Name: ribo-seq in bacteria: a sample collection and library preparation protocol for ngs sequencing
Uploaded: 2021-08-07T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about RIBO-seq in Bacteria: a Sample Collection and Library Preparation Protocol for NGS Sequencing at JoVE.com

ALS vill bekräfta det ekonomiska stödet från EMBO Installationsbidrag IG 3914 och POIR. 04.04.00-00-3E9C/17-00 inom ramen för fonden för polsk vetenskaps första gruppprogram som medfinansieras av Europeiska unionen inom ramen för Europeiska regionala utvecklingsfonden.

1. Provtagning
<ol><li>Förbered en bakteriekultur. Vi rekommenderar en kulturvolym på 100 ml per prov.</li>
	<li>Bered utrustning och reagenser för provtagning: två skopor per prov, sterila 0,45 μm blandade cellulosaestermembran (MCE), 50 ml sterila rör, flytande kväve, 50 mg/ml kloramfenikol i 70 % (vol/vol) etanol (tillval). Punktera locket på 50 ml rör för att möjliggöra vätskekväveavdunstning och förhindra explosion av slutna rör. Dekontaminera skopor med laboratorietvättmedel och 70% etanol.</li>
...

Den viktigaste tekniska utmaningen med ribosomprofilering är behovet av att snabbt hämma översättningen för att fånga en ögonblicksbild av ribosomer på mRNAs vid ett visst fysiologiskt tillstånd av intresse. För att åstadkomma detta används ofta översättningshämmare, snabb skörd och blixtfrysning i flytande kväve. Att applicera antibiotika är valfritt eftersom de kan orsaka artefakter. Kloramfenikol är ett vanligt läkemedel för att stoppa långsträckta ribosomer i bakteriell RIBO-seq. Det förhindra...

