Name: ribo-seq in bacteria: a sample collection and library preparation protocol for ngs sequencing
Uploaded: 2021-08-07T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about RIBO-seq in Bacteria: a Sample Collection and Library Preparation Protocol for NGS Sequencing at JoVE.com

A ALS gostaria de reconhecer o apoio financeiro dos subsídios de instalação da EMBO IG 3914 e da POIR. 04.04.00-00-3E9C/17-00 realizado no programa First TEAM da Fundação para a Ciência Polonesa co-financiado pela União Europeia no âmbito do Fundo Europeu de Desenvolvimento Regional.

1. Coleta de amostras
<ol><li>Prepare uma cultura bacteriana. Recomendamos um volume cultural de 100 mL por amostra.</li>
	<li>Preparar equipamentos e reagentes para coleta de amostras: duas scoopulas por amostra, filtros de membrana de ésteres de celulose mista (MCE) de 0,45 μm, tubos estéreis de 50 mL, nitrogênio líquido, 50 mg/mLram clorofenicol em 70% (vol/vol) de etanol (opcional). Puna a tampa de tubos de 50 mL para permitir a evaporação de nitrogênio líquido e evitar a explosão de tubos fechados. Desco...

O principal desafio técnico do perfil ribossomo é a necessidade de inibir rapidamente a tradução para capturar um instantâneo de ribossomos em mRNAs em um determinado estado fisiológico de interesse. Para isso, inibidores de tradução, colheita rápida e congelamento de flash em nitrogênio líquido são comumente usados. A aplicação de antibióticos é opcional, pois podem causar artefatos. Chloramphenicol é uma droga comumente usada para prender ribossomos alongamentos em RIBO-seq bacteriana. No entanto, não...

