Name: ribo-seq in bacteria: a sample collection and library preparation protocol for ngs sequencing
Uploaded: 2021-08-07T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about RIBO-seq in Bacteria: a Sample Collection and Library Preparation Protocol for NGS Sequencing at JoVE.com

ALS, EMBO Kurulum Hibeleri IG 3914 ve POIR'in finansal desteğini kabul etmek istiyor. 04.04.00-00-3E9C/17-00 Avrupa Birliği tarafından Avrupa Bölgesel Kalkınma Fonu kapsamında ortaklaşa finanse edilen Polonya Bilim Vakfı'nın Birinci TAKIM programı dahilinde gerçekleştirildi.

1. Örnek toplama
<ol><li>Bakteri kültürü hazırlayın. Örnek başına 100 mL'lik bir kültür hacmi öneriyoruz.</li>
	<li>Numune toplama için ekipman ve reaktifler hazırlayın: numune başına iki kepçe, steril 0,45 μm karışık selüloz esterleri membran (MCE) filtreleri, 50 mL steril tüpler, sıvı azot, %70 (vol/vol) etanolde 50 mg/mL kloramfenikol (isteğe bağlı). Sıvı azot buharlaşmasına izin vermek ve kapalı tüplerin patlamasını önlemek için 50 mL tüplerin kapağını delin. Scoopulas'ı ...

Ribozom profillemenin temel teknik zorluğu, belirli bir fizyolojik ilgi durumunda mRNA'larda ribozomların bir anlık görüntüsünü yakalamak için çeviriyi hızla engelleme ihtiyacıdır. Bunu başarmak için, çeviri inhibitörleri, sıvı nitrojende hızlı hasat ve flaş dondurma yaygın olarak kullanılır. Antibiyotik uygulamak isteğe bağlıdır, çünkü eserlere neden olabilirler. Kloramfenikol, bakteriyel RIBO-seq'te uzun ribozomları tutuklamak için yaygın olarak kullanılan bir ilaçtır. Bununla birl...