Ribosomprofileringstekniken (RIBO-seq) utvecklades i jonathan Weissmans laboratorium vid University of California, San Francisco1. I jämförelse med andra metoder som används för att studera genuttryck på translationell nivå fokuserar RIBO-seq på varje ribosombindning till mRNA och ger information om dess läge och det relativa antalet ribosomer på en transkription. Det möjliggör övervakning av processen för proteinsyntes in vivo och kan ge enkel kodonupplösning och noggrannhet som möjliggör mätning av ribosomtätheten på båda, det enskilda mRNA och längs hela transkriptomen i cellen. På fundamentet av RIBO-seq-tekniken ligger faktumet att under översättning binder ribosomen mRNA-molekylen och skyddar thus det begravda fragmentet av avskriften från en ribonuclease matsmältning. Vid tillsats av ribonukleasen smälts det oskyddade mRNA och fragmenten omslutna av ribosomer - vanligtvis på ~ 28-30 nt långa - förblir intakta. Dessa fragment, så kallade ribosomala fotspår (RF), kan sedan isoleras, sekvenseras och mappas på den transkription de härstammar från vilket resulterar i detektion av ribosomens exakta position. Faktum är att ribosomens förmåga att skydda mRNA-fragment har använts sedan 1960-talet för att studera ribosomala bindnings- och översättningsinitieringsplatser (TIS)2,3,4. Men med utvecklingen inom djupsekvenseringsteknik har RIBO-seq blivit en guldstandard föröversättningsövervakning 5 som genom ribosomengagemanget kan ge en genomomfattande information om proteinsyntes6. Ribosomprofilering fyllde det tekniska gapet som fanns mellan kvantifiering av transkriptomen och proteomen6.
För att genomföra ribosomprofilering måste vi få celllyat av organismen som hade vuxit under de undersökta förhållandena. Att störa dessa förhållanden under cellinsamling och lys kan ge otillförlitliga data. För att förhindra detta används ofta översättningshämmare, snabb skörd och blixtfrysning i flytande kväve. Celler kan lysas genom kryogen slipning i en mekanisk homogenisator som en mixerkvarn7,8 eller en pärlviss9, och genom trituration genom en pipett10 eller med ennål 11. Lysbufferten kan tillsättas strax före eller strax efter pulveriseringen av cellerna. I vårt protokoll använder vi flytande kväve för att förkyla mortel och mortel, samt aluminiumoxid som ett mildare tillvägagångssätt för störningar i bakteriecellväggen, vilket förhindrar RNA-shearing som ofta uppstår när metoder som sonifiering tillämpas. Efter pulverisering lägger vi till en iskall lysbuffert i det kylda innehållet i morteln. Val av lämplig lysbuffert är viktigt för att uppnå bästa upplösning av ribosomala fotavtryck. Eftersom jonisk styrka påverkar både RF-storleken och läsramens precision, rekommenderas det för närvarande att använda lysbuffertar med låg jonisk hållfasthet och buffertkapacitet, även om det verkar som om buffertsammansättningen inte påverkar ribosombeläggningen på mRNAs11,12. Viktiga komponenter i lysbufferten är magnesiumjoner, vars närvaro förhindrar dissociation av ribosomala underenheter och hämmar spontana konformationsförändringar i bakteriella ribosomer11,13. Kalciumjoner spelar också en viktig roll och är viktiga för aktiviteten hos mikrokoccal nukleas (MNase) som används i bakteriell ribosomprofileringsmetod14. Tillsats av guanosin 5′-[β,γ-imido]triphosphate (GMP-PNP), en icke-hydrolyserbar analog av GTP, tillsammans med kloramfenikol hämmar översättning under lysis15.
När lysatet erhålls förtydligas det genom centrifugation och delas in i två portioner, var och en för en RIBO-sekvensq och en hög genomströmning total mRNA-sekvensering (RNA-seq) eftersom de utförs samtidigt (Figur 1). RNA-seq ger en referenspunkt som möjliggör jämförelse av data från både RIBO-seq och RNA-seq under dataanalys. Den undersökta översättningen definieras av normalisering av ribosomal fotspår till mRNA överflöd16. Data från RNA-seq kan också hjälpa till att identifiera kloning eller sekvensering av artefakter17.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62544/62544fig01.jpg"> Figur 1. Ritningar av mRNA prov förberedelse för RIBO-seq och RNA-seq. För RIBO-seq biblioteksberedning smälts RNA med MNase (A), följt av storleksvalet av RF på ~ 28-30 nt längd (B); för RNA-seq RNA isoleras (C), utarmas av rRNA (D), och den resulterande mRNA är slumpmässigt fragmenterad i fragment av varierande längder (E). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62544/62544fig01large.jpg" target="_blank">Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.</a>
De första stegen i förfarandet för provberedning för RIBO-seq och RNA-seq skiljer sig något åt (figur 1). För ribosomprofilering måste lysatet smältas av en specifik endonukleas för att bryta ner mRNA-molekylerna som inte skyddas av ribosomerna. I standardprotokoll återvinns de erhållna monosomerna av en sackaroskudde ultracentrifugation eller en sackarosgradient ultracentrifugation8,14. I den här artikeln visar vi att detta steg inte är nödvändigt för att isolera RF som krävs för RIBO-seq i bakterier, likaså för eukaryotaceller 18, och att storleksval av lämpliga längd mRNA-fragment från polyakrylamidgelen är tillräckligt.
För RNA-seq erhålls mRNA genom utarmning av rRNA från den totala RNA - rRNA-molekyler hybridiseras till de biotinylerade oligonukleotidsonderna som binder till de streptavidinbelagda magnetiska pärlorna. RRNA-oligonukleotid-pärlkomplexen avlägsnas sedan från provet med en magnet som resulterar i ett rRNA-utarmat prov19,20. De renade mRNA-molekylerna fragmenteras sedan slumpmässigt av alkalisk hydrolys. De erhållna fragmenten av mRNA samt ribosomala fotavtryck omvandlas till cDNA-bibliotek och förbereds för djup sekvensering (figur 2). Detta innebär slutreparation som behövs efter alkalisk hydrolys (för mRNA) och enzymatisk matsmältning (för RF): defosforylering av 3 ändar följt av fosforylering av 5 ändar. Nästa steg är adapterligantion och omvänd transkription för att skapa cDNA-skär inramade av sekvenser som krävs för nästa generations sekvensering (NGS) med Illumina-plattformen. Den sista fasen av biblioteksberedningen är en PCR-reaktion där konstruktionerna förstärks och märks med exempelspecifika streckkoder för att möjliggöra multiplexering och sekvensering av olika prover på en kanal. Före sekvensering bedöms bibliotekens kvalitet och kvantitet med hög känslighet DNA-elektrofores. cDNA-bibliotek med lämpliga parametrar kan sedan slås samman och sekvenseras. Sekvensering kan utföras på olika Illumina-plattformar, till exempel MiSeq, NextSeq eller HighSeq, beroende på antalet bibliotek, önskad läslängd och sekvenseringsdjup. Efter sekvensering utförs den bioinformatiska analysen.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62544/62544fig02.jpg"> Figur 2. Förberedelse av bibliotek. Biblioteksförberedelserna omfattar reparation av ändar, adapterligion, omvänd transkription och förstärkning med streckkodning. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62544/62544fig02large.jpg" target="_blank">Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.</a>