A técnica de perfil ribossomo (RIBO-seq) foi desenvolvida no laboratório de Jonathan Weissman na Universidade da Califórnia, São Francisco1. Em comparação com outros métodos usados para estudar a expressão genética no nível translacional, RIBO-seq concentra-se em cada ligação ribossosome ao mRNA e fornece informações sobre sua localização e o número relativo de ribossomos em uma transcrição. Permite monitorar o processo de síntese proteica in vivo e pode fornecer resolução e precisão de códon único permitindo a medição da densidade ribossomo em ambos, o mRNA individual e ao longo de todo o transcriptome na célula. Na base da técnica RIBO-seq está o fato de que durante a tradução o ribossomo liga a molécula de mRNA e, assim, protege o fragmento enterrado da transcrição de uma digestão ribonuclease. Após a adição da ribonuclease, o mRNA desprotegido é digerido e os fragmentos fechados por ribossomos - tipicamente de ~28-30 nt de comprimento - permanecem intactos. Esses fragmentos, chamados pegadas ribossômicas (RF), podem então ser isolados, sequenciados e mapeados na transcrição de que se originaram resultando na detecção da posição exata dos ribossomos. De fato, a capacidade ribossômica de proteger fragmentos de mRNA tem sido usada desde a década de 1960 para estudar os locais de iniciação de ligação ribossômica e tradução (TIS)2,3,4. No entanto, com o avanço da tecnologia de sequenciamento profundo, o RIBO-seq tornou-se um padrão ouro para o monitoramento de tradução5 que, através do engajamento ribossomo, pode fornecer uma informação em todo o genoma sobre asíntese deproteínas 6 . O perfil ribossomo preencheu a lacuna tecnológica existente entre quantificar o transcriptome e o proteome6.
Para realizar o perfil ribossomo precisamos obter lisecelulares do organismo que cresceu sob as condições investigadas. Interromper essas condições durante a coleta e lise celular pode fornecer dados não confiáveis. Para evitar isso, inibidores de tradução, colheita rápida e congelamento de flash em nitrogênio líquido são comumente usados. As células podem ser lístidas pela moagem criogênica em um homogeneizador mecânico como um moinho de batedeira7,8 ou um batedor de contas9, e por trituração através de uma pipeta10 ou com uma agulha11. O tampão de lise pode ser adicionado pouco antes ou pouco depois da pulverização das células. Em nosso protocolo usamos nitrogênio líquido para argamassa pré-colono e pilão, bem como óxido de alumínio como uma abordagem mais suave para a interrupção da parede celular bacteriana, o que impede a tesoura de RNA frequentemente encontrada quando métodos como a sonificação são aplicados. Após a pulverização, adicionamos um tampão de lise gelada no conteúdo resfriado da argamassa. A seleção de um tampão de lise apropriado é importante para obter a melhor resolução de pegadas ribossômicas. Uma vez que a força iônica afeta tanto o tamanho do RF quanto a precisão do quadro de leitura, recomenda-se atualmente o uso de tampões de lise com baixa resistência iônica e capacidade de tampão, mesmo que pareça que a composição do buffer não afeta a ocupação ribossômica em mRNAs11,12. Componentes importantes do tampão de lise são íons de magnésio, a presença que impede a dissociação das subunidades ribossômicas e inibe alterações conformais espontâneas nos ribossomos bacterianos11,13. Os íons de cálcio também desempenham um papel significativo e são essenciais para a atividade da nuclease microcócica (MNase) utilizada no método de perfil ribossomo bacteriano14. Adição de guanosina 5′-[β,γ-imido]triphosfato (GMP-PNP), um análogo não hidroglizável do GTP, juntamente com o clorofenicol inibe a tradução durante a lise15.
Quando o lisato é obtido, ele é esclarecido por centrifugação e dividido em duas porções, cada uma para um RIBO-seq e um sequenciamento de mRNA total de alta produtividade (RNA-seq) uma vez que são realizados simultaneamente(Figura 1). O RNA-seq fornece um ponto de referência que permite a comparação de dados tanto do RIBO-seq quanto do RNA-seq durante a análise dos dados. O translatome investigado é definido pela normalização das pegadas ribossômicas à abundância de mRNA16. Os dados do RNA-seq também podem ajudar a identificar a clonagem ou sequenciamento de artefatos17.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62544/62544fig01.jpg"> Figura 1. Esquemas de preparação de amostras de mRNA para RIBO-seq e RNA-seq. Para a preparação da biblioteca RIBO-seq, o RNA é digerido com MNase (A), seguido pela seleção de tamanho de RF de ~28-30 nt de comprimento (B); para RNA-seq RNA é isolado (C), esgotado de rRNA (D), e o mRNA resultante é aleatoriamente fragmentado em fragmentos de comprimentos variados (E). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62544/62544fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
As etapas iniciais do procedimento de preparação da amostra para RIBO-seq e RNA-seq diferem ligeiramente(Figura 1). Para o perfil ribossômico, o liseto precisa ser digerido por uma endonuclease específica para degradar as moléculas de mRNA não protegidas pelos ribossomos. Nos protocolos padrão, os monossomos obtidos são recuperados por uma ultracentrifugação de almofada de sacarose ou uma ultracentrifugação de gradiente de sacarose8,14. Neste artigo, mostramos que esta etapa não é necessária para isolar a RF necessária para o RIBO-seq em bactérias, da mesma forma para as células eucarióticas18, e que a seleção de tamanho dos fragmentos de comprimento apropriado do gel de poliacrilamida é suficiente.
