eppendorf-røret og gå tilbake til is. Sentrifuge lysase ved 20.0000 G i fem minutter ved fire Celsius grader.Overfør supernatanter til friske, forhåndskjølte Eppendorf-rør og legg dem på is. Mål RNA-konsentrasjonen i hver fortynnet prøve med NanoDrop. Del hver lysate i to porsjoner, 0,5 til 1 milligram RNA for RIBO-seq, og resten for RNA-seq.Til ett milligram av RNA, tilsett 3,8 mikroliter MNase i Tris pH 8, og fyll den opp med lysisbuffer til det totale volumet på 500 mikroliter. Inkuber ved 25 Celsius grader, 300 runder per minutt, i 45 minutter. Når inkubasjonen er ferdig, rengjør prøvene med et kommersielt tilgjengelig RNA-oppryddingssett.Forbered 15% polyakrylamid TBE gel med åtte molar urea, og legg den i en tank med TBE-buffer. Forløp i minst 10 minutter med en konstant spenning på 200 volt. Bland prøvene med TBE-Urea-prøvebufferen.Denature ved 95 Celsius grader i ett minutt og plasser dem umiddelbart på is. Vask ut urea ved å injisere TBE buffer i gelbrønner ved hjelp av en sprøyte. Last inn prøvene, la det være ett brønnrom mellom dem for å skille hver prøve og forhindre krysskontaminering.Bruk 29 nukleotider-lang oligo, og en blanding av 26 og 32 nukleotider-lange oligos som markører. Kjør elektroforesen med en konstant spenning på 180 volt. Forbered steril buffer for inkubering over natten.Når elektroforesen er ferdig, flekk gelen med SYBR Gold. Excise fragmenter av gelen mellom 26 og 32 nukleotider med en steril nål eller et barberblad, og plasser gelfragmentene i separate Eppendorf rør. Bytt nål eller barberblad mellom prøvene.Tilsett 200 mikroliter inkuberingsbuffer over natten til hver Eppendorf og inkuber prøvene ved 10 Celsius grader, 1000 skudd per minutt, over natten. Neste dag rengjør du prøvene med RNA-oppryddingssett, og unngår dem i 18 mikroliter nukleasefritt vann. De oppnådde ribosomale fotavtrykkene er klare for bibliotekforberedelse.Utfør ribosomal RNA-uttømming for prøver for RNA-seq ved hjelp av et kommersielt tilgjengelig sett. Deretter rengjør du prøvene med RNA-oppryddingssett. Utfør alkalisk hydrolyse som følger;klargjør den alkaliske hydrolysebufferen, tilsett ett volum av bufferen til ett volum av prøven, og inkuber ved 95 Celsius grader i 25 minutter.Tilsett fem mikroliter med 3 Molar natriumacetat pH 5,5 i hver prøve for å stoppe reaksjonen. Rengjør prøvene med RNA-oppryddingssett, og elut dem i 18 mikroliter nukleasefritt vann. Den oppnådde tilfeldig fragmenterte RNA er klar for bibliotekforberedelse.Tilsett 10 mikroliter 10x reaksjonsbuffer og fem mikroliter T4 polynukleotid kinase til hver prøve. Inkuber ved 37 Celsius grader i en og en halv time. Etter denne tiden, legg til tre mikroliter av en millimolar ATP og inkuber ved 37 Celsius grader i en time.Deretter rengjør du prøvene med RNA-oppryddingssett. Utfør bibliotekforberedelse ved hjelp av det kommersielt tilgjengelige settet, i henhold til protokollen som er angitt her. Utfør SIDE med 6 % polyakrylamidgel.Flekk gelen med SYBR Gold. Særskilte gelfragmenter som inneholder bibliotekene. For RNA-seq-prøver er biblioteket mellom 135 og 180 nukleotider, og for RIBO-seq, mellom 135 og 170 nukleotider.Bruk sterile nåler eller barberblader og plasser de utskilte gelfragmentene i separate Eppendorf-rør. Husk å bytte nål eller barberblad mellom prøvene. Tilsett 100 mikroliter nukleasefritt vann til hvert utskilte gelfragment.Og inkuber dem ved 10 Celsius grader, 450 runder per minutt, over natten. Neste dag rengjør du prøvene med DNA-oppryddingssett. De oppnådde bibliotekene er klare for kvalitet og kvantitetskontroll med høy følsomhet, DNA-elektroforese på spon, og deretter for neste generasjons sekvensering.De resulterende cDNA-bibliotekene presenterer en passende mengde og kvalitet som kreves for neste generasjons sekvensering, som verifisert av høy følsomhet, DNA on-chip elektroforese. Bandene og toppene som representerer RIBO-seq-bibliotekene er smalere og bedre definert, sammenlignet med dette som representerer RNA-seq-bibliotekene. Ifølge elektroforesen på brikken har bibliotekene den forventede linsen.De ekstra toppene nærmere 200 basispar til stede i RIBO-seq-biblioteker kan indikere dvalebenosomer, ikke helt fordøyde ribosomale fotavtrykk, eller artefakter, for eksempel rRNA, og kan kastes under bioinformatisk analyse når dataene hentet fra sekvensering er trimmet og rRNA tRNA filtreres. Den gjennomsnittlige mengden cDNA generert i biblioteksforberedelse er 32 nanogram, noe som gir tilstrekkelig mengde materiale som kreves for neste generasjons sekvensering. Etter kvalitetskontroll ved elektroforese på spon ble biblioteker trukket for enkelt- og 50 basisparsekvensering på en Illuminas NextSeq 500-plattform.Trimming av adaptere og sekvenser av dårlig kvalitet resulterte i 25 til 47 millioner leseoperasjoner per prøve for RNA-seq-prøver, og 25 til 50 millioner leseoperasjoner per prøve for RIBO-seq-prøver. De innhentede dataene ble kvalitetskontroll sjekket med FastQC. Både RNA-seq- og RIBO-seq-prøver presenterte meget god kvalitet.Kartlegging av bibliotekene utarbeidet i henhold til den beskrevne protokollen ga 2,4 til 9,6 millioner unikt kartlagte lesninger per prøve for RNA-seq-prøver, og 2,3 til 10,4 millioner unikt kartlagte lesninger for RIBO-seq-prøver. RIBO-seq-data viser tredoblet periodicitet og en høy, smal topp, som tilsvarer de initierende ribososomene og karakteristiske for ribosomale fotavtrykk, som ikke observeres i RNA-seq-dataene. Videre viser plottet profiler av gjennomsnittlig dekning av ribosomale fotavtrykk og mRNA-fragmenter på kodesekvensene, den høyere andelen av avlesninger kartlagt til CDS-ene i RIBO-seq-datasettet, som forventet.Visualiseringen av de kartlagte ribosomale fotavtrykkene viste svært like mønstre sammenlignet med resultatene oppnådd fra det samme eksperimentet utført tilsvarende standard RIBO-seq-prosedyre, som inkluderer monosom utvinning ved sukrose gradient ultracentrifugation. Vår protokoll har blitt brukt til å undersøke oversettelsesregulering under ulike vekstforhold, men kan brukes til å studere andre aspekter ved oversettelse, som deteksjon av oversettelsesstartsteder og nye proteinkodingsgener. Sekvensering av bibliotekene utarbeidet i henhold til våre retningslinjer resulterer i tilstrekkelige data for omfattende bioinformatisk analyse.Protokollen vi presenterer her er rask, enkel og kostnadseffektiv, og kan utføres med standard laboratorieutstyr.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