Ribozom profilleme tekniği (RIBO-seq), Kaliforniya Üniversitesi, San Francisco1'dekiJonathan Weissman'ın laboratuvarında geliştirilmiştir. Ribo-seq, gen ekspresyonunu çeviri düzeyinde incelemek için kullanılan diğer yöntemlere kıyasla, mRNA'ya her ribozom bağlamasına odaklanır ve konumu ve transkriptteki ribozomların göreceli sayısı hakkında bilgi sağlar. Protein sentezi sürecinin in vivo olarak izlenmesini sağlar ve hem bireysel mRNA'da hem de hücredeki tüm transkriptom boyunca ribozom yoğunluğunun ölçülmesine izin veren tek kodon çözünürlüğü ve doğruluğu sağlayabilir. RIBO-seq tekniğinin temelinde, çeviri sırasında ribozomların mRNA molekülünü bağlaması ve böylece transkriptin gömülü parçasını bir ribonükleaz sindiriminden koruması yatmaktadır. Ribonokleaz ek olarak, korunmasız mRNA sindirilir ve ribozomlar tarafından çevrelenmiş parçalar - tipik olarak ~ 28-30 nt uzunluğunda - bozulmadan kalır. Ribozomal ayak izleri (RF) olarak adlandırılan bu parçalar daha sonra izole edilebilir, sıralanabilir ve ribozomların tam konumunun tespit edilmesiyle ortaya çıktıkları transkript üzerine eşlenebilir. Aslında, ribozom yeteneği mRNA parçalarını korumak için ribozom yeteneği 1960'lardan beri ribozomal bağlama ve çeviri başlatma alanlarını (Tİs) incelemek içinkullanılmaktadır 2,3,4. Bununla birlikte, derin sıralama teknolojisindeki ilerleme ile RIBO-seq, ribozom katılımı yoluyla protein sentezi 6 hakkında genom çapında bilgi sağlayabilen çeviri izleme5 için altın bir standarthalinegelmiştir. Ribozom profilleme, transkriptom ve proteom6'nınölçülmesi arasında var olan teknolojik boşluğu doldurdu.
Ribozom profilleme yapmak için, araştırılan koşullar altında büyüyen organizmanın hücre lizatını elde etmeliyiz. Hücre toplama ve lizis sırasında bu koşulların bozulması güvenilmez veriler sağlayabilir. Bunu önlemek için, çeviri inhibitörleri, hızlı hasat ve sıvı azot içinde flaş dondurma yaygın olarak kullanılır. Hücreler, mikser değirmeni7,8 veya boncuk çırpıcı9gibi mekanik bir homojenizatörde kriyojenik taşlama ve pipet10 veya iğne ile tritürasyon ile11ile yutabilir. Lizis tamponu, hücrelerin pulverizasyondan hemen önce veya kısa bir süre sonra eklenebilir. Protokolümüzde, harç ve pestle'yi ön soğutmak için sıvı nitrojenin yanı sıra, sonifikasyon gibi yöntemler uygulandığında sıklıkla karşılaşılan RNA makasını önleyen bakteri hücre duvarının bozulmasına daha nazik bir yaklaşım olarak alüminyum oksit kullanıyoruz. Pulverizasyondan sonra harcın soğutulmuş içeriğine buz gibi bir lizis tamponu ekliyoruz. Uygun bir lizis tamponunun seçilmesi ribozomal ayak izlerinin en iyi çözünürlüğünü elde etmek için önemlidir. İyonik mukavemet hem RF boyutunu hem de okuma çerçevesi hassasiyetini etkilediğinden, tampon bileşiminin mRNA'lar11,12'deribozomal doluluğu etkilemediği görünse bile, düşük iyonik mukavemet ve tampon kapasitesine sahip lizis tamponlarının kullanılması önerilir. Lizis tamponunun önemli bileşenleri, varlığı ribozomal alt ünüllerin ayrışmasını önleyen ve bakteriyel ribozomlardaki spontan konformasyonel değişiklikleri inhibe eden magnezyum iyonlarıdır11,13. Kalsiyum iyonları da önemli bir rol oynar ve bakteriyel ribozom profilleme yönteminde kullanılan mikrokoksal çekirdeğin (MNaze) aktivitesi için gereklidir14. Guanosine ilavesi 5′-[β,γ-imido]trifosfat (GMP-PNP), GTP'nin hidrolize edilemez bir analogu, kloramfenikol ile birlikte liziz sırasında çeviriyi engeller15.
Lysate elde edildiğinde, santrifüjleme ile netleştirilir ve her biri bir RIBO-seq ve aynı anda gerçekleştirildikleri için yüksek verimli toplam mRNA dizilimi (RNA-seq) için iki bölüme ayrılır (Şekil 1). RNA-seq, veri analizi sırasında hem RIBO-seq hem de RNA-seq'ten gelen verilerin karşılaştırılmasına olanak sağlayan bir referans noktası sağlar. Araştırılan translatom, ribozomal ayak izlerinin mRNA bolluğuna normalleştirilmesi ile tanımlanır16. RNA-seq'ten gelen veriler,17kopyalama veya sıralama yapıtlarını tanımlamaya da yardımcı olabilir.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62544/62544fig01.jpg"> Şekil 1. RIBO-seq ve RNA-seq için mRNA örnek hazırlama şemaları. RIBO-seq kitaplığı hazırlanması için RNA, MNase (A) ile sindirilir ve ardından ~28-30 nt uzunluğunda (B) RF boyut seçimi; RNA-seq RNA yalıtılır (C), rRNA (D) tükenmiş ve elde edilen mRNA rastgele değişen uzunluklarda (E) parçalara bölünmüş. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62544/62544fig01large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
RIBO-seq ve RNA-seq için numune hazırlama prosedürünün ilk adımları biraz farklıdır (Şekil 1). Ribozomal profilleme için, ribozomlar tarafından korunmayan mRNA moleküllerini bozmak için lizatın belirli bir endonokleaz tarafından sindirilmesi gerekir. Standart protokollerde, elde edilen monozomlar bir sakkaroz yastığı ultrasantrifüjasyonu veya sakkaroz gradyan ultracentrifugation8,14ile kurtarılır. Bu yazıda, bu adımın bakterilerde RIBO-seq için gerekli RF'yi izole etmek için gerekli olmadığını, aynı şekilde ökaryotik hücreler için18, ve poliakrilamid jelden uygun uzunlukta mRNA parçalarının boyut seçiminin yeterli olduğunu gösteriyoruz.
RNA-seq için mRNA, rRNA'nın toplam RNA'dan tükenmesi ile elde edilir - rRNA molekülleri, streptavidin kaplı manyetik boncuklara bağlanan biyotinillenmiş oligonükleotid problarına melezleşir. RRNA-oligonükleotid-boncuk kompleksleri daha sonra bir mıknatıs ile numuneden çıkarılır ve rRNA tükenmiş bir örnek19,20ile sonuçlanır. Saflaştırılmış mRNA molekülleri daha sonra alkali hidroliz ile rastgele parçalanır. Elde edilen mRNA parçalarının yanı sıra ribozomal ayak izleri cDNA kütüphanelerine dönüştürülür ve derin sıralama için hazırlanır (Şekil 2). Bu, alkali hidroliz (mRNA için) ve enzimatik sindirimden (RF için) sonra ihtiyaç duyulan uç onarımını içerir: 3' uçların defosforilasyonu ve ardından 5' uçların fosforilasyonu. Sonraki adımlar adaptör ligasyonu ve Illumina platformunu kullanarak yeni nesil sıralama (NGS) için gereken sıralarla çerçevelenmiş cDNA eklemeleri oluşturmak için ters transkripsiyondur. Kütüphane hazırlığının son aşaması, yapıların bir kanalda çeşitli örneklerin çoklayıcı ve sıralı olmasına izin vermek için örnek özel barkodlarla yükseltildiği ve etiket edildiği bir PCR reaksiyondur. Sıralamadan önce, kütüphanelerin kalitesi ve miktarı çip üzerindeki yüksek hassasiyetli DNA elektroforez ile değerlendirilir. Uygun parametrelere sahip cDNA kitaplıkları daha sonra havuza alınıp sıralanabilir. Sıralama, kitaplık sayısına, gerekli okuma uzunluğuna ve sıralama derinliğine bağlı olarak MiSeq, NextSeq veya HighSeq gibi farklı Illumina platformlarında gerçekleştirilebilir. Sıralamadan sonra biyoinformatik analiz yapılır.