Para RNA-seq, o mRNA é obtido pelo esgotamento do rRNA do total de moléculas de RNA - rRNA hibridizem-se às sondas oligonucleotidas biotinínas que se ligam às contas magnéticas revestidas de streptavidin. Os complexos rRNA-oligonucleotídeo-contas são então removidos da amostra com um ímã resultando em uma amostra esgotada de rRNA19,20. As moléculas de mRNA purificadas são então fragmentadas aleatoriamente por hidrólise alcalina. Os fragmentos obtidos de mRNA, bem como as pegadas ribossômicas são convertidos em bibliotecas cDNA e preparados para sequenciamento profundo(Figura 2). Isso envolve o reparo necessário após a hidrólise alcalina (para mRNA) e digestão enzimática (para RF): desfosforilação de extremidades de 3' seguida de fosforilação de extremidades de 5'. Os próximos passos são a ligadura dos adaptadores e a transcrição reversa para criar inserções cDNA emolduradas por sequências necessárias para o sequenciamento de próxima geração (NGS) usando a plataforma Illumina. A última fase da preparação da biblioteca é uma reação pcr na qual os construtos são amplificados e rotulados com códigos de barras específicos de amostra para permitir multiplexagem e sequenciamento de várias amostras em um único canal. Antes do sequenciamento, a qualidade e a quantidade das bibliotecas são avaliadas pelo DNA de alta sensibilidade na eletroforese do chip. bibliotecas cDNA com parâmetros apropriados podem então ser agrupadas e sequenciadas. O sequenciamento pode ser realizado em diferentes plataformas de Illumina, como MiSeq, NextSeq ou HighSeq, dependendo do número de bibliotecas, comprimento de leitura necessário e profundidade de sequenciamento. Após o sequenciamento, a análise bioinformática é realizada.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62544/62544fig02.jpg"> Figura 2. Preparação da biblioteca. A preparação da biblioteca inclui o reparo de extremidades, ligadura dos adaptadores, transcrição reversa e amplificação com codificação de barras. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62544/62544fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
O perfil ribossomo é um método universal que pode ser facilmente modificado e ajustado de acordo com a questão científica. Originalmente foi usado na levedura1, mas logo depois foi aplicado às células bacterianas21, bem como organismos modelo eucarióticos, incluindo camundongos10,zebrafish22, mosca de frutas23 e Arabidopsis thaliana24. Também foi utilizado para o estudo de diferentes tipos ribossósmicos: citoplasmásmico, mitocondrial25,26 e cloroplasto27,28. Em eucariotes RIBO-seq é comumente adaptado e refinado para investigar aspectos específicos da tradução, incluindo iniciação10,11,29,30,31,32, alongamento1,10,11,31,33, ribossomo parando33 e alteração de conformação33. A maioria das modificações envolve o uso de diferentes inibidores de tradução. No entanto, nas bactérias, estudos análogos têm sido difíceis de realizar devido à escassez de inibidores com o mecanismo de ação necessário34. O inibidor de tradução mais usado em bactérias é o clorofífenicol (CAM), que se liga ao centro de transferência de peptidyl (PTC) e impede o posicionamento correto do aminoacílico-tRNA no local A. Como resultado, cam impede a formação de um vínculo peptídeo que leva à prisão dos ribossomosalongamentos 35. Outros exemplos de inibidores de tradução em bactérias são a tetraciclina (TET)36, retapamulina (RET)34 e Onc11237 que foram usados para investigar sites de iniciação de tradução. O TET, que impede a entrega de tRNA ao ribossomo, sobrepondo-se diretamente com o loop anticodon de tRNA no local A, foi originalmente aplicado para verificar os resultados obtidos do tratamento CAM, uma vez que ambos são antibióticos inibindo a alongamento da tradução38. Foi encontrado tet para detectar TIS primário, no entanto foi incapaz de revelar TIS36interno . RET se liga no PTC do ribossomo bacteriano, e impede a formação da primeira ligação de peptídeo interferindo com um alongador aminoacyl-tRNA no site A. A aplicação de RET resulta em prisão de ribossomos tanto nas TISs primárias quanto internas34. Onc112, um peptídeo antimicrobiano rico em proline, liga-se no túnel de saída e bloqueia a ligação aminoacíl-tRNA no local ribossômico A. Como resultado, o Onc112 impede que os complexos de iniciação entrem na fase de alongamento37.
A principal informação que o perfil ribossomo fornece é a densidade de ribossomos e sua posição no mRNA. Foi aplicado com sucesso para investigar a expressão genética diferencial no nível da tradução em várias condições de crescimento1,6, medir a eficiência translacional1,38,39 e detectar eventos de regulação de tradução, como a pausa ribossômica10. RIBO-seq também permite descobrir a tradução de ncRNA anotado, pseudogenes e pequenos quadros de leitura abertos não anotados (ORF) levando à identificação de genes de codificação de proteínas novos e/ou muito curtos10,12,22,30,37. Nesses casos, ribo-seq pode ajustar e melhorar a anotação do genoma. Com sua alta sensibilidade para a identificação de ORFs traduzidos e sua natureza quantitativa, o perfil ribossomo também pode servir como proxy para a determinação proteome ou para auxiliar estudos de proteômica31,34,39. Ao mapear o TIS, o perfil ribossomo revela isóformes n-terminalmente estendidos e truncados de proteínas conhecidas10,32. RIBO-seq também foi adaptado para estudar o dobrável co-translacional das proteínas14,21,24. Este método permite medir as taxas de alongamento1,10,39 ou velocidades de decodificação de códons individuais6 e ajuda no desenvolvimento de modelos quantitativos de tradução17. O método de criação de perfil ribossomo também é capaz de fornecer insights mecanicistas sobre a pausa ribossa em bactérias7,15,17, frameshifting40, stop-codon readthrough21, defeitos de terminação/reciclagem41,42 e alterações de conformação ribossômica33 em eucariotos. RIBO-seq também foi adaptado para examinar o impacto de fatores trans-acionados específicos na tradução, como miRNAs6 e proteínas de ligação de RNA em eucariotes16,43. No entanto, é importante reconhecer que o projeto experimental e a resolução obtida do RIBO-seq determinam a quantidade de informações que podem ser extraídas dos dados de sequenciamentoresultantes 12.