Eksempel forberedelse til masse massespektrometri-baserte identifikasjon av RNA-bindende områder

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

An All-in-one Sample Holder for Macromolecular X-ray Crystallography with Minimal Background Scattering

En alt-i-ett sample holder for makro molekylære X-ray Crystallography med minimal bakgrunn spredning

Macromolecular X-ray crystallography (MX) is the most prominent method to obtain high-resolution three-dimensional knowledge of biological macromolecules. ...

A Plasma Sample Preparation for Mass Spectrometry using an Automated Workstation

En plasmaprøve forberedelse for massespektrometri ved hjelp av en automatisert arbeidsstasjon

Sample preparation for mass spectrometry analysis in proteomics requires enzymatic cleavage of proteins into a peptide mixture. This process involves ...

Sample Preparation for Probe Electrospray Ionization Mass Spectrometry

Prøve forberedelse til sonde elektrospray ionisering massespektrometri

Mass spectrometry (MS) is a powerful tool in analytical chemistry because it provides very accurate information about molecules, such as mass-to-charge ...

TMT Sample Preparation for Proteomics Facility Submission and Subsequent Data Analysis

TMT Prøve forberedelse for proteomics facility innsending og påfølgende dataanalyse

Proteomic technologies are powerful methodologies that can aid our understanding of mechanisms of action in biological systems by providing a global view ...

MS2-Affinity Purification Coupled with RNA Sequencing in Gram-Positive Bacteria

MS2-affinitetsrensing kombinert med RNA-sekvensering i Gram-positive bakterier

Although small regulatory RNAs (sRNAs) are widespread among the bacterial domain of life, the functions of many of them remain poorly characterized ...

NMR-Based Fragment Screening in a Minimum Sample but Maximum Automation Mode

NMR-basert fragmentscreening i et minimumsutvalg, men maksimal automatiseringsmodus

Fragment-based screening (FBS) is a well-validated and accepted concept within the drug discovery process both in academia and industry. The greatest ...

A Sample Preparation Pipeline for Microcrystals at the VMXm Beamline

En prøveforberedelsesrørledning for mikrokrystaller ved VMXm-strålelinjen

The mounting of microcrystals (&#60;10 &#181;m) for single crystal cryo-crystallography presents a non-trivial challenge. Improvements in data quality ...

Sample Preparation and Transfer Protocol for In-Vacuum Long-Wavelength Crystallography on Beamline I23 at Diamond Light Source

Prøvepreparerings- og overføringsprotokoll for langbølgelengdekrystallografi i vakuum på beamline I23 ved diamantlyskilde

Long-wavelength macromolecular crystallography (MX) exploits the anomalous scattering properties of elements, such as sulfur, phosphorus, potassium, ...

Preparation of High-Temperature Sample Grids for Cryo-EM

Klargjøring av høytemperatur prøvegitter for Cryo-EM

The sample grids for cryo-electron microscopy (cryo-EM) experiments are usually prepared at a temperature optimal for the storage of biological samples, ...