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62544/62544fig02.jpg"> Şekil 2. Kütüphane hazırlığı. Kütüphane hazırlığı, uç onarımını, adaptör ligasyonunu, ters transkripsiyonu ve barkodlama ile amplifikasyonu içerir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62544/62544fig02large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Ribozom profilleme, bilimsel soruya göre kolayca değiştirilebilen ve ayarlanabilen evrensel bir yöntemdir. Başlangıçta maya1'dekullanıldı, ancak bakteri hücrelerine uygulandıktan kısa bir süre sonra21 ve fare10, zebra balığı22,meyve sineği 23 ve Arabidopsis thaliana24dahil olmak üzere ökaryotik model organizmalara uygulandı. Ayrıca farklı ribozom türlerini incelemek için de kullanılmıştır: sitoplazmik, mitokondriyal25,26 ve kloroplast27,28. Ökaryotlarda RIBO-seq, başlatma 10 , 11 , 29 , 30 ,31,32,uzama1,10 , 11,31,33,ribozom oyalama 33 ve uygunlukdeğişikliği33 dahil olmak üzere çevirinin belirli yönlerini araştırmak için yaygın olarak uyarlanmış ve rafine edilmiştir. Değişikliklerin çoğu farklı çeviri inhibitörlerinin kullanımını içerir. Bununla birlikte, bakterilerde, gerekli etki mekanizmasına sahip inhibitörlerin azlığı nedeniyle benzer çalışmaların yapılması zor olmuştur34. Bakterilerde en sık kullanılan çeviri inhibitörü, peptidyl transferaz merkezine (PTC) bağlanan ve A bölgesinde aminoasil-tRNA'nın doğru konumlandırılmasını önleyen kloramfenikoldür (CAM). Sonuç olarak, CAM, uzun ribozomların tutuklanmasına yol açan bir peptit bağı oluşumunu önler35. Bakterilerdeki diğer çeviri inhibitörleri tetrasiklin (TET)36, retapamulin (RET)34 ve Onc11237'dir. A-sitedeki tRNA'nın antikon kök döngüsü ile doğrudan örtüşerek ribozom için tRNA doğumunu önleyen TET, başlangıçta CAM tedavisinden elde edilen sonuçları doğrulamak için uygulanmıştır, çünkü her ikisi de çeviri uzamasını engelleyen antibiyotiklerdir38. TET'nin birincil Tİs'i tespit etmesi bulundu, ancak dahili Tİs36'yıortaya koyamadı. RET, bakteriyel ribozom PTC'sinde bağlanır ve A bölgesinde bir uzay aminoasil-tRNA ile müdahale ederek ilk peptit bağının oluşumunu önler. RET uygulamak, hem birincil hem de dahili TISs34'teribozomların tutuklanmasıyla sonuçlanır. Prolin bakımından zengin bir antimikrobiyal peptit olan Onc112, çıkış tüneline bağlanır ve ribozomal A bölgesinde aminoasil-tRNA bağlamasını engeller. Sonuç olarak, Onc112 başlatma komplekslerinin uzama aşaması37'yegirmesini önler.
Ribozom profillemenin sağladığı ana bilgi ribozom yoğunluğu ve mRNA üzerindeki konumlarıdır. Çeşitli büyüme koşullarında çeviri düzeyinde diferansiyel gen ekspresyonunun araştırılması 1,6 , çeviri verimliliğininölçülması 1,38,39 ve ribozomal duraklama10gibi çeviri düzenleme olaylarını tespit etmek için başarıyla uygulanmıştır. RIBO-seq ayrıca, yeni ve / veya çok kısa protein kodlama genlerinin tanımlanmasına yol açan açıklamalı ncRNA, psödojenler ve açıklamalanmamış küçük açık okuma çerçevelerinin (ORF) çevirisini ortaya çıkarmaya izin verir10,12,22,30,37. Bu gibi durumlarda RIBO-seq genom ek açıklamalarını ince ayar yapabilir ve iyileştirebilir. Çevrilmiş ORF'lerin tanımlanmasına ve nicel doğasına yönelik yüksek hassasiyeti ile ribozom profilleme, proteom tayini için veya proteomik çalışmalara yardımcı olmak için bir vekil görevi de edebilir31,34,39. Ribozom profilleme, Tİs'i haritalayarak bilinen proteinlerin N-terminal genişletilmiş ve kesilmiş izoformlarını ortaya koymaktadır10,32. RIBO-seq ayrıca14 , 21,24proteinlerinin ortak çevirisel katlamasını incelemek için uyarlanmıştır. Buyöntem,1 ,10,39 uzama hızlarının veya bireysel kodonların kod çözme hızlarının ölçülmesine olanak tanır 6 veçevirinin nicel modellerinin geliştirilmesine yardımcı olur17. Ribozom profilleme yöntemi ayrıca7, 15,17,frameshifting 40,stop-codon readthrough 21 , sonlandırma/geri dönüşüm kusurları 41,42ve ribozomal konformasyon değişiklikleri33 ökaryotlarda ribozom duraklaması hakkında mekanistik içgörüler sağlayabilir. RIBO-seq ayrıca 16,43ökaryotlarda miRNAs6 ve RNA bağlayıcı proteinler gibi spesifik trans-etkili faktörlerin çeviri üzerindeki etkisini incelemek için uyarlanmıştır. Bununla birlikte, deneysel tasarımın ve RIBO-seq'in elde edilen çözünürlüğünün, elde edilen sıralama verilerinden çıkarabilecek bilgi miktarını belirlediğini kabul etmek önemlidir12.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10X TBE (powder)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9864</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol, 99%, pure</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>125472500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine 5&#39;-Triphosphate (ATP)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>P0756S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminium oxide calcinated pure p.a.</td>
			<td>Chempur</td>
			<td>114560600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride dihydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C3881-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>190321</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA Clean &#38; Concentrator -5</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>D4004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dnase I recombinant, Rnase-free</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4716728001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA disodium salt</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>E/P140/48</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl Alcohol Absolut 99,8%&#160; Pure-P.A.-Basic</td>
			<td>POCH Avantor Performance Materials Poland S.A</td>
			<td>BA6480111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filtration apparatus</td>
			<td>VWR Collection</td>
			<td>511-0265</td>
			<td>all-glass filtration apparatus, with funnel, fritted base, cap, 47 mm &#216; spring clamp and ground joint flask</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel 40 (19:1)</td>
			<td>Rotiphorese</td>
			<td>3030.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel Loading Dye, Blue, 6X</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E6138G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guanosine 5&#8242;-[&#946;,&#947;-imido]triphosphate trisodium salt hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G0635-25MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>labZAP</td>
			<td>A&#38;A Biotechnology</td>
			<td>040-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium acetate tetrahydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M5661-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MCE membrane fiter</td>
			<td>Alfatec Technology</td>
			<td>M47MCE45GWS</td>
			<td>pore size: 0.45um</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MICROBExpress Bacterial mRNA Purification</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM1905</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiplex Small RNA Library Prep Set for Illumina</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E7300S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-Free Water</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9937</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Acetate Anhydrous Pure P.A.</td>
			<td>POCH Avantor Performance Materials Poland S.A</td>
			<td>744330113</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quick-Load pBR322 DNA-MspI Digest</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E7323A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA Clean &#38; Concentrator -25</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>R1018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2889-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium carbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>223530-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydrogen carbonate pure p.a.</td>
			<td>POCH Avantor Performance Materials Poland S.A</td>
			<td>810530115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR Gold nucleic acid gel stain</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>S11494</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 Polynucleotide Kinase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0201L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 Polynucleotide Kinase Reaction Buffer</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B0201S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBE-Urea Sample Buffer (2x)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>LC6876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris(hydroxymethyl)amino-methane, ultrapure, 99,9%</td>
			<td>AlfaAesar</td>
			<td>J65594</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100, 98%</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>327371000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea G.R.</td>
			<td>lach:ner</td>
			<td>40096-AP0</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ribo-seq in bacteria: a sample collection and library preparation protocol for ngs sequencing