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10X TBE (powder)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9864</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol, 99%, pure</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>125472500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine 5&#39;-Triphosphate (ATP)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>P0756S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminium oxide calcinated pure p.a.</td>
			<td>Chempur</td>
			<td>114560600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride dihydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C3881-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>190321</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA Clean &#38; Concentrator -5</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>D4004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dnase I recombinant, Rnase-free</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4716728001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA disodium salt</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>E/P140/48</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl Alcohol Absolut 99,8%&#160; Pure-P.A.-Basic</td>
			<td>POCH Avantor Performance Materials Poland S.A</td>
			<td>BA6480111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filtration apparatus</td>
			<td>VWR Collection</td>
			<td>511-0265</td>
			<td>all-glass filtration apparatus, with funnel, fritted base, cap, 47 mm &#216; spring clamp and ground joint flask</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel 40 (19:1)</td>
			<td>Rotiphorese</td>
			<td>3030.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel Loading Dye, Blue, 6X</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E6138G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guanosine 5&#8242;-[&#946;,&#947;-imido]triphosphate trisodium salt hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G0635-25MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>labZAP</td>
			<td>A&#38;A Biotechnology</td>
			<td>040-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium acetate tetrahydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M5661-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MCE membrane fiter</td>
			<td>Alfatec Technology</td>
			<td>M47MCE45GWS</td>
			<td>pore size: 0.45um</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MICROBExpress Bacterial mRNA Purification</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM1905</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiplex Small RNA Library Prep Set for Illumina</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E7300S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-Free Water</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9937</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Acetate Anhydrous Pure P.A.</td>
			<td>POCH Avantor Performance Materials Poland S.A</td>
			<td>744330113</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quick-Load pBR322 DNA-MspI Digest</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E7323A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA Clean &#38; Concentrator -25</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>R1018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2889-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium carbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>223530-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydrogen carbonate pure p.a.</td>
			<td>POCH Avantor Performance Materials Poland S.A</td>
			<td>810530115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR Gold nucleic acid gel stain</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>S11494</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 Polynucleotide Kinase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0201L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 Polynucleotide Kinase Reaction Buffer</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B0201S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBE-Urea Sample Buffer (2x)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>LC6876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris(hydroxymethyl)amino-methane, ultrapure, 99,9%</td>
			<td>AlfaAesar</td>
			<td>J65594</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100, 98%</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>327371000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea G.R.</td>
			<td>lach:ner</td>
			<td>40096-AP0</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ribo-seq in bacteria: a sample collection and library preparation protocol for ngs sequencing

