Name: ribo-seq in bacteria: a sample collection and library preparation protocol for ngs sequencing
Uploaded: 2021-08-07T14:00:00
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ALS desea agradecer el apoyo financiero de EMBO Installation Grants IG 3914 y POIR. 04.04.00-00-3E9C/17-00 realizado en el marco del programa First TEAM de la Fundación para la Ciencia Polaca cofinanciado por la Unión Europea con cargo al Fondo Europeo de Desarrollo Regional.

1. Recogida de muestras
<ol><li>Preparar un cultivo bacteriano. Recomendamos un volumen de cultivo de 100 mL por muestra.</li>
	<li>Preparar equipos y reactivos para la recolección de muestras: dos scápulas por muestra, filtros estériles de membrana de ésteres de celulosa (MCE) mixtos de 0,45 μm, tubos estériles de 50 mL, nitrógeno líquido, 50 mg/mL de cloranfenicol en etanol al 70% (vol/vol) (opcional). Pinchar la tapa de tubos de 50 mL para permitir la evaporación de nitrógeno líquido y evitar la explosió...

El desafío técnico clave del perfilado de ribosomas es la necesidad de inhibir rápidamente la traducción para capturar una instantánea de ribosomas en ARNm en un estado fisiológico particular de interés. Para lograr esto, los inhibidores de la traducción, la cosecha rápida y la congelación flash en nitrógeno líquido se utilizan comúnmente. La aplicación de antibióticos es opcional, ya que pueden causar artefactos. El cloranfenicol es un fármaco de uso común para detener los ribosomas alargados en ribo-se...