Ribosomprofilering är en universell metod som lätt kan modifieras och justeras enligt den vetenskapliga frågan. Ursprungligen användes den i jäst1, men kort efter att den applicerades på bakterieceller21 samt eukaryota modellorganismer inklusive mus10, zebrafisk22, fruktfluga23 och Arabidopsis thaliana24. Det användes också för att studera olika ribosomtyper: cytoplasma, mitokondriell25,26 och kloroplast27,28. I eukaryoter är RIBO-seq ofta anpassad och raffinerad för att undersöka specifika aspekter av översättning, inklusiveinitiering 10,11,29,30,31,32, förlängning1,10,11,31,33, ribosom stalling33 och konformationsändring33. De flesta ändringarna innebär användning av olika översättningshämmare. I bakterier har dock liknande studier varit svåra att genomföra på grund av inhibitorens brist med den erforderliga verkningsmekanismen34. Den vanligaste översättningshämmaren i bakterier är kloramfenikol (CAM) som binder till peptidyltransferascentret (PTC) och förhindrar korrekt positionering av aminoacyl-tRNA på A-sitet. Som ett resultat förhindrar CAM bildandet av en peptidbindning som leder till att de långsträckta ribosomerna35. Andra exempel på översättningshämmare i bakterier är tetracyklin (TET)36, retapamulin (RET)34 och Onc11237 som har använts för att undersöka översättningsinitieringsplatser. TET, som förhindrar tRNA leverans till ribosomen genom att direkt överlappa med antikodon stam-loop av tRNA på A-platsen, tillämpades ursprungligen för att verifiera resultaten från CAM behandling eftersom de båda är antibiotika hämma översättning förlängning38. TET konstaterades för att upptäcka primära TIS, men kunde inte avslöja interna TIS36. RET binder i PTC av bakteriell ribosom, och förhindrar bildandet av den första peptidbindningen genom att störa en elongator aminoacyl-tRNA i A-platsen. Applicering av RET resulterar i ribosomer gripande vid både primära såväl som interna TISs34. Onc112, en proline-rik antimikrobiell peptid, binder i utgångstunneln och blockerar aminoacyl-tRNA-bindning i ribosomal A-platsen. Som ett resultat förhindrar Onc112 initieringskomplex från att komma in i förlängningsfasen37.
Den huvudsakliga informationen ribosom profilering ger är ribosom densitet och deras position på mRNA. Det tillämpades framgångsrikt för att undersöka differentiella genuttryck på översättningsnivå under olikatillväxtförhållanden 1,6, mäta translationelleffektivitet 1,38,39 och upptäcka översättningsregleringshändelser som ribosomalpausning 10. RIBO-seq gör det också möjligt att avslöja översättningen av kommenterade ncRNA, pseudogenes och unannotated små öppna läsramar (ORF) som leder till identifiering av nya och / eller mycket korta proteinkodningsgener10,12,22,30,37. I sådana fall kan RIBO-seq finjustera och förbättra genomanteckningen. Med sin höga känslighet för identifiering av översatta ORF och dess kvantitativa karaktär kan ribosomprofilering också fungera som en proxy för proteomebestämningen eller för att hjälpa proteomikstudier31,34,39. Genom att kartlägga TIS avslöjar ribosomprofilering N-terminalt utsträckta och trunkerade isoformer av kändaproteiner 10,32. RIBO-seq anpassades också för att studera samöversättningsvikning avproteiner 14,21,24. Denna metod möjliggör mätning av förlängningshastigheter1,10,39 eller avkodningshastigheter för enskilda kodoner6 och hjälper till att utveckla kvantitativa modeller av översättning17. Ribosomprofileringsmetoden kan också ge mekanistiska insikter om ribosomen som pausar ibakterierna 7,15,17, frameshifting40, stop-codon readthrough21, terminering / återvinningdefekter 41,42 och ribosomal konformation ändras33 i eukaryoter. RIBO-seq anpassades också för att undersöka effekten av specifika transverkande faktorer på översättning såsom miRNAs6 och RNA-bindande proteiner i eukaryoter16,43. Det är dock viktigt att erkänna att den experimentella utformningen och den erhållna upplösningen av RIBO-seq bestämmer mängden information som kan extraheras från de resulterande sekvenseringsdata12.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10X TBE (powder)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9864</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol, 99%, pure</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>125472500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine 5&#39;-Triphosphate (ATP)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>P0756S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminium oxide calcinated pure p.a.</td>
			<td>Chempur</td>
			<td>114560600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride dihydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C3881-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>190321</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA Clean &#38; Concentrator -5</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>D4004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dnase I recombinant, Rnase-free</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4716728001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA disodium salt</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>E/P140/48</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl Alcohol Absolut 99,8%&#160; Pure-P.A.-Basic</td>
			<td>POCH Avantor Performance Materials Poland S.A</td>
			<td>BA6480111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filtration apparatus</td>
			<td>VWR Collection</td>
			<td>511-0265</td>
			<td>all-glass filtration apparatus, with funnel, fritted base, cap, 47 mm &#216; spring clamp and ground joint flask</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel 40 (19:1)</td>
			<td>Rotiphorese</td>
			<td>3030.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel Loading Dye, Blue, 6X</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E6138G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guanosine 5&#8242;-[&#946;,&#947;-imido]triphosphate trisodium salt hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G0635-25MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>labZAP</td>
			<td>A&#38;A Biotechnology</td>
			<td>040-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium acetate tetrahydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M5661-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MCE membrane fiter</td>
			<td>Alfatec Technology</td>
			<td>M47MCE45GWS</td>
			<td>pore size: 0.45um</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MICROBExpress Bacterial mRNA Purification</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM1905</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiplex Small RNA Library Prep Set for Illumina</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E7300S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-Free Water</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9937</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Acetate Anhydrous Pure P.A.</td>
			<td>POCH Avantor Performance Materials Poland S.A</td>
			<td>744330113</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quick-Load pBR322 DNA-MspI Digest</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E7323A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA Clean &#38; Concentrator -25</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>R1018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2889-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium carbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>223530-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydrogen carbonate pure p.a.</td>
			<td>POCH Avantor Performance Materials Poland S.A</td>
			<td>810530115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR Gold nucleic acid gel stain</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>S11494</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 Polynucleotide Kinase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0201L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 Polynucleotide Kinase Reaction Buffer</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B0201S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBE-Urea Sample Buffer (2x)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>LC6876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris(hydroxymethyl)amino-methane, ultrapure, 99,9%</td>
			<td>AlfaAesar</td>
			<td>J65594</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100, 98%</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>327371000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea G.R.</td>
			<td>lach:ner</td>
			<td>40096-AP0</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ribo-seq in bacteria: a sample collection and library preparation protocol for ngs sequencing

