Name: quantification of cellular densities and antigenic properties using magnetic levitation
Uploaded: 2021-05-17T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantification of Cellular Densities and Antigenic Properties using Magnetic Levitation at JoVE.com

Yazarlar, dr. Getulio Pereira'ya hücre dışı vezne çalışmalarındaki yardımları için teşekkür eder.
Bu çalışma ICG'ye aşağıdaki Ulusal Sağlık Enstitüsü hibeleri tarafından desteklendi: RO1CA218500, UG3HL147353 ve UG3TR002881.

Bu çalışmada kullanılan deneysel protokol Beth Israel Deaconess Tıp Merkezi Kurumsal İnceleme Kurulu (IRB) tarafından onaylanmıştır.
1. Enstrüman kurulumu
NOT: Görüntüleme yükseltici hücreler, manyetik bir alan oluşturmak için aynı kutup birbirine bakacak şekilde z ekseninde mıknatıslanmış iki nadir toprak neodimyum mıknatısı gerektirir. Mıknatıslar arasındaki mesafe, manyetik alanın yoğunluğuna ve hedeflerin yoğunluğuna bağlı olar...

<ol>
	<li>Tasoglu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Levitational+Image+Cytometry+with+Temporal+Resolution.">Levitational Image Cytometry with Temporal Resolution.</a> Advanced Materials. 27 (26), 3901-3908 (2015).</li><li>Durmus, N. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnetic+levitation+of+single+cells.">Magnetic levitation of single cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (28), 3661-3668 (2015).</li><li>Knowlton, S., Yu, C. H., Jain, N., Ghiran, I. C., Tasoglu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Smart-Phone+Based+Magnetic+Levitation+for+Measuring+Densities.">Smart-Phone Based Magnetic Levitation for Measuring Densities.</a> PLoS One. 10 (8), 0134400 (2015).</li><li>Ashkarran, A. A., Suslick, K. S., Mahmoudi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnetically+Levitated+Plasma+Proteins.">Magnetically Levitated Plasma Proteins.</a> Analytical Chemistry. 92 (2), 1663-1668 (2020).</li><li>Yaman, S., Tekin, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnetic+Susceptibility-Based+Protein+Detection+Using+Magnetic+Levitation.">Magnetic Susceptibility-Based Protein Detection Using Magnetic Levitation.</a> Analytical Chemistry. 92 (18), 12556-12563 (2020).</li><li>Abrahamsson, C. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Powders+Containing+Illicit+Drugs+Using+Magnetic+Levitation.">Analysis of Powders Containing Illicit Drugs Using Magnetic Levitation.</a> Angewandte Chemie Internation Edition in English. 59 (2), 874-881 (2020).</li><li>Trajkovic, K., Valdez, C., Ysselstein, D., Krainc, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluctuations+in+cell+density+alter+protein+markers+of+multiple+cellular+compartments,+confounding+experimental+outcomes.">Fluctuations in cell density alter protein markers of multiple cellular compartments, confounding experimental outcomes.</a> PLoS One. 14 (2), 02117227 (2019).</li><li>Hart, A., Edwards, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Buoyant+density+fluctuations+during+the+cell+cycle+of+Bacillus+subtilis.">Buoyant density fluctuations during the cell cycle of Bacillus subtilis.</a> Archives of Microbiology. 147 (1), 68-72 (1987).</li><li>Poole, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluctuations+in+buoyant+density+during+the+cell+cycle+of+Escherichia+coli+K12:+significance+for+the+preparation+of+synchronous+cultures+by+age+selection.">Fluctuations in buoyant density during the cell cycle of Escherichia coli K12: significance for the preparation of synchronous cultures by age selection.</a> The Journal General Microbiology. 98 (1), 177-186 (1977).</li><li>Cass, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Density-dependent+fluctuations+in+membrane+permeability+in+logarithmically+growing+cell+cultures.">Density-dependent fluctuations in membrane permeability in logarithmically growing cell cultures.</a> Experimental Cell Research. 73 (1), 140-144 (1972).</li><li>Grover, W. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+single-cell+density.">Measuring single-cell density.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (27), 10992-10996 (2011).