La técnica de perfilado de ribosomas (RIBO-seq) fue desarrollada en el laboratorio de Jonathan Weissman de la Universidad de California, San Francisco1. En comparación con otros métodos utilizados para estudiar la expresión génica a nivel traslacional, RIBO-seq se centra en cada ribosoma que se une al ARNm y proporciona información sobre su ubicación y el número relativo de ribosomas en una transcripción. Permite monitorizar el proceso de síntesis de proteínas in vivo y puede proporcionar resolución y precisión de un solo codón permitiendo la medición de la densidad del ribosoma tanto en el ARNm individual como a lo largo de todo el transcriptoma de la célula. En la fundación de la técnica RIBO-seq se encuentra el hecho de que durante la traducción el ribosoma se une a la molécula de ARNm y por lo tanto protege el fragmento enterrado de la transcripción de una digestión ribonucleasa. Sobre la adición de la ribonucleasa, el mRNA desprotegido se digiere y los fragmentos encerrados por los ribosomas - típicamente de ~28-30 nt de largo - permanecen intactos. Estos fragmentos, llamados huellas ribosómicas (RF), pueden ser aislados, secuenciados y mapeados en la transcripción de la que se originaron, lo que resulta en la detección de la posición exacta de los ribosomas. De hecho, la capacidad del ribosoma para proteger los fragmentos de ARNm se ha utilizado desde la década de 1960 para estudiar la unión ribosómica y los sitios de iniciación a la traducción (TIS)2,3,4. Sin embargo, con el avance en la tecnología de secuenciación profunda, RIBO-seq se ha convertido en un estándar de oro para el monitoreo de la traducción5 que, a través del compromiso del ribosoma, puede proporcionar una información de todo el genoma sobre la síntesis de proteínas6. El perfilado de ribosomas llenó el vacío tecnológico que existía entre la cuantificación del transcriptoma y elproteoma 6.
Para llevar a cabo el perfilado de ribosomas necesitamos obtener el lisoto celular del organismo que había crecido en las condiciones investigadas. La interrupción de estas condiciones durante la recolección y lisis celular puede proporcionar datos poco confiables. Para prevenir esto, los inhibidores de la traducción, la cosecha rápida y la congelación repentina en nitrógeno líquido se utilizan comúnmente. Las células pueden ser lisadas por molienda criogénica en un homogeneizador mecánico como un molino mezclador7,8 o un batidor de perlas9,y por trituración a través de una pipeta10 o con una aguja11. El tampón de lisis se puede agregar justo antes o poco después de la pulverización de las células. En nuestro protocolo utilizamos nitrógeno líquido para preenfriar mortero y pestle, así como óxido de aluminio como un enfoque más suave para la interrupción de la pared celular bacteriana, lo que evita la cizalladura de ARN que a menudo se encuentra cuando se aplican métodos como la sonificación. Después de la pulverización, añadimos un tampón de lisis helada en el contenido enfriado del mortero. La selección de un tampón de lisis adecuado es importante para obtener la mejor resolución de las huellas ribosómicas. Dado que la resistencia iónica afecta tanto al tamaño de RF como a la precisión del marco de lectura, actualmente se recomienda utilizar tampones de lisis con baja resistencia iónica y capacidad de tampón, incluso si parece que la composición del tampón no afecta a la ocupación ribosómica en arns11,12. Los componentes importantes del tampón de lisis son los iones de magnesio, cuya presencia impide la disociación de las subunidades ribosómicas e inhibe los cambios conformacionales espontáneos en los ribosomas bacterianos11,13. Los iones de calcio también juegan un papel importante y son esenciales para la actividad de la nucleasa microcócica (MNase) utilizada en el método de perfilado de ribosomas bacterianos14. La adición de guanosina 5′-[β,γ-imido]trifosfato (GMP-PNP), un análogo no hidrolizable de GTP, junto con cloranfenicol inhibe la traducción durante la lisis15.
Cuando se obtiene el lisato, se clarifica por centrifugación y se divide en dos porciones, cada una para un RIBO-seq y una secuenciación de ARNm total de alto rendimiento (ARN-seq) ya que se realizan simultáneamente (Figura 1). El ARN-seq proporciona un punto de referencia que permite la comparación de datos tanto de RIBO-seq como de ARN-seq durante el análisis de datos. El translatoma investigado se define por la normalización de las huellas ribosómicas a la abundancia deARNm 16. Los datos de RNA-seq también pueden ayudar a identificar artefactos de clonación o secuenciación17.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62544/62544fig01.jpg"> Figura 1. Schematics of mRNA sample preparation for RIBO-seq and RNA-seq. Para la preparación de la biblioteca RIBO-seq, el ARN se digiere con MNase (A), seguido por la selección del tamaño de RF de ~28-30 nt de longitud (B); para el ARN-seq el ARN se aísla (c), agotado del rRNA (d), y el mRNA resultante se hace fragmentos aleatoriamente en los fragmentos de longitudes diversas (e). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62544/62544fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.</a>
Los pasos iniciales del procedimiento de preparación de muestras para RIBO-seq y ARN-seq difieren ligeramente (Figura 1). Para el perfilación ribosómica, el lisoto necesita ser digerido por una endonucleasa específica para degradar las moléculas de ARNm no protegidas por los ribosomas. En los protocolos estándar, los monosomas obtenidos son recuperados mediante una ultracentrifugación de cojín de sacarosa o una ultracentrifugación de gradiente de sacarosa8,14. En este artículo, mostramos que este paso no es necesario para aislar la RF requerida para el RIBO-seq en bacterias, así mismo para las células eucariotas18,y que la selección del tamaño de los fragmentos de ARNm de longitud adecuada del gel de poliacrilamida es suficiente.
Para el ARN-seq, el mRNA es obtenido por el agotamiento del rRNA del ARN total - las moléculas del rRNA hibridan a las puntas de prueba biotinylated del oligonucleótido que atan a los perlas magnéticos streptavidin-revestidos. Los complejos rRNA-oligonucleótido-perlas se eliminan de la muestra con un imán dando como resultado una muestra agotada de ARNr19,20. Las moléculas purificadas del mRNA entonces son fragmentadas aleatoriamente por hidrólisis alcalina. Los fragmentos obtenidos de ARNm, así como las huellas ribosómicas se convierten en bibliotecas de ADNc y se preparan para la secuenciación profunda (Figura 2). Esto implica la reparación de los extremos necesarios después de la hidrólisis alcalina (para el mRNA) y de la digestión enzimática (para el RF): dephosphorylation de los extremos 3' seguidos por la fosforilación de los extremos de 5'. Los siguientes pasos son la ligadura de adaptadores y la transcripción inversa para crear insertos de ADNc enmarcados por secuencias requeridas para la secuenciación de próxima generación (NGS) utilizando la plataforma Illumina. La última fase de la preparación de la biblioteca es una reacción de PCR en la que las construcciones se amplifican y etiquetan con códigos de barras específicos de la muestra para permitir la multiplexación y secuenciación de varias muestras en un canal. Antes de la secuenciación, la calidad y la cantidad de las bibliotecas se evalúan mediante la electroforesis en chip de ADN de alta sensibilidad. Las bibliotecas de ADNc con los parámetros adecuados se pueden agrupar y secuenciar. La secuenciación se puede realizar en diferentes plataformas Illumina, como MiSeq, NextSeq o HighSeq, dependiendo del número de bibliotecas, la longitud de lectura requerida y la profundidad de secuenciación. Después de la secuenciación, se realiza el análisis bioinformático.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62544/62544fig02.jpg"> Figura 2. Preparación de la biblioteca. La preparación de la biblioteca incluye la reparación de los extremos, la ligadura de los adaptadores, la transcripción inversa y la amplificación con código de barras. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62544/62544fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.</a>