Ribozom profilleme tekniği (RIBO-seq) şu anda protein sentezi sürecini incelemek için en etkili araçtır in vivo. Bu yöntemin avantajı, diğer yaklaşımlara kıyasla, bir mRNA transkriptinde ribozomların konumunu ve sayısını tam olarak haritalayarak çeviriyi izleme yeteneğidir.
Bu yazıda, bakterilerde RIBO-seq yöntemi için numune toplama ve hazırlamanın ardışık aşamalarını açıklar, deneyin planlanması ve yürütülmesi ile ilgili ayrıntıları vurgularız.
RIBO-seq bozulmamış ribozomlara ve ilgili mRNA'lara dayandığından, anahtar adım çevirinin hızlı inhibisyonu ve hücrelerin yeterli parçalanmasıdır. Bu nedenle, bakterilerde çeviriyi tutuklamak için kloramfenikol ile isteğe bağlı bir ön işlemle hücre hasadı için sıvı nitrojende filtrasyon ve flaş dondurma öneriyoruz. Parçalanma için, hücre duvarını mekanik olarak bozmak için alüminyum oksit varlığında donmuş hücrelerin harç ve pestle ile öğütülmeyi öneriyoruz. Bu protokolde, monozomlu saflaştırma için sakkaroz yastığı veya sakkaroz gradyan ultrasantrifüj gereklidir. Bunun yerine poliakrilamid jel elektroforez (PAGE) kullanılarak mRNA ayrımı ve ardından ribozomal ayak izi eksizyonu (28-30 nt bandı) uygulanır ve tatmin edici sonuçlar sağlar. Bu, yöntemi büyük ölçüde basitleştirir ve prosedür için zaman ve ekipman gereksinimlerini azaltır. Kütüphane hazırlığı için, New England Biolabs'tan Illumina dizilimi için piyasada bulunan küçük RNA kitini kullanmanızı öneririz, üreticinin yönergelerini bir dereceye kadar optimizasyonla takip edin.
Elde edilen cDNA kitaplıkları, yeni nesil sıralama (NGS) için gereken uygun miktar ve kaliteyi sunar. Açıklanan protokole göre hazırlanan kütüphanelerin sıraya dizilimi, kapsamlı biyoinformatik analiz için yeterli veri sağlayan örnek başına 2 ila 10 mln benzersiz haritalı okuma ile sonuçlanır. Sunduğumuz protokol hızlı ve nispeten kolaydır ve standart laboratuvar ekipmanları ile gerçekleştirilebilir.