Ribosomprofileringstekniken (RIBO-seq) är för närvarande det mest effektiva verktyget för att studera processen med proteinsyntes in vivo. Fördelen med denna metod, i jämförelse med andra tillvägagångssätt, är dess förmåga att övervaka översättning genom att exakt kartlägga positionen och antalet ribosomer på en mRNA-transkription.
I den här artikeln beskriver vi de på varandra följande stadierna av provtagning och förberedelse för RIBO-seq-metoden i bakterier, vilket belyser de detaljer som är relevanta för planering och genomförande av experimentet.
Eftersom RIBO-seq förlitar sig på intakta ribosomer och relaterade mRNAs, är det viktigaste steget snabb hämning av översättning och adekvat sönderfall av celler. Således föreslår vi filtrering och blixtfrysning i flytande kväve för cellskörd med en valfri förbehandling med kloramfenikol för att stoppa översättning i bakterier. För upplösningen föreslår vi slipning av frusna celler med mortel och mortel i närvaro av aluminiumoxid för att mekaniskt störa cellväggen. I detta protokoll krävs inte sackaroskudde eller sackarosgradient ultracentrifugation för monosome rening. Istället appliceras mRNA-separation med polyakrylamidgelelektrofores (PAGE) följt av ribosomal fotavtryck excision (28-30 nt band) och ger tillfredsställande resultat. Detta förenklar till stor del metoden samt minskar tids- och utrustningskraven för förfarandet. För biblioteksförberedelse rekommenderar vi att du använder det kommersiellt tillgängliga lilla RNA-kitet för Illumina-sekvensering från New England Biolabs, enligt tillverkarens riktlinjer med viss grad av optimering.
De resulterande cDNA-biblioteken presenterar lämplig kvantitet och kvalitet som krävs för nästa generations sekvensering (NGS). Sekvensering av de bibliotek som utarbetats enligt det beskrivna protokollet resulterar i 2 till 10 mln unikt kartlagda läsningar per prov som ger tillräckliga data för omfattande bioinformatisk analys. Protokollet vi presenterar är snabbt och relativt enkelt och kan utföras med standard laboratorieutrustning.