El perfilado de ribosomas es un método universal que puede modificarse y ajustarse fácilmente de acuerdo con la pregunta científica. Originalmente se utilizaba en la levadura1,pero poco después se aplicó a las células bacterianas21, así como a organismos modelo eucariotas como el ratón10,el pez cebra22,la mosca de la fruta23 y Arabidopsis thaliana24. También se utilizó para el estudio de diferentes tipos de ribosomas: citoplasmático, mitocondrial25,26 y cloroplasto27,28. En eucariotas RIBO-seq es comúnmente adaptado y refinado para investigar aspectos específicos de la traducción, incluyendo la iniciación10,11,29,30,31,32,el alargamiento1,10,11,31, 33,ribosoma estancamiento33 y cambio de conformación33. La mayoría de las modificaciones implican el uso de diferentes inhibidores de la traducción. En bacterias sin embargo, estudios análogos han sido difíciles de realizar debido a la escasez de inhibidores con el mecanismo de acción requerido34. El inhibidor de la traducción más comúnmente utilizado en bacterias es el cloranfenicol (CAM) que se une al centro de la peptidil transferasa (PTC) e impide la correcta colocación del aminoacil-ARNt en el sitio A. Como resultado, cam previene la formación de un enlace peptídico que conduce a la detención de los ribosomas alargados35. Otros ejemplos de inhibidores de la traducción en bacterias son la tetraciclina (TET)36,la retapamulina (RET)34 y la Onc11237, que se han utilizado para investigar los sitios de iniciación a la traducción. La TET, que impide la entrega de ARNt al ribosoma mediante la superposición directa con el tallo-as del anticodón del ARNt en el sitio A, se aplicó originalmente para verificar los resultados obtenidos del tratamiento con CAM, ya que ambos son antibióticos que inhiben la elongación de la traducción38. Se encontró que TET detectaba TIS primario, sin embargo, no pudo revelar TIS36interno. Ret se une en el PTC del ribosoma bacteriano, y previene la formación del primer enlace peptídico interfiriendo con un aminoacil-ARNt elongador en el sitio A. La aplicación de RET da lugar a la detención de los ribosomas tanto en el TISs primario como en el interno34. Onc112, un péptido antimicrobiano prolina-rico, ata en el túnel de la salida y bloquea el atascamiento aminoacyl-tRNA en el sitio ribosomal de A. Como resultado, Onc112 evita que los complejos de iniciación entren en la fase de elongación37.
La principal información que proporciona el perfilado de ribosomas es la densidad de los ribosomas y su posición sobre el ARNm. Se aplicó con éxito para investigar la expresión génica diferencial a nivel de traslación en diversas condiciones de crecimiento1,6,medir la eficiencia traslacional1,38,39 y detectar eventos de regulación de la traducción como la pausa ribosómica10. RIBO-seq también permite descubrir la traducción de ncRNA anotado, pseudogenes y pequeños marcos de lectura abiertos no anotados (ORF) que conducen a la identificación de genes codificantes de proteínas nuevos y /o muy cortos10,12,22,30,37. En tales casos, RIBO-seq puede afinar y mejorar la anotación del genoma. Con su alta sensibilidad para la identificación de ORFs traducidos y su naturaleza cuantitativa, el perfilado de ribosomas también puede servir como un proxy para la determinación del proteoma o en la ayuda a los estudios de proteómica31,34,39. Mediante el mapeo de TIS, el perfilado de ribosomas revela isoformas N-terminalmente extendidas y truncadas de proteínas conocidas10,32. RIBO-seq también se adaptó para estudiar el plegamiento co-traslacional de proteínas14,21,24. Este método permite medir las tasas de elongación1,10,39 o velocidades de decodificación de codones individuales6 y ayuda en el desarrollo de modelos cuantitativos de traslación17. El método de perfilado de ribosomas también es capaz de proporcionar información mecanicista sobre la pausa del ribosoma en bacterias7,15,17,cambio de marco40,lectura de codones de parada21,defectos de terminación /reciclaje41,42 y cambios de conformación ribosómica33 en eucariotas. RIBO-seq también se adaptó para examinar el impacto de factores específicos de acción trans en la traducción, como los miRNAs6 y las proteínas de unión a ARN en eucariotas16,43. Sin embargo, es importante reconocer que el diseño experimental y la resolución obtenida de RIBO-seq determinan la cantidad de información que puede ser extraída de los datos de secuenciaciónresultantes 12.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10X TBE (powder)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9864</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol, 99%, pure</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>125472500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine 5&#39;-Triphosphate (ATP)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>P0756S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminium oxide calcinated pure p.a.</td>
			<td>Chempur</td>
			<td>114560600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride dihydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C3881-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>190321</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA Clean &#38; Concentrator -5</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>D4004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dnase I recombinant, Rnase-free</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4716728001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA disodium salt</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>E/P140/48</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl Alcohol Absolut 99,8%&#160; Pure-P.A.-Basic</td>
			<td>POCH Avantor Performance Materials Poland S.A</td>
			<td>BA6480111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filtration apparatus</td>
			<td>VWR Collection</td>
			<td>511-0265</td>
			<td>all-glass filtration apparatus, with funnel, fritted base, cap, 47 mm &#216; spring clamp and ground joint flask</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel 40 (19:1)</td>
			<td>Rotiphorese</td>
			<td>3030.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel Loading Dye, Blue, 6X</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E6138G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guanosine 5&#8242;-[&#946;,&#947;-imido]triphosphate trisodium salt hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G0635-25MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>labZAP</td>
			<td>A&#38;A Biotechnology</td>
			<td>040-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium acetate tetrahydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M5661-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MCE membrane fiter</td>
			<td>Alfatec Technology</td>
			<td>M47MCE45GWS</td>
			<td>pore size: 0.45um</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MICROBExpress Bacterial mRNA Purification</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM1905</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiplex Small RNA Library Prep Set for Illumina</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E7300S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-Free Water</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9937</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Acetate Anhydrous Pure P.A.</td>
			<td>POCH Avantor Performance Materials Poland S.A</td>
			<td>744330113</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quick-Load pBR322 DNA-MspI Digest</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E7323A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA Clean &#38; Concentrator -25</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>R1018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2889-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium carbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>223530-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydrogen carbonate pure p.a.</td>
			<td>POCH Avantor Performance Materials Poland S.A</td>
			<td>810530115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR Gold nucleic acid gel stain</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>S11494</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 Polynucleotide Kinase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0201L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 Polynucleotide Kinase Reaction Buffer</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B0201S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBE-Urea Sample Buffer (2x)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>LC6876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris(hydroxymethyl)amino-methane, ultrapure, 99,9%</td>
			<td>AlfaAesar</td>
			<td>J65594</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100, 98%</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>327371000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea G.R.</td>
			<td>lach:ner</td>
			<td>40096-AP0</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ribo-seq in bacteria: a sample collection and library preparation protocol for ngs sequencing