</li><li>Bryan, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+single+cell+mass,+volume,+and+density+with+dual+suspended+microchannel+resonators.">Measuring single cell mass, volume, and density with dual suspended microchannel resonators.</a> Lab on a Chip. 14 (3), 569-576 (2014).</li><li>Gomer, R. H., Jang, W., Brazill, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+density+sensing+and+size+determination.">Cell density sensing and size determination.</a> Development, Growth and Differentiation. 53 (4), 482-494 (2011).</li><li>Neurohr, G. E., Amon, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relevance+and+Regulation+of+Cell+Density.">Relevance and Regulation of Cell Density.</a> Trends in Cell Biology. 30 (3), 213-225 (2020).</li><li>Maric, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomical+gradients+in+proliferation+and+differentiation+of+embryonic+rat+CNS+accessed+by+buoyant+density+fractionation:+alpha+3,+beta+3+and+gamma+2+GABAA+receptor+subunit+co-expression+by+post-mitotic+neocortical+neurons+correlates+directly+with+cell+buoyancy.">Anatomical gradients in proliferation and differentiation of embryonic rat CNS accessed by buoyant density fractionation: alpha 3, beta 3 and gamma 2 GABAA receptor subunit co-expression by post-mitotic neocortical neurons correlates directly with cell buoyancy.</a> European Journal of Neuroscience. 9 (3), 507-522 (1997).</li><li>Maric, D., Maric, I., Barker, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Buoyant+density+gradient+fractionation+and+flow+cytometric+analysis+of+embryonic+rat+cortical+neurons+and+progenitor+cells.">Buoyant density gradient fractionation and flow cytometric analysis of embryonic rat cortical neurons and progenitor cells.</a> Methods. 16 (3), 247-259 (1998).</li><li>Wolff, D. A., Pertoft, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separation+of+HeLa+cells+by+colloidal+silica+density+gradient+centrifugation.+I.+Separation+and+partial+synchrony+of+mitotic+cells.">Separation of HeLa cells by colloidal silica density gradient centrifugation. I. Separation and partial synchrony of mitotic cells.</a> Journal of Cell Biology. 55 (3), 579-585 (1972).</li><li>Bienz, K., Egger, D., Wolff, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virus+replication,+cytopathology,+and+lysosomal+enzyme+response+of+mitotic+and+interphase+Hep-2+cells+infected+with+poliovirus.">Virus replication, cytopathology, and lysosomal enzyme response of mitotic and interphase Hep-2 cells infected with poliovirus.</a> Journal of Virology. 11 (4), 565-574 (1973).</li><li>Baldwin, W. W., Kubitschek, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Buoyant+density+variation+during+the+cell+cycle+of+Saccharomyces+cerevisiae.">Buoyant density variation during the cell cycle of Saccharomyces cerevisiae.</a> Journal of Bacteriology. 158 (2), 701-704 (1984).</li><li>Yurinskaya, V. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thymocyte+K+,+Na++and+water+balance+during+dexamethasone-+and+etoposide-induced+apoptosis.">Thymocyte K+, Na+ and water balance during dexamethasone- and etoposide-induced apoptosis.</a> Cellular Physiology and Biochemistry. 16 (1-3), 15-22 (2005).</li><li>Wyllie, A. H., Morris, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hormone-induced+cell+death.+Purification+ad+properties+of+thymocytes+undergoing+apoptosis+after+glucocorticoid+treatment.">Hormone-induced cell death. Purification ad properties of thymocytes undergoing apoptosis after glucocorticoid treatment.</a> American Journal of Pathology. 109 (1), 78-87 (1982).</li><li>Morris, R. G., Hargreaves, A. D., Duvall, E., Wyllie, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hormone-induced+cell+death.+2.+Surface+changes+in+thymocytes+undergoing+apoptosis.">Hormone-induced cell death. 2. Surface changes in thymocytes undergoing apoptosis.</a> American Journal of Pathology. 115 (3), 426-436 (1984).