De exemplariska resultaten som presenteras här erhölls i en studie som undersöker översättningsreglering i sporulera WT Bacillus subtilis celler. Över natten kulturer späddes ut till OD600 lika med 0,1 i 100 mL rikt medium och inkuberades vid 37 °C med kraftig skakning tills OD600 nådde 0,5-0,6. Det rika mediet ersattes sedan med minimalt medium för att inducera sporuleringsprocessen och inkubationen fortsatte i upp till fyra timmar. Celler skördades varje timme från och med T0 ...

Watch this Scientific Journal Video about RIBO-seq in Bacteria: a Sample Collection and Library Preparation Protocol for NGS Sequencing at JoVE.com

RIBO-seq in Bacteria: a Sample Collection and Library Preparation Protocol for NGS Sequencing

Här beskriver vi stadierna av provtagning och förberedelse för RIBO-seq i bakterier. Sekvensering av de bibliotek som utarbetats enligt dessa riktlinjer resulterar i tillräckliga data för omfattande bioinformatisk analys. Protokollet vi presenterar är enkelt, använder standard laboratorieutrustning och tar sju dagar från lysis till att få bibliotek.

RIBO-seq i bakterier: ett protokoll för insamling av prover och biblioteksförberedelser för NGS-sekvensering

The ribosome profiling technique (RIBO-seq) is currently the most effective tool for studying the process of protein synthesis in vivo. The advantage of ...