A técnica de criação de perfil ribossomo (RIBO-seq) é atualmente a ferramenta mais eficaz para estudar o processo de síntese proteica in vivo. A vantagem deste método, em comparação com outras abordagens, é sua capacidade de monitorar a tradução mapeando precisamente a posição e o número de ribossomos em uma transcrição mRNA.
Neste artigo, descrevemos as etapas consecutivas de coleta e preparação da amostra para o método RIBO-seq em bactérias, destacando os detalhes relevantes para o planejamento e execução do experimento.
Uma vez que o RIBO-seq conta com ribossomos intactos e mRNAs relacionados, o passo chave é a rápida inibição da tradução e a desintegração adequada das células. Assim, sugerimos filtração e congelamento de flash em nitrogênio líquido para colheita celular com um pré-tratamento opcional com clororamfenícol para prender a tradução em bactérias. Para a desintegração, propomos moer células congeladas com argamassa e pilão na presença de óxido de alumínio para interromper mecanicamente a parede celular. Neste protocolo, não é necessária uma almofada de sacarose ou uma ultracentrifugação gradiente de sacarose para purificação monossótil. Em vez disso, a separação mRNA usando eletroforese de gel de poliacrilamida (PAGE) seguida pela excisão da pegada ribossômica (banda 28-30 nt) é aplicada e fornece resultados satisfatórios. Isso simplifica em grande parte o método, bem como reduz os requisitos de tempo e equipamento para o procedimento. Para a preparação da biblioteca, recomendamos usar o kit RNA pequeno disponível comercialmente para sequenciamento de illumina da New England Biolabs, seguindo as diretrizes do fabricante com algum grau de otimização.
As bibliotecas cDNA resultantes apresentam quantidade e qualidade adequadas para o sequenciamento de próxima geração (NGS). O sequenciamento das bibliotecas preparadas de acordo com os resultados do protocolo descrito em leituras mapeadas exclusivamente por amostra fornece dados suficientes para análise bioinformática abrangente. O protocolo que apresentamos é rápido e relativamente fácil e pode ser realizado com equipamentos de laboratório padrão.