</li><li>Benson, R. S., Heer, S., Dive, C., Watson, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+cell+volume+loss+in+CEM-C7A+cells+during+dexamethasone-induced+apoptosis.">Characterization of cell volume loss in CEM-C7A cells during dexamethasone-induced apoptosis.</a> American Journal of Physiology. 270 (4), 1190-1203 (1996).</li><li>Zipursky, A., Bow, E., Seshadri, R. S., Brown, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukocyte+density+and+volume+in+normal+subjects+and+in+patients+with+acute+lymphoblastic+leukemia.">Leukocyte density and volume in normal subjects and in patients with acute lymphoblastic leukemia.</a> Blood. 48 (3), 361-371 (1976).</li><li>Huber, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparative+study+of+the+buoyant+density+distribution+of+normal+and+malignant+lymphocytes.">A comparative study of the buoyant density distribution of normal and malignant lymphocytes.</a> British Journal of Haematology. 40 (1), 93-103 (1978).</li><li>Griwatz, C., Brandt, B., Assmann, G., Zanker, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+immunological+enrichment+method+for+epithelial+cells+from+peripheral+blood.">An immunological enrichment method for epithelial cells from peripheral blood.</a> Journal of Immunological Methods. 183 (2), 251-265 (1995).</li><li>Andersen, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Novel+Implementation+of+Magnetic+Levitation+to+Quantify+Leukocyte+Size,+Morphology,+and+Magnetic+Properties+to+Identify+Patients+with+Sepsis.">A Novel Implementation of Magnetic Levitation to Quantify Leukocyte Size, Morphology, and Magnetic Properties to Identify Patients with Sepsis.</a> Shock. , (2018).</li><li>Felton, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+and+quantification+of+subtle+changes+in+red+blood+cell+density+using+a+cell+phone.">Detection and quantification of subtle changes in red blood cell density using a cell phone.</a> Lab on a Chip. 16 (17), 3286-3295 (2016).</li><li>Goldmacher, V. S., Tinnel, N. L., Nelson, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+that+pinocytosis+in+lymphoid+cells+has+a+low+capacity.">Evidence that pinocytosis in lymphoid cells has a low capacity.</a> Journal of Cellular Biology. 102 (4), 1312-1319 (1986).</li></ol>

Degrade santrifüjleme şu anda hücre altı bileşenleri benzersiz yoğunluklarına göre izole etmek için standart tekniktir. Ancak bu yaklaşım, özel degrade ortamın yanı sıra santrifüj ekipmanının kullanılmasını gerektirir. Burada sunulan manyetik yükselme yaklaşımı, dolaşımdaki hücrelerin morfolojik ve fonksiyonel özelliklerinin ayrıntılı bir şekilde araştırılmasına izin verir, minimum, hücrelerin herhangi bir manipülasyonu durumunda, dolaşımdaki hücrelere yakın bir in vivo...

Manyetik yükselme, hücre tipleri 1 ,2, 3,proteinler4,5ve opioid6'yı sadece spesifik yoğunluklarına ve paramanyetik özelliklerine göreayırmak, analiz etmek ve tanımlamak için geliştirilmiş bir tekniktir. Hücre yoğunluğu, metabolik hızı ve farklılaşma durumu 7 , 8 ,9, 10 , 11,12,13,14ile doğrudan ilişkili her hücre tipininbenzersiz,içsel bir özelliğidir. Sabit durum koşullarında ve çeşitli hücre süreçlerinde hücre yoğunluğundaki ince ve geçici değişiklikleri ölçmek, hücre fizyolojisi ve patofizyolojisi hakkında eşsiz bir içgörü sağlayabilir. Hücre yoğunluğundaki değişiklikler hücre farklılaşması15,16, hücre döngüsü ilerlemesi 9 ,17,18,19,apoptoz 20 ,21,22,23ve kötü huylu dönüşüm24 , 25,26 ileilişkilidir. . Bu nedenle, hücre yoğunluğundaki belirli değişikliklerin nicelemesi, farklı türdeki hücreler arasında ayrım yapmak ve çeşitli aktivasyon işlemlerinden geçen aynı hücre türleri arasında ayrım yapmak için kullanılabilir. Bu, yoğunluktaki dinamik değişikliklerin değiştirilmiş hücre metabolizmasının bir göstergesi olarak hizmet ettiği belirli bir hücre alt popülasyonu hedefleyen deneylere olanak tanır27. Bir hücrenin değişen bir ortama yanıt olarak yoğunluğunu değiştirebileceği tespit edildiği için7, hücrenin kinetiğini tam olarak anlamak için yoğunluğuna göre ölçmek zorunludur, hangi mevcut yöntemler12sağlamayabilir. Öte yandan manyetik yükselme, hücrelerin ve özelliklerinin dinamik bir şekilde değerlendirilmesini sağlar28.