Ribosomprofileringstekniken, även kallad RIBO-seq, är för närvarande det mest effektiva verktyget för att studera processen med proteinsyntes in vivo. Fördelen med denna metod är dess förmåga att övervaka översättning genom att exakt kartlägga positionen och antalet ribosomer. RIBO-seq är baserad på det faktum att ribosomen, genom att binda till mRNA-molekylen, skyddar det begravda fragmentet av avskriften vid ribonukleas matsmältning.De erhållna fragmenten, så kallade ribosomala fotavtryck, kan sekvenseras och mappas på den transkription de härstammar från, vilket resulterar i bestämning av ribosomens exakta position. Samtidigt med RIBO-seq utförs hög genomströmning total mRNA-sekvensering för att ge en referenspunkt och möjliggöra jämförelse av data från både RIBO-seq och RNA-seq under dataanalys. Före cellskörd kan du valfritt tillsätta kloramfenikol till bakteriekulturen, till den slutliga koncentrationen av 100 mikrogram per milliliter, för att hämma översättningen.Inkubera kulturen med antibiotikumet i en minut. Detta steg är viktigt om skörden tar längre tid än vanligt, eftersom översättningshämning gör det möjligt att förlänga provtagningstiden. Samla in proverna med ett förvärmt filtreringssystem.Du kan införa skakningar för att efterlikna tillväxtförhållanden. Sluta filtrera när alla medier har passerat genom membranet, men låt inte filtret torka helt. Samla bakteriepellets genom att snabbt skrapa bort cellerna från filterskivan med en förvärmd, desinficerad scoopula.Placera omedelbart hela scoopulan med de skördade cellerna i 50 milliliter rör fyllt med flytande kväve. Den skördade pelleten ska vara helt täckt av flytande kväve. Låt pelleten frysa ordentligt och lossa frusna celler med en tidigare kyld scoopula.Stäng locket och se till att det är punkterat. Detta är viktigt, eftersom flytande kväve kan orsaka att slutna behållare exploderar på grund av tryckförändringen vid avdunstning. Förbered GMPP, DNA-svabb och färska Eppendorf-rör avsedda för lysas.Förbered lysbuffert med tillsats av kloramfenikol om det behövs. Fördela 500 mikroliter lysbuffert per prov i separata Eppendorfrör och placera dem på is. Dekontaminera mortel och mortel med laboratoriedesinfektionsmedel och 70% etanol.Kyl mortel och mortel genom att hälla flytande kväve i morteln. Överför den frusna bakteriepelleten till en förkyld mortel och mala den till ett pulver. Tillsätt ungefär en volym aluminiumoxid och fortsätt slipningen.Håll mortel, mortel och cellerna svala genom att hälla flytande kväve vid behov, för att inte låta innehållet i morteln tina. Strax före användning, tillsätt GMPPNP och DNA-svabb i lysbufferten aliquot. Överför lösningen till murbruket och fortsätt slipningen.Låt lysasen tina långsamt under slipning. När lysasen tinar helt, överför blandningen till det förkylda Eppendorf-röret och återgå till is. Centrifuge lysas vid 20, 0000 G i fem minuter vid fyra Celsius grader.Överför supernatanter till färska, förkylda Eppendorf-rör och lägg dem på is. Mät RNA-koncentrationen i varje utspädd prov med NanoDrop. Dela varje lysat i två portioner, 0,5 till 1 milligram RNA för RIBO-seq och resten för RNA-seq.Till ett milligram av RNA, tillsätt 3,8 mikroliter MNase i Tris pH 8 och fylla på lysbufferten till den totala volymen på 500 mikroliter. Inkubera vid 25 Celsius grader, 300 skott per minut, i 45 minuter. När inkubationen är klar rengör du proverna med ett kommersiellt tillgängligt RNA-rengöringskit.Förbered 15% polyakrylamid TBE gel med åtta molar urea och placera den i en tank med TBE-buffert. Förkörning i minst 10 minuter med en konstant spänning på 200 volt. Blanda proverna med TBE-Urea provbuffert.Denature på 95 Celsius grader i en minut och placera dem omedelbart på is. Tvätta urea genom att injicera TBE-buffert i gelbrunnar med en spruta. Ladda proverna och lämna ett brunnsutrymme mellan dem för att separera varje prov och förhindra korskontaminering.Använd 29 nukleotider lång oligo och en blandning av 26 och 32 nukleotider långa oligos som markörer. Kör elektroforesen med en konstant spänning på 180 volt. Förbered steril buffert för inkubation över natten.När elektroforesen är klar, färga gelén med SYBR Gold. Punktskattefragment av gelén mellan 26 och 32 nukleotider med steril nål eller rakblad och placera gelfragmenten i separata Eppendorfrör. Byt nål eller rakblad mellan proverna.Tillsätt 200 mikroliter inkubationsbuffert över natten till varje Eppendorf och inkubera proverna vid 10 Celsius grader, 1000 rundor per minut, över natten. Rengör proverna med RNA-rengöringskit nästa dag och eluera dem i 18 mikroliter nukleasfritt