Os resultados exemplares aqui apresentados foram obtidos em estudo que examinou a regulação da tradução na esporosulação das células subtilis WT Bacillus. As culturas durante a noite foram diluídas para OD600 igual a 0,1 em 100 mL de médio rico e incubadas a 37 °C com agitação vigorosa até OD600 atingir 0,5-0,6. O meio rico foi então substituído por meio mínimo para induzir processo de esporulação e a incubação foi continuada por até quatro horas. As células eram colhi...

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RIBO-seq in Bacteria: a Sample Collection and Library Preparation Protocol for NGS Sequencing

Aqui descrevemos os estágios de coleta e preparação da amostra para RIBO-seq em bactérias. O sequenciamento das bibliotecas preparadas de acordo com essas diretrizes resulta em dados suficientes para análise bioinformática abrangente. O protocolo que apresentamos é simples, utiliza equipamentos de laboratório padrão e leva sete dias desde a lise até a obtenção de bibliotecas.

RIBO-seq em Bactérias: um Protocolo de Coleta de Amostras e Preparação de Bibliotecas para Sequenciamento NGS

The ribosome profiling technique (RIBO-seq) is currently the most effective tool for studying the process of protein synthesis in vivo. The advantage of ...

A técnica de perfil ribossomo, também chamada RIBO-seq, é atualmente a ferramenta mais eficaz para estudar o processo de síntese proteica in vivo. A vantagem deste método é sua capacidade de monitorar a tradução mapeando precisamente a posição e o número de ribossomos. RIBO-seq baseia-se no fato de que o ribossomo, ao ligar-se à molécula de mRNA, protege o fragmento enterrado da transcrição após a digestão da ribonuclease.Os fragmentos obtidos, chamados pegadas ribossômicas, podem ser sequenciados e mapeados na transcrição de onde se originaram, resultando na determinação da posição exata dos ribossomos. Simultaneamente ao sequenciamento de mRNA total de rendimento ribo-seq é realizado para fornecer um ponto de referência e permitir a comparação de dados tanto de RIBO-seq quanto RNA-seq durante a análise de dados. Antes da colheita das células, você pode adicionar cloreto de memória à cultura bacteriana, à concentração final de 100 microgramas por mililitro, para inibir a tradução.Incubar a cultura com o antibiótico por um minuto. Este passo é importante se a colheita demorar mais do que o habitual, pois a inibição da tradução permite estender o tempo de coleta da amostra. Colete as amostras com um sistema de filtragem pré-aquecido.Você pode introduzir agitação a fim de imitar as condições de crescimento. Pare de filtrar quando todas as mídias passarem pela membrana, mas não deixe o filtro secar completamente. Colete pelotas bacterianas raspando rapidamente as células do disco do filtro usando uma scoopula pré-aquecida e desinfetada.Coloque imediatamente toda a scoopula com as células colhidas em tubo de 50 mililitros cheio de nitrogênio líquido. A pelota colhida deve ser completamente coberta de nitrogênio líquido. Deixe a pelota congelar completamente, e desaloja as células congeladas usando uma scoopula previamente resfriada.Feche a tampa e certifique-se de que está perfurada. Isso é importante, pois o nitrogênio líquido pode causar a explosão de recipientes fechados devido à mudança de pressão sobre a evaporação. Prepare GMPP, cotonete de DNA e tubos Eppendorf frescos dedicados à lise.Prepare o tampão de lise com a adição de clorofífenicol, se necessário. Aloque 500 microlitadores de tampão de lise por amostra em tubos Eppendorf separados e coloque-os no gelo. Descontaminar argamassa e pilão com desinfetante laboratorial e 70% etanol.Argamassa fria e pilão despejando nitrogênio líquido na argamassa. Transfira a pelota bacteriana congelada em uma argamassa pré-refrigerada e moa-a em pó. Adicione aproximadamente um volume de óxido de alumínio e continue moendo.Mantenha argamassa, pilão e as células esfriam derramando nitrogênio líquido quando necessário, para não deixar o conteúdo da argamassa descongelar. Pouco antes de usar, adicione o cotonete GMPPNP e o DNA na alíquota do tampão de lise. Transfira a solução para a argamassa e continue moendo.Deixe o degelo de lise lentamente enquanto moe. Quando a lise descongelar completamente, transfira a mistura para o tubo Eppendorf pré-refrigerado e retorne ao gelo. Centrifuge lysase a 20.0000 G por cinco minutos a quatro graus Celsius.Transfira supernantes em tubos Eppendorf frescos e pré-refrigerados e coloque-os no gelo. Meça a concentração de RNA em cada amostra diluída com NanoDrop. Divida cada lise em duas porções, 0,5 a 1 miligrama de RNA para RIBO-seq, e o resto para RNA-seq.A um miligrama do RNA, adicione 3,8 microliters de MNase em Tris pH 8, e cubra-o com tampão de lise ao volume total de 500 microliters. Incubar a 25 graus Celsius, 300 balas por minuto, durante 45 minutos. Quando a incubação estiver concluída, limpe as amostras com um kit de limpeza de RNA disponível comercialmente.Prepare 15% de gel TBE de poliacrilamida com oito ureia molar, e coloque-o em um tanque com tampão TBE. Pré-executar por um mínimo de 10 minutos em uma tensão constante de 200 volts. Misture as amostras com o tampão de amostra TBE-Urea.Denture a 95 graus Celsius por um minuto e colocá-los imediatamente no gelo. Lave a ureia injetando tampão TBE em poços de gel usando uma seringa. Carregue as amostras, deixando um bom espaço entre elas para separar cada amostra e evitar contaminação cruzada.Use 29 oligo de nucleotídeos de comprimento, e uma mistura de oligos de 26 e 32 nucleotídeos como marcadores. Execute a eletroforese a uma tensão constante de 180 volts. Prepare o tampão