Burada sunulan örnek sonuçlar, WT Bacillus subtilis hücrelerinin sporulating çeviri düzenlemesini inceleyen bir çalışmada elde edilmiştir. Gecekültürleri, 100 mL zengin ortamda 0,1'e eşit OD 600'e seyreltildi ve OD600 0,5-0,6'ya ulaşana kadar kuvvetli sarsıntı ile 37 °C'de kuluçkaya yatırıldı. Zengin ortam daha sonra sporülasyon sürecini teşvik etmek için minimum ortamla değiştirildi ve kuluçka dört saate kadar devam etti. Hücreler her saat T0 ile başlayarak ha...

Watch this Scientific Journal Video about RIBO-seq in Bacteria: a Sample Collection and Library Preparation Protocol for NGS Sequencing at JoVE.com

RIBO-seq in Bacteria: a Sample Collection and Library Preparation Protocol for NGS Sequencing

Burada bakterilerde RIBO-seq için numune toplama ve hazırlama aşamalarını açıklıyoruz. Bu yönergelere göre hazırlanan kütüphanelerin sıraya dizilimi, kapsamlı biyoinformatik analiz için yeterli veri ile sonuçlanır. Sunduğumuz protokol basittir, standart laboratuvar ekipmanlarını kullanır ve lizizden kütüphanelerin eldeine kadar yedi gün sürer.

Bakterilerde RIBO-seq: NGS Dizilimi için Örnek Toplama ve Kütüphane Hazırlama Protokolü

The ribosome profiling technique (RIBO-seq) is currently the most effective tool for studying the process of protein synthesis in vivo. The advantage of ...