vatten. De erhållna ribosomala fotavtrycken är redo för biblioteksförberedelser.Utför ribosomal RNA-utarmning för prover för RNA-seq med hjälp av ett kommersiellt tillgängligt kit. Rengör sedan proverna med RNA-rengöringssats. Utför alkalisk hydrolys enligt följande;förbered den alkaliska hydrolysbufferten, tillsätt en volym av bufferten till en volym av provet och inkubera vid 95 Celsius grader i 25 minuter.Tillsätt fem mikroliter av 3 Molar natriumacetat pH 5,5 till varje prov för att stoppa reaktionen. Rengör proverna med RNA-rengöringssats och eluera dem i 18 mikroliter nukleasfritt vatten. Det erhållna slumpmässigt fragmenterade RNA är redo för biblioteksförberedelse.Tillsätt 10 mikroliter 10x reaktionsbuffert och fem mikroliter T4 polynukleotidkinas till varje prov. Inkubera vid 37 Celsius grader i en och en halv timme. Efter denna tid, tillsätt tre mikroliter av en millimolar ATP och inkubera vid 37 Celsius grader i en timme.Rengör sedan proverna med RNA-rengöringssats. Utför biblioteksförberedelser med hjälp av det kommersiellt tillgängliga kitet, enligt protokollet som anges här. Utför PAGE med 6%polyakrylamidgel.Färga gelén med SYBR Gold. Punktskattegelfragment som innehåller biblioteken. För RNA-seq-prover är biblioteket mellan 135 och 180 nukleotider, och för RIBO-seq mellan 135 och 170 nukleotider.Använd sterila nålar eller rakblad och placera de strukna gelfragmenten i separata Eppendorfrör. Kom ihåg att byta nål eller rakblad mellan proverna. Tillsätt 100 mikroliter kärnfritt vatten till varje struket gelfragment.Och inkubera dem vid 10 Celsius grader, 450 skott per minut, över natten. Nästa dag, rengör proverna med DNA-rengöringskit. De erhållna biblioteken är redo för kvalitets- och kvantitetskontroll med hög känslighet, DNA-elektrofores och sedan för nästa generations sekvensering.De resulterande cDNA-biblioteken presenterar en lämplig mängd och kvalitet som krävs för nästa generations sekvensering, vilket verifieras av hög känslighet, DNA-elektrofores. De band och toppar som representerar RIBO-seq-biblioteken är smalare och bättre definierade, jämfört med detta som representerar RNA-seq-biblioteken. Enligt elektroforesen på chip har biblioteken den förväntade linsen.De ytterligare topparna närmare 200 baspar som finns i RIBO-seq-bibliotek kan indikera viloläge ribosomer, inte helt smälta ribosomala fotavtryck eller artefakter, till exempel rRNA, och kan kasseras under bioinformatisk analys när data som erhålls från sekvensering trimmas och rRNA-tRNA filtreras. Den genomsnittliga mängden cDNA som genereras i biblioteksberedningen är 32 nanogram, vilket ger tillräcklig mängd material som krävs för nästa generations sekvensering. Efter kvalitetskontroll av elektrofores på chip drogs bibliotek för singel- och 50 basparsekvensering på en Illuminas NextSeq 500-plattform.Trimning av adaptrar och sekvenser av dålig kvalitet resulterade i 25 till 47 miljoner läsningar per prov för RNA-seq-prover och 25 till 50 miljoner läsningar per prov för RIBO-seq-prover. De erhållna uppgifterna kontrollerades med FastQC. Både RNA-seq och RIBO-seq prover presenteras mycket god kvalitet.Kartläggning av biblioteken som utarbetats enligt det beskrivna protokollet gav 2,4 till 9,6 miljoner unikt kartlagda läsningar per prov för RNA-seq-prover och 2,3 till 10,4 miljoner unikt kartlagda läsningar för RIBO-seq-prover. RIBO-seq data uppvisar tredubbla periodicitet och en lång, smal topp, motsvarande inledande ribosomer och karakteristiska för ribosomal fotavtryck, som inte observeras i RNA-seq data. Dessutom avslöjar tomten som visar profilerna för genomsnittlig täckning av ribosomala fotavtryck och mRNA-fragment på kodningssekvenserna den högre andelen läsningar som mappas till CDS i RIBO-seq-datauppsättningen, som förväntat.Visualiseringen av de kartlagda ribosomal fotavtryck visade mycket liknande mönster jämfört med resultaten från samma experiment utförs i enlighet därmed till standard RIBO-seq förfarande, som inkluderar monosome återhämtning av sackaros gradient ultracentrifugation. Vårt protokoll har använts för att undersöka översättningsreglering under olika tillväxtförhållanden, men kan tillämpas för att studera andra aspekter av översättning, som upptäckt av översättningsinitieringswebbplatser och nya proteinkodningsgener. Sekvensering av biblioteken som utarbetats enligt våra riktlinjer resulterar i tillräckliga data för omfattande bioinformatisk analys.Protokollet vi presenterar här är snabbt, enkelt och kostnadseffektivt och kan utföras med standard laboratorieutrustning.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