estéril para a incubação durante a noite.Uma vez que a eletroforese esteja terminada, manche o gel com SYBR Gold. Fragmentos de imposto de consumo do gel entre 26 e 32 nucleotídeos com uma agulha estéril ou uma lâmina de barbear, e coloquem os fragmentos de gel em tubos separados de Eppendorf. Troque a agulha ou a lâmina entre as amostras.Adicione 200 microliters de tampão de incubação durante a noite a cada Eppendorf e incubar as amostras a 10 graus Celsius, 1000 rodadas por minuto, durante a noite. No dia seguinte, limpe as amostras com o kit de limpeza de RNA, e elute-as em 18 microliters de água sem nuclease. As pegadas ribossômicas obtidas estão prontas para a preparação da biblioteca.Realize o esgotamento do RNA ribossômico para amostras de RNA-seq usando um kit comercialmente disponível. Em seguida, limpe as amostras com o kit de limpeza do RNA. Realize a hidrólise alcalina da seguinte forma; prepare o tampão de hidrólise alcalina, adicione um volume do buffer a um volume da amostra e incubar a 95 graus Celsius por 25 minutos.Adicione cinco microliters de 3 acetato de sódio molar pH 5.5 a cada amostra, a fim de parar a reação. Limpe as amostras com kit de limpeza de RNA e estoque-as em 18 microliters de água sem nuclease. O RNA fragmentado aleatoriamente obtido está pronto para a preparação da biblioteca.Adicione 10 microliters de tampão de reação de 10x e cinco microliters de t4 polinucleotídeo quinase a cada amostra. Incubar a 37 graus Celsius por uma hora e meia. Após este tempo, adicione três microliters de um ATP mililitro e incubar a 37 graus Celsius por uma hora.Em seguida, limpe as amostras com o kit de limpeza do RNA. Realize a preparação da biblioteca usando o kit comercialmente disponível, de acordo com o protocolo aqui fornecido. Execute PAGE usando gel de poliacrilamida de 6%.Manche o gel com SYBR Gold. Fragmentos de gel de impostos contendo as bibliotecas. Para amostras de RNA-seq, a biblioteca tem entre 135 e 180 nucleotídeos, e para RIBO-seq, entre 135 e 170 nucleotídeos.Use agulhas estéreis ou lâminas de barbear e coloque os fragmentos de gel excisados em tubos Eppendorf separados. Lembre-se de trocar a agulha ou a lâmina entre as amostras. Adicione 100 microliters de água sem nuclease a cada fragmento de gel excisado.E incuba-los a 10 graus Celsius, 450 balas por minuto, durante a noite. No dia seguinte, limpe as amostras com kit de limpeza de DNA. As bibliotecas obtidas estão prontas para controle de qualidade e quantidade com alta sensibilidade, eletroforese de DNA no chip e, em seguida, para sequenciamento de próxima geração.As bibliotecas cDNA resultantes apresentam uma quantidade e qualidade adequadas para o sequenciamento de próxima geração, conforme verificado pela alta sensibilidade, eletroforese de DNA no chip. As bandas e picos que representam as bibliotecas RIBO-seq são mais estreitos e melhor definidos, em comparação com isso representando as bibliotecas RNA-seq. De acordo com a eletroforese no chip, as bibliotecas têm a lente esperada.Os picos adicionais mais próximos de 200 pares de base presentes nas bibliotecas RIBO-seq podem indicar ribossomos hibernando, pegadas ribossômicas completamente digeridas, ou artefatos, por exemplo, rRNA, e podem ser descartados durante a análise bioinformática quando os dados obtidos a partir do sequenciamento são aparados e o tRNA rRNA é filtrado. A quantidade média de cDNA gerada na preparação da biblioteca é de 32 nanogramas, fornecendo quantidade suficiente de material necessária para o sequenciamento de próxima geração. Após o controle de qualidade por eletroforese on-chip, as bibliotecas foram puxadas para sequenciamento de pares de base simples e 50 na plataforma NextSeq 500 de uma Illumina.A aparação dos adaptadores e sequências de baixa qualidade resultou em 25 a 47 milhões de leituras por amostra para amostras de RNA-seq, e de 25 a 50 milhões de leituras por amostra para amostras de RIBO seq. Os dados obtidos foram verificados com o FastQC. Ambas as amostras de RNA-seq e RIBO-seq apresentaram uma qualidade muito boa.O mapeamento das bibliotecas preparadas de acordo com o protocolo descrito rendeu de 2,4 a 9,6 milhões de leituras exclusivamente mapeadas por amostra para amostras de RNA-seq, e de 2,3 a 10,4 milhões de leituras exclusivamente mapeadas para amostras de RIBO-seq. Os dados ribo-seq exibem periodicidade triplicada e um pico alto e estreito, correspondente aos ribossomos iniciados e característicos das pegadas ribossômicas, o que não é observado nos dados do RNA-seq. Além disso, o enredo que mostra os perfis de cobertura média de pegadas ribossômicas e fragmentos de mRNA nas sequências de codificação revela a maior proporção de leituras mapeadas para os CDS no conjunto de dados RIBO-seq, como esperado.A visualização das pegadas ribossômicas mapeadas mostrou padrões muito semelhantes em comparação com os resultados obtidos a partir do mesmo experimento realizado em conformidade com o procedimento ribo-seq padrão, que inclui recuperação monossóica por ultracentrifugação de gradiente de sacarose. Nosso protocolo tem sido usado para investigar a regulação da tradução em várias condições de crescimento, mas pode ser aplicado para estudar outros aspectos da tradução, como a detecção de sites de iniciação de tradução e novos genes de codificação de proteínas. O sequenciamento das bibliotecas preparadas de acordo com nossas diretrizes resulta em dados suficientes para análise bioinformática abrangente.O protocolo que apresentamos aqui é rápido, fácil e econômico, e pode ser realizado com equipamentos de laboratório padrão.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