Hücreler diamanyetiktir, yani kalıcı bir manyetik dipol momenti olmazlar. Bununla birlikte, harici bir manyetik alana maruz kaldığında, hücrelerde uygulanan alanın tersi yönde zayıf bir manyetik dipol momenti oluşur. Böylece, hücreler paramanyetik bir çözeltide askıya alınır ve güçlü bir dikey manyetik alana maruz kalırsa, manyetik kaynaktan uzaklaşır ve öncelikle bireysel yoğunluklarına bağlı olarak bir yüksekliğe dururlar. Aşağıdaki iki kriter yerine getirildiğinde, en az sayıdaki bir inhomogeneous manyetik alanla sınırlı bir nesnenin diamanyetik olarak yükselmesi mümkündür: 1) parçacığın manyetik duyarlılığı çevredeki ortamınkinden daha küçük olmalı ve 2) manyetik kuvvet, parçacığın yüzdürme kuvvetini dengelemek için yeterince güçlü olmalıdır. Her iki kriter de RBI'ların manyetik bir tamponda askıya alınması ve küçük, ucuz, piyasada bulunan kalıcı mıknatıslarla güçlü manyetik alan gradyanları oluşturularak yerine getirilebilir1. Manyetik olarak sıkışmış bir parçacığın yerçekimi yönü boyunca bir eksen üzerindeki dengesi, yoğunluğu (tamponun yoğunluğuna göre), manyetik duyarlılığı (tamponun manyetik duyarlılığına göre) ve uygulanan manyetik alanın imzası ile belirlenir. Çözeltinin yoğunluğu ve manyetik özellikleri sistem genelinde sabit olduğundan, hücrelerin iç yoğunluk özellikleri, hücrelerin yükselme yüksekliğini belirleyen ana faktör olacaktır, daha yoğun hücreler daha az yoğun hücrelere kıyasla daha düşük yükselir. Bu yaklaşım, yoğunluk ölçümleri için hassas, oranmetrik analiz kullanmamızı sağlayan iki yoğunluk referans boncuk seti (1,05 ve 1,2 g/mL) kullanır. Manyetik çözeltinin konsantrasyonunun değiştirilmesi, dolaşımdaki hücrelerin yoğunluğu hücreye özgü olduğundan, RBI'lar gibi farklı hücresel popülasyonları WBC'lerden izole etmeyi sağlar, bu da izolasyon protokollerine veya diğer hücre manipülasyonuna olan ihtiyacı ortadan kaldırır.
Biyoloji araştırmalarında kullanılan algılama yöntemlerinin çoğu, doğrusal sinyallerin ölçülmesi kolay hale gelen belirli bağlama olaylarının tahmin edilmesine dayanır. Bu okuma yöntemleri genellikle karmaşıktır ve özel ekipman ve özel bilimsel personel içerir. Hücrelerin plazma zarında veya hücre dışı vezikliklerde bulunan veya plazmada çözünebilen antijenlerin bir veya iki antikor kaplı boncuk kullanılarak tespitini amaçlayan bir yaklaşım burada açıklanmıştır. Boncuklar birbirinden ve sorgulanan hedeflerinkinden farklı yoğunluklarda olmalıdır. Herhangi bir biyofluidde hedef antijenin varlığı, bir algılama parçasına bağlı bir antijen pozitif hücrenin yükselme yüksekliğinde belirli, ölçülebilir bir değişikliğe çevrilir. Çözünür antijenler veya hücre dışı veziklinler durumunda, boncuk hücre kompleksi yerine boncuk-boncuk kompleksi oluşturan boncukları hem yakalama hem de algılamaya bağlıdırlar. Yükselme yüksekliğindeki değişiklik boncuk hücre veya boncuk-boncuk komplekslerinin yeni yoğunluğuna bağlıdır. Komplekslerin yükselme yüksekliğindeki değişikliğe ek olarak, biyofluidde antijen varlığını gösteren, komplekslerin sayısı da hedef miktarına bağlıdır, bu da manyetik yükselmeyi antijen tespiti için nicel bir yaklaşım24.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid hydrate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M-2933</td>
			<td>(MES); component of activation buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50x2.5x1 mm magnets, Nickel (Ni-Cu-Ni) plated, grade N52, magnetized through 5mm (0.197&#34;) thickness</td>
			<td>K&#38;J Magnetics</td>
			<td>Custom</td>
			<td>Magnets used for the magnetic levitation device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capillary Tube Sealant (Critoseal)