RIBO-seq olarak da adlandırılan ribozom profilleme tekniği, şu anda in vivo protein sentezi sürecini incelemek için en etkili araçtır. Bu yöntemin avantajı, ribozomların konumunu ve sayısını tam olarak haritalayarak çeviriyi izleme yeteneğidir. RIBO-seq, ribozomların mRNA molekülüne bağlanarak, ribonükleaz sindirimi üzerine transkriptin gömülü parçasını koruduğu gerçeğine dayanır.Ribozomal ayak izleri olarak adlandırılan elde edilen parçalar, ribozomların tam konumunun belirlenmesine neden olarak, çıktıkları transkript üzerine sıralanabilir ve eşlenebilir. RIBO-seq ile eş zamanlı olarak, bir referans noktası sağlamak ve veri analizi sırasında hem RIBO-seq hem de RNA-seq'ten gelen verilerin karşılaştırılmasını sağlamak için yüksek aktarım hızı toplam mRNA dizilimi gerçekleştirilir. Hücreler hasat etmeden önce, isteğe bağlı olarak, çeviriyi engellemek için bakteri kültürüne, mililitre başına 100 mikrogramlık son konsantrasyona kloramfenikol ekleyebilirsiniz.Kültürü antibiyotikle bir dakika kuluçkaya yatır. Çeviri inhibisyonu numune toplama süresini uzatmaya izin verdiğinden, hasat normalden daha uzun sürüyorsa bu adım önemlidir. Numuneleri önceden ısıtılmış bir filtreleme sistemi ile toplayın.Büyüme koşullarını taklit etmek için sallamayı tanıtabilirsiniz. Tüm ortamlar zardan geçtiğinde filtrelemeyi durdurun, ancak filtrenin tamamen kurumasına izin vermeyin. Önceden ısıtılmış, dezenfekte edilmiş bir kepçe kullanarak filtre diskinin hücrelerini hızla kazıyarak bakteriyel peletleri toplayın.Hasat edilen hücrelerle birlikte tüm kepçeyi hemen sıvı azotla dolu 50 mililitrelik tüpe yerleştirin. Hasat edilen pelet tamamen sıvı nitrojenle kaplanmalıdır. Peletin iyice donmasına izin verin ve daha önce soğutulmuş bir kepçe kullanarak donmuş hücreleri yerinden sökün.Kapağı kapatın ve delinmiş olduğundan emin olun. Sıvı nitrojen, buharlaşma üzerine basınç değişimi nedeniyle kapalı kapların patlamasına neden olabileceği için bu önemlidir. Iysase için gmpp, DNA çubuğu ve taze Eppendorf tüpleri hazırlayın.Gerekirse kloramfenikol ilavesi ile lizis tamponu hazırlayın. Numune başına 500 mikrolitre lizis tamponu ayrı Eppendorf tüplerine ayırın ve buza yerleştirin. Laboratuvar dezenfektanı ve% 70 etanol ile harç ve pestle dekontamine edin.Harcın içine sıvı azot dökerek serin harç ve pestle. Donmuş bakteri peletini önceden soğutulmuş bir harç içine aktarın ve bir toz haline getirin. Yaklaşık bir hacim alüminyum oksit ekleyin ve taşlamaya devam edin.Harcın içeriğinin çözülmesine izin vermemek için gerektiğinde sıvı azot dökerek harcı, pestleyi ve hücreleri serin tutun. Kullanmadan hemen önce, lizis tampon aliquot içine GMPPNP ve DNA çubuğu ekleyin. Çözeltiyi harcın içine aktarın ve taşlamaya devam edin.Taşlama yaparken iysase'nin yavaşça çözülmesine izin verin. Iysase tamamen çözüldüğünde, karışımı önceden soğutulmuş Eppendorf tüpüne aktarın ve buza geri dönün. Santrifüj lysase 20,0000 G'de dört santigrat derecede beş dakika.Süpernatantları taze, önceden soğutulmuş Eppendorf tüplerine aktarın ve buza yerleştirin. Her seyreltilmiş numunedeki RNA konsantrasyonu NanoDrop ile ölçün. Her bir lisatı RIBO-seq için 0,5 ila 1 miligram RNA ve geri kalanını RNA-seq için olmak üzere iki bölüme bölün.RNA'nın bir miligramında, Tris pH 8'e 3,8 mikrolitre MNase ekleyin ve toplam 500 mikrolitre hacmine lizis tamponu ile üst üste yerleştirin. 25 santigrat derecede, dakikada 300 mermi, 45 dakika kuluçkaya yatır. Kuluçka tamamlandığında, numuneleri piyasada bulunan bir RNA temizleme kiti ile temizleyin.Sekiz azı dişi üre ile %15 poliakrilamid TBE jeli hazırlayın ve TBE tamponlu bir tanka yerleştirin. 200 voltluk sabit voltajda en az 10 dakika önceden çalıştırın. Numuneleri TBE-Üre numune tamponu ile karıştırın.Bir dakika boyunca 95 santigrat derecede denatüre edin ve hemen buza yerleştirin. Bir şırınna kullanarak jel kuyularına TBE tamponu enjekte ederek üreyi yıkayın. Her numuneyi ayırmak ve çapraz kontaminasyonu önlemek için aralarında bir kuyu boşluğu bırakarak numuneleri yükleyin.