Preparação da amostra para identificação de espectrometria de massa-baseada das regiões de ligação de RNA

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

Bioquímica

An All-in-one Sample Holder for Macromolecular X-ray Crystallography with Minimal Background Scattering

Um suporte de amostra tudo-em-um para a cristalografia macromolecular do raio X com espalhamento mínimo do fundo

Macromolecular X-ray crystallography (MX) is the most prominent method to obtain high-resolution three-dimensional knowledge of biological macromolecules. ...

A Plasma Sample Preparation for Mass Spectrometry using an Automated Workstation

Uma preparação de amostra de plasma para espectrometria de massa usando uma estação de trabalho automatizada

Sample preparation for mass spectrometry analysis in proteomics requires enzymatic cleavage of proteins into a peptide mixture. This process involves ...

Sample Preparation for Probe Electrospray Ionization Mass Spectrometry

Preparação de amostras para espectrometria de ionização de eletrospray de sonda

Mass spectrometry (MS) is a powerful tool in analytical chemistry because it provides very accurate information about molecules, such as mass-to-charge ...

TMT Sample Preparation for Proteomics Facility Submission and Subsequent Data Analysis

Preparação da amostra TMT para envio de instalações proteômicas e análise de dados subsequentes

Proteomic technologies are powerful methodologies that can aid our understanding of mechanisms of action in biological systems by providing a global view ...

MS2-Affinity Purification Coupled with RNA Sequencing in Gram-Positive Bacteria

Purificação de Afinidade MS2 juntamente com sequenciamento de RNA em bactérias gram-positivas

Although small regulatory RNAs (sRNAs) are widespread among the bacterial domain of life, the functions of many of them remain poorly characterized ...

NMR-Based Fragment Screening in a Minimum Sample but Maximum Automation Mode

Triagem de fragmentos baseada em RMN em uma amostra mínima, mas no modo de automação máxima

Fragment-based screening (FBS) is a well-validated and accepted concept within the drug discovery process both in academia and industry. The greatest ...

A Sample Preparation Pipeline for Microcrystals at the VMXm Beamline

Um pipeline de preparação de amostras para microcristais na linha de feixe VMXm

The mounting of microcrystals (&#60;10 &#181;m) for single crystal cryo-crystallography presents a non-trivial challenge. Improvements in data quality ...

Sample Preparation and Transfer Protocol for In-Vacuum Long-Wavelength Crystallography on Beamline I23 at Diamond Light Source

Protocolo de preparação e transferência de amostras para cristalografia de comprimento de onda longa no vácuo na linha de luz I23 na Fonte de Luz de Diamante

Long-wavelength macromolecular crystallography (MX) exploits the anomalous scattering properties of elements, such as sulfur, phosphorus, potassium, ...

Preparation of High-Temperature Sample Grids for Cryo-EM

Preparação de grades de amostras de alta temperatura para crio-EM

The sample grids for cryo-electron microscopy (cryo-EM) experiments are usually prepared at a temperature optimal for the storage of biological samples, ...