La técnica de perfilado de ribosomas (RIBO-seq) es actualmente la herramienta más eficaz para estudiar el proceso de síntesis de proteínas in vivo. La ventaja de este método, en comparación con otros enfoques, es su capacidad para monitorear la traducción mediante el mapeo preciso de la posición y el número de ribosomas en una transcripción de ARNm.
En este artículo, se describen las etapas consecutivas de la recolección de muestras y la preparación para el método RIBO-seq en bacterias, destacando los detalles relevantes para la planificación y ejecución del experimento.
Puesto que el RIBO-seq confía en los ribosomas intactos y los mRNAs relacionados, el paso dominante es la inhibición rápida de la traducción y la desintegración adecuada de células. Por lo tanto, sugerimos la filtración y la congelación flash en nitrógeno líquido para la recolección celular con un pretratamiento opcional con cloranfenicol para detener la traducción en bacterias. Para la desintegración, proponemos moler las células congeladas con mortero y pestle en presencia de óxido de aluminio para alterar mecánicamente la pared celular. En este protocolo, no se requiere un cojín de sacarosa o una ultracentrifugación de gradiente de sacarosa para la purificación del monosoma. En lugar, la separación del mRNA usando la electroforesis del gel de la poliacrilamida (PÁGINA) seguida por la supresión ribosómica de la huella (venda de 28-30 nt) se aplica y proporciona resultados satisfactorios. Esto simplifica en gran medida el método, así como reduce los requisitos de tiempo y equipo para el procedimiento. Para la preparación de la biblioteca, recomendamos usar el pequeño kit de ARN disponible comercialmente para la secuenciación de Illumina de New England Biolabs, siguiendo las pautas del fabricante con cierto grado de optimización.
Las bibliotecas de ADNc resultantes presentan la cantidad y calidad adecuadas requeridas para la secuenciación de próxima generación (NGS). La secuenciación de las bibliotecas preparadas de acuerdo con el protocolo descrito da como resultado de 2 a 10 mln lecturas mapeadas de forma única por muestra, lo que proporciona datos suficientes para un análisis bioinformático exhaustivo. El protocolo que presentamos es rápido y relativamente fácil y se puede realizar con equipos de laboratorio estándar.

Los resultados ejemplares presentados aquí se obtuvieron en un estudio que examina la regulación de la traducción en células de los subtilis del Bacilo wt esporulantes. Los cultivos nocturnos se diluyeron a OD600 igual a 0,1 en 100 mL de medio rico y se incubaron a 37 °C con agitación vigorosa hasta que OD600 alcanzó 0,5-0,6. El medio rico fue reemplazado por un medio mínimo para inducir el proceso de esporulación y la incubación se continuó hasta por cuatro horas. Las células f...

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RIBO-seq in Bacteria: a Sample Collection and Library Preparation Protocol for NGS Sequencing

Aquí se describen las etapas de la recolección de muestras y la preparación de RIBO-seq en bacterias. La secuenciación de las bibliotecas preparadas de acuerdo con estas directrices da como resultado datos suficientes para un análisis bioinformático exhaustivo. El protocolo que presentamos es simple, utiliza equipos de laboratorio estándar y tarda siete días desde la lisis hasta la obtención de bibliotecas.

RIBO-seq En Bacterias: Una Colección de Muestras Y Protocolo De Preparación De La Biblioteca Para La Secuenciación NGS

The ribosome profiling technique (RIBO-seq) is currently the most effective tool for studying the process of protein synthesis in vivo. The advantage of ...

La técnica de perfilado de ribosomas, también llamada RIBO-seq, es actualmente la herramienta más eficaz para estudiar el proceso de síntesis de proteínas in vivo. La ventaja de este método es su capacidad para monitorear la traducción mediante el mapeo preciso de la posición y el número de ribosomas. RIBO-seq se basa en el hecho de que el ribosoma, al unirse a la molécula de ARNm, protege el fragmento enterrado de la transcripción sobre la digestión de la ribonucleasa.Los fragmentos obtenidos, llamados huellas ribosómicas, pueden ser secuenciados y mapeados en la transcripción de la que se originaron, lo que resulta en la determinación de la posición exacta de los ribosomas. Simultáneamente al RIBO-seq, la secuenciación total del mRNA de alto rendimiento se realiza para proporcionar un punto de referencia y para permitir la comparación de datos de RIBO-seq y de RNA-seq durante el análisis de datos. Antes de la recolección de células, opcionalmente puede agregar cloranfenicol al cultivo bacteriano, a la concentración final de 100 microgramos por mililitro, para inhibir la traducción.Incubar el cultivo con el antibiótico durante un minuto. Este paso es importante si la cosecha tarda más de lo habitual, ya que la inhibición de la traducción permite extender el tiempo de recolección de la muestra. Recoja las muestras con un sistema de filtración precalentado.Usted puede introducir temblores con el fin de imitar las condiciones de crecimiento. Deje de filtrar cuando todos los medios hayan pasado a través de la membrana, pero no permita que el filtro se seque por completo. Recoja los pellets bacterianos raspando rápidamente las células del disco del filtro usando una cápula precalentada y desinfectada.Coloque inmediatamente toda la cápula con las células cosechadas en un tubo de 50 mililitros lleno de nitrógeno líquido. El pellet cosechado debe estar completamente cubierto de nitrógeno líquido. Deje que el pellet se congele a fondo y desaloje las células congeladas usando una cápula previamente enfriada.Cierre la tapa y asegúrese de que esté perforada. Esto es importante, ya que el nitrógeno líquido puede hacer que los contenedores cerrados exploten debido al cambio de presión tras la evaporación. Prepare GMPP, el hisopo de LA DNA, y los tubos frescos de Eppendorf dedicados para la lisisa.Prepare el tampón de lisis con la adición de cloranfenicol si es necesario. Asigne 500 microlitros de tampón de lisis por muestra en tubos Eppendorf separados y colóquelos en hielo. Descontaminar mortero y pestle con un desinfectante de laboratorio y etanol al 70%.Enfríe el mortero y el pestle vertiendo nitrógeno líquido en el mortero. Transfiera el pellet bacteriano congelado a un mortero preenfriado y muele en polvo. Agregue aproximadamente un volumen de óxido de aluminio y continúe moliendo.Mantenga el mortero, el pestle y las células enfriando vertiendo nitrógeno líquido cuando sea necesario, para no dejar que el contenido del mortero se descongele. Justo antes de usar, agregue GMPPNP y el hisopo de ADN en la alícuota del tampón de lisis. Transfiera la solución al mortero y continúe moliendo.Deje que la lisasa se descongele lentamente mientras se muele. Cuando la lisasa se descongele por completo, transfiera la mezcla al tubo eppendorf pre-refrigerado y regrese al hielo. Centrífuga lisasa a 20, 0000 G durante cinco minutos a cuatro grados centígrados.Transfiera sobrenadantes a tubos Eppendorf frescos y preenfriados y colóquelos en hielo. Mida la concentración de ARN en cada muestra diluida con NanoDrop. Divida cada lysate en dos porciones, 0.5 a 1 miligramo de ARN para RIBO-seq, y el resto para RNA-seq.A un miligramo del ARN, agregue 3.8 microlitros de MNase en Tris pH 8, y repáguelo con tampón de lisis hasta el volumen total de 500 microlitros. Incubar a 25 grados centígrados, 300 rondas por minuto, durante 45 minutos. Cuando termine la incubación, limpie las muestras con un kit de limpieza de ARN disponible en el comercio.Prepare un gel de TBE de poliacrilamida al 15% con ocho molares de urea, y colóquelo en un tanque con tampón de TBE. Pre-ejecutar durante un mínimo de 10 minutos a un voltaje constante de 200 voltios. Mezcle las muestras con el tampón de muestras de TBE-Urea.Desnaturalizar a 95 grados centígrados durante un minuto y colocarlos inmediatamente sobre hielo. Lave la urea inyectando tampón de TBE en los pocillos de gel con una jeringa. Cargue las muestras, dejando un espacio de pozo entre ellas para separar cada muestra y evitar la contaminación cruzada.Utilice 29 oligos de nucleótidos de largo, y una mezcla de 26 y 32 oligos de nucleótidos largos como marcadores. Ejecute la electroforesis a un voltaje constante de 180 voltios. Prepare el tampón estéril para la incubación durante la noche.Una vez finalizada la electroforesis, manche el gel con SYBR Gold. Elimine los fragmentos del gel entre 26 y 32 nucleótidos con una aguja estéril o una cuchilla de afeitar, y coloque los fragmentos de gel en tubos Eppendorf separados. Cambie la aguja o la cuchilla de afeitar entre las muestras.Agregue 200 microlitros de tampón de incubación durante la noche a cada Eppendorf e incube las muestras a 10 grados Celsius, 1000 rondas por minuto, durante la noche. Al día siguiente, limpie las muestras con un kit de limpieza de ARN y elérelas en 18 microlitros de agua libre de nucleasa. Las huellas ribosómicas obtenidas están listas para la preparación de la biblioteca.Realice el agotamiento ribosómico del ARN para las muestras para el ARN-seq usando un kit comercialmente-disponible. A continuación, limpie las muestras con el kit de limpieza de ARN. Realice la hidrólisis alcalina de la siguiente manera;prepare el tampón de hidrólisis alcalina, agregue un volumen del tampón a un volumen de la muestra e incube a 95 grados Celsius durante 25 minutos.Añadir cinco microlitros de 3 molares de acetato de sodio pH 5,5 a cada muestra para detener la reacción. Limpie las muestras con un kit de limpieza de ARN y elérelas en 18 microlitros de agua libre de nucleasa. El ARN fragmentado aleatoriamente obtenido está listo para la preparación de la biblioteca.Agregue 10 microlitros de tampón de reacción 10x y cinco microlitros de polinucleótido quinasa T4 a cada muestra. Incubar a 37 grados centígrados durante una hora y media. Después de este tiempo, agregue tres microlitros de un ATP milimomolar e incube a 37 grados Celsius durante una hora.A continuación, limpie las muestras con el kit de limpieza de ARN. Realice la preparación de la biblioteca utilizando el kit disponible comercialmente, de acuerdo con el protocolo proporcionado aquí. Realice PAGE usando gel de poliacrilamida al 6%.Manche el gel con SYBR Gold. Suprimir fragmentos de gel que contienen las bibliotecas. Para muestras de ARN-seq, la biblioteca está entre 135 y 180 nucleótidos, y para RIBO-seq, entre 135 y 170 nucleótidos.Use agujas estériles o cuchillas de afeitar y coloque los fragmentos de gel suprimidos en tubos Eppendorf separados. Recuerde cambiar la aguja o la cuchilla de afeitar entre las muestras. Agregue 100 microlitros de agua sin nucleasa a cada fragmento de gel extirpado.E incubarlos a 10 grados centígrados, 450 rondas por minuto, durante la noche. Al día siguiente, limpie las muestras con un kit de limpieza de ADN. Las bibliotecas obtenidas están listas para el control de calidad y cantidad con alta sensibilidad, electroforesis de ADN en chip y luego para la secuenciación de próxima generación.Las bibliotecas de ADNc resultantes presentan una cantidad y calidad adecuadas requeridas para la secuenciación de próxima generación, según lo verificado por la electroforesis de ADN en chip de alta sensibilidad. Las bandas y picos que representan las bibliotecas RIBO-seq son más estrechas y están mejor definidas, en comparación con esto que representa las bibliotecas de ARN-seq. De acuerdo con la electroforesis en chip, las bibliotecas tienen la lente esperada.Los picos adicionales más cercanos a 200 pares de bases presentes en las bibliotecas RIBO-seq pueden indicar ribosomas en hibernación, huellas ribosómicas no completamente digeridas o artefactos, por ejemplo, ARNr, y se pueden descartar durante el análisis bioinformático cuando se recortan los datos obtenidos de la secuenciación y se filtra el ARNt de ARNr. La cantidad media de ADNc generada en la preparación de bibliotecas es de 32 nanogramos, lo que proporciona una cantidad suficiente de material necesario para la secuenciación de próxima generación. Después del control de calidad por electroforesis en chip, las bibliotecas se retiraron para la secuenciación de pares de bases individuales y 50 en una plataforma NextSeq 500 de Illumina.El recorte de los adaptadores y las secuencias de mala calidad dieron como resultado de 25 a 47 millones de lecturas por muestra para muestras de ARN-seq, y de 25 a 50 millones de lecturas por muestra para muestras RIBO-seq. Los datos obtenidos fueron el control de calidad verificado con FastQC. Las muestras del ARN-seq y del RIBO-seq presentaron la calidad muy buena.El mapeo de las bibliotecas preparadas de acuerdo con el protocolo descrito produjo de 2,4 a 9,6 millones de lecturas mapeadas de forma única por muestra para muestras de ARN-seq, y de 2,3 a 10,4 millones de lecturas mapeadas de forma única para muestras RIBO-seq. Los datos de RIBO-seq exhiben una periodicidad triplicada y un pico alto y estrecho, correspondiente a los ribosomas iniciadores y característico de las huellas ribosómicas, que no se observa en los datos de ARN-seq. Por otra parte, la gráfica que muestra los perfiles de cobertura promedio de huellas ribosómicas y fragmentos de ARNm en las secuencias de codificación revelan la mayor proporción de lecturas mapeadas a los CDS en el conjunto de datos RIBO-seq, como se esperaba.La visualización de las huellas ribosómicas mapeadas mostró patrones muy similares en comparación con los resultados obtenidos del mismo experimento realizado de acuerdo con el procedimiento ribo-seq estándar, que incluye la recuperación de monosomas por ultracentrifugación de gradiente de sacarosa. Nuestro protocolo se ha utilizado para investigar la regulación de la traducción en varias condiciones de crecimiento, pero se puede aplicar para estudiar otros aspectos de la traducción, como la detección de sitios de iniciación a la traducción y nuevos genes de codificación de proteínas. La secuenciación de las bibliotecas preparadas de acuerdo con nuestras directrices da como resultado datos suficientes para un análisis bioinformático exhaustivo.El protocolo que presentamos aquí es rápido, fácil y rentable, y se puede realizar con equipos de laboratorio estándar.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

Preparación de muestras para identificación basada en espectrometría de masa de regiones de unión de ARN

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

Investigación

Bioquímica

An All-in-one Sample Holder for Macromolecular X-ray Crystallography with Minimal Background Scattering

Un soporte de muestra todo en uno para cristalografía de rayos X macromolecular con dispersión mínima de fondo

Macromolecular X-ray crystallography (MX) is the most prominent method to obtain high-resolution three-dimensional knowledge of biological macromolecules. ...

A Plasma Sample Preparation for Mass Spectrometry using an Automated Workstation

Una preparación de muestra de plasma para espectrometría de masas utilizando una estación de trabajo automatizada

Sample preparation for mass spectrometry analysis in proteomics requires enzymatic cleavage of proteins into a peptide mixture. This process involves ...

Sample Preparation for Probe Electrospray Ionization Mass Spectrometry

Preparación de muestras para espectrometría de masas de ionización por electrospray de sonda

Mass spectrometry (MS) is a powerful tool in analytical chemistry because it provides very accurate information about molecules, such as mass-to-charge ...

TMT Sample Preparation for Proteomics Facility Submission and Subsequent Data Analysis

Preparación de muestras TMT para la presentación de instalaciones proteómicas y análisis de datos posteriores

Proteomic technologies are powerful methodologies that can aid our understanding of mechanisms of action in biological systems by providing a global view ...

MS2-Affinity Purification Coupled with RNA Sequencing in Gram-Positive Bacteria

MS2-Afinidad Purificación Junto Con La Secuenciación De ARN En Bacterias Gram-Positivas

Although small regulatory RNAs (sRNAs) are widespread among the bacterial domain of life, the functions of many of them remain poorly characterized ...

NMR-Based Fragment Screening in a Minimum Sample but Maximum Automation Mode

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A Sample Preparation Pipeline for Microcrystals at the VMXm Beamline

Una tubería de preparación de muestras para microcristales en vmXm Beamline

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Preparation of High-Temperature Sample Grids for Cryo-EM

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