İşaretleyici olarak 29 nükleotid uzunluğunda oligo ve 26 ve 32 nükleotid uzunluğunda oligo karışımı kullanın. Elektroforezini 180 voltluk sabit bir voltajda çalıştırın. Gecelik inkübasyon için steril tampon hazırlayın.Elektroforez bittikten sonra jeli SYBR Gold ile lekelayın. Jelin 26 ila 32 nükleotit arasındaki parçalarını steril bir iğne veya jiletle kesin ve jel parçalarını ayrı Eppendorf tüplerine yerleştirin. Numuneler arasındaki iğneyi veya jile bıçağı değiştirin.Her Eppendorf'a 200 mikrolitre gece kuluçka tamponu ekleyin ve numuneleri bir gecede dakikada 1000 mermi, 10 santigrat derecede kuluçkaya bırakın. Ertesi gün, numuneleri RNA temizleme kiti ile temizleyin ve 18 mikrolitre çekirdeksiz suya boşaltın. Elde edilen ribozomal ayak izleri kütüphane hazırlığı için hazırdır.Piyasada bulunan bir kit kullanarak RNA-seq örnekleri için ribozomal RNA tükenmesi gerçekleştirin. Ardından, numuneleri RNA temizleme kiti ile temizleyin. Alkali hidrolizi aşağıdaki gibi gerçekleştirin;alkali hidroliz tamponu hazırlayın, numunenin bir hacmine bir hacim tampon ekleyin ve 25 dakika boyunca 95 santigrat derecede kuluçkaya yatırın.Reaksiyonun durdurulması için her numuneye beş mikrolitre 3 Molar sodyum asetat pH 5.5 ekleyin. Numuneleri RNA temizleme kiti ile temizleyin ve 18 mikrolitre çekirdeksiz suya boşaltın. Elde edilen rastgele parçalanmış RNA kütüphane hazırlığı için hazırdır.Her numuneye 10 mikrolitre 10x reaksiyon tamponu ve beş mikrolitre T4 polinükleotid kinaz ekleyin. Bir buçuk saat boyunca 37 santigrat derecede kuluçkaya yaslanın. Bu süreden sonra, bir milimolar ATP'nin üç mikrolitresini ekleyin ve bir saat boyunca 37 santigrat derecede kuluçkaya yatırın.Ardından, numuneleri RNA temizleme kiti ile temizleyin. Burada sağlanan protokole göre, piyasada bulunan kiti kullanarak kütüphane hazırlığı gerçekleştirin. %6 poliakrilamid jel kullanarak PAGE gerçekleştirin.Jeli SYBR Gold ile lekele. Kütüphaneleri içeren tüketim jeli parçaları. RNA-seq örnekleri için kütüphane 135 ila 180 nükleotit, RIBO-seq için ise 135 ila 170 nükleotid arasındadır.Steril iğneler veya jiletler kullanın ve eksiz jel parçalarını ayrı Eppendorf tüplerine yerleştirin. Numuneler arasında iğneyi veya jile bıçağı değiştirmeyi unutmayın. Her eksiz jel parçasına 100 mikrolitre çekirdeksiz su ekleyin.Ve onları 10 santigrat derecede kuluçkaya yatır, dakikada 450 mermi, bir gecede. Ertesi gün, örnekleri DNA temizleme kiti ile temizleyin. Elde edilen kütüphaneler, yüksek hassasiyetli kalite ve miktar kontrolüne, çip üzerinde DNA elektroforezi ve daha sonra yeni nesil sıralama için hazırdır.Elde edilen cDNA kütüphaneleri, yüksek hassasiyetli DNA çip üzerinde elektroforezi ile doğrulanan yeni nesil sıralama için gerekli olan uygun bir miktar ve kalite sunar. RIBO-seq kitaplıklarını temsil eden bantlar ve tepeler, RNA-seq kitaplıklarını temsil edene kıyasla daha dar ve daha iyi tanımlanmıştır. Çip üzerindeki elektroforezlere göre kütüphaneler beklenen merceklere sahip.RIBO-seq kitaplıklarında bulunan 200 baz çiftine yakın ek tepeler, hazırda bekletilen ribozomları, tamamen sindirilmemiş ribozomal ayak izlerini veya rRNA gibi eserleri gösterebilir ve sıralamadan elde edilen veriler kırpıldığında ve rRNA tRNA filtrelendiğinde biyoinformatik analiz sırasında atılabilir. Kütüphane hazırlamada üretilen ortalama cDNA miktarı 32 nanogramdır ve yeni nesil sıralama için yeterli miktarda malzeme sağlar. Çipli elektroforezi ile kalite kontrolünden sonra, bir Illumina'nın NextSeq 500 platformunda tek ve 50 baz çifti dizilimi için kütüphaneler çekildi.Adaptörlerin ve düşük kaliteli dizilerin kırpılması, RNA-seq örnekleri için örnek başına 25 ila 47 milyon okuma ve RIBO-seq örnekleri için örnek başına 25 ila 50 milyon okuma ile sonuçlandı. Elde edilen veriler FastQC ile kalite kontrolü kontrol edildi. Hem RNA-seq hem de RIBO-seq örnekleri çok kaliteli sundu.Açıklanan protokole göre hazırlanan kütüphanelerin haritalandırılması, RNA-seq örnekleri için örnek başına 2,4 ila 9,6 milyon, RIBO-seq örnekleri için 2,3 ila 10,4 milyon benzersiz haritalı okuma sağladı. RIBO-seq verileri, RNA-seq verilerinde gözlenmeyen ribozomal ayak izlerinin başlangıç ribozomlarına ve karakteristiğine karşılık gelen üç periyodiklik ve uzun, dar bir tepe sergiler. Ayrıca, kodlama dizilerindeki ribozomal ayak izlerinin ve mRNA parçalarının ortalama kapsama profillerini gösteren çizim, beklendiği gibi RIBO-seq veri kümesindeki CDS'lerle eşlenen okumaların daha yüksek oranını ortaya koymaktadır.Eşlenen ribozomal ayak izlerinin görselleştirilmesi, sakkaroz gradyan ultrasantrifüjasyonu ile monozomlu iyileşmeyi içeren standart RIBO-seq prosedürüne göre gerçekleştirilen aynı deneyden elde edilen sonuçlara kıyasla çok benzer desenler göstermiştir. Protokolümüz, çeviri düzenlemesini çeşitli büyüme koşullarında araştırmak için kullanılmıştır, ancak çeviri başlatma sitelerinin ve yeni protein kodlama genlerinin tespiti gibi çevirinin diğer yönlerini incelemek için uygulanabilir. Kılavuzlarımıza göre hazırlanan kütüphanelerin sıraya dizilimi, kapsamlı biyoinformatik analiz için yeterli veri ile sonuçlanır.Burada sunduğumuz protokol hızlı, kolay ve uygun maliyetlidir ve standart laboratuvar ekipmanları ile gerçekleştirilebilir.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