Provberedning för Mass Spectrometry-baserade identifiering av RNA-bindande regioner

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

An All-in-one Sample Holder for Macromolecular X-ray Crystallography with Minimal Background Scattering

En allt-i-ett-provhållare för makro molekyl ära röntgenkristallografi med minimal bakgrunds spridning

Macromolecular X-ray crystallography (MX) is the most prominent method to obtain high-resolution three-dimensional knowledge of biological macromolecules. ...

A Plasma Sample Preparation for Mass Spectrometry using an Automated Workstation

Ett plasmaprovförberedelse för masspektrometri med hjälp av en automatiserad arbetsstation

Sample preparation for mass spectrometry analysis in proteomics requires enzymatic cleavage of proteins into a peptide mixture. This process involves ...

Sample Preparation for Probe Electrospray Ionization Mass Spectrometry

Provberedning för probe electrospray jonisering Masspektrometri

Mass spectrometry (MS) is a powerful tool in analytical chemistry because it provides very accurate information about molecules, such as mass-to-charge ...

TMT Sample Preparation for Proteomics Facility Submission and Subsequent Data Analysis

TMT Provberedning för Proteomics Facility Submission och efterföljande dataanalys

Proteomic technologies are powerful methodologies that can aid our understanding of mechanisms of action in biological systems by providing a global view ...

MS2-Affinity Purification Coupled with RNA Sequencing in Gram-Positive Bacteria

MS2-affinitetsrening i kombination med RNA-sekvensering i grampositiva bakterier

Although small regulatory RNAs (sRNAs) are widespread among the bacterial domain of life, the functions of many of them remain poorly characterized ...

NMR-Based Fragment Screening in a Minimum Sample but Maximum Automation Mode

NMR-baserad fragmentscreening i ett minimalt prov men maximalt automatiseringsläge

Fragment-based screening (FBS) is a well-validated and accepted concept within the drug discovery process both in academia and industry. The greatest ...

A Sample Preparation Pipeline for Microcrystals at the VMXm Beamline

En provförberedande pipeline för mikrokritaler vid VMXm Beamline

The mounting of microcrystals (&#60;10 &#181;m) for single crystal cryo-crystallography presents a non-trivial challenge. Improvements in data quality ...

Sample Preparation and Transfer Protocol for In-Vacuum Long-Wavelength Crystallography on Beamline I23 at Diamond Light Source

Provberednings- och överföringsprotokoll för in-vacuum långvågig kristallografi på Beamline I23 vid Diamond Light Source

Long-wavelength macromolecular crystallography (MX) exploits the anomalous scattering properties of elements, such as sulfur, phosphorus, potassium, ...

Preparation of High-Temperature Sample Grids for Cryo-EM

Beredning av högtemperaturprovgaller för kryo-EM

The sample grids for cryo-electron microscopy (cryo-EM) experiments are usually prepared at a temperature optimal for the storage of biological samples, ...