Kütle spektrometresi tabanlı kimlik RNA-bağlama bölgelerinin için numune hazırlama

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

An All-in-one Sample Holder for Macromolecular X-ray Crystallography with Minimal Background Scattering

Minimal arka plan saçılma ile Macromoleküler X-ışını Kristalografi için bir hepsi bir arada örnek tutucu

Macromolecular X-ray crystallography (MX) is the most prominent method to obtain high-resolution three-dimensional knowledge of biological macromolecules. ...

A Plasma Sample Preparation for Mass Spectrometry using an Automated Workstation

Otomatik İş İstasyonu Kullanarak Kütle Spektrometresi Için Plazma Numune Spektrometresi Hazırlığı

Sample preparation for mass spectrometry analysis in proteomics requires enzymatic cleavage of proteins into a peptide mixture. This process involves ...

Sample Preparation for Probe Electrospray Ionization Mass Spectrometry

Probuelektrosprey Iyonizasyon Kütle Spektrometresi için Örnek Hazırlama

Mass spectrometry (MS) is a powerful tool in analytical chemistry because it provides very accurate information about molecules, such as mass-to-charge ...

TMT Sample Preparation for Proteomics Facility Submission and Subsequent Data Analysis

Proteomik Tesis Gönderimi ve Müteakip Veri Analizi için TMT Örnek Hazırlama

Proteomic technologies are powerful methodologies that can aid our understanding of mechanisms of action in biological systems by providing a global view ...

MS2-Affinity Purification Coupled with RNA Sequencing in Gram-Positive Bacteria

MS2-Benzeşim Saflaştırma gram-pozitif bakterilerde RNA Dizilimi ile birleştiğinde

Although small regulatory RNAs (sRNAs) are widespread among the bacterial domain of life, the functions of many of them remain poorly characterized ...

NMR-Based Fragment Screening in a Minimum Sample but Maximum Automation Mode

Minimum numune ancak maksimum otomasyon modunda NMR tabanlı parça taraması

Fragment-based screening (FBS) is a well-validated and accepted concept within the drug discovery process both in academia and industry. The greatest ...

A Sample Preparation Pipeline for Microcrystals at the VMXm Beamline

VMXm Beamline'da Mikrokristaller için Örnek Hazırlama Boru Hattı

The mounting of microcrystals (&#60;10 &#181;m) for single crystal cryo-crystallography presents a non-trivial challenge. Improvements in data quality ...

Sample Preparation and Transfer Protocol for In-Vacuum Long-Wavelength Crystallography on Beamline I23 at Diamond Light Source

Diamond Light Source'daki Beamline I23'te Vakum İçi Uzun Dalga Boyu Kristalografisi için Örnek Hazırlama ve Transfer Protokolü

Long-wavelength macromolecular crystallography (MX) exploits the anomalous scattering properties of elements, such as sulfur, phosphorus, potassium, ...

Preparation of High-Temperature Sample Grids for Cryo-EM

Cryo-EM için Yüksek Sıcaklık Numune Izgaralarının Hazırlanması

The sample grids for cryo-electron microscopy (cryo-EM) experiments are usually prepared at a temperature optimal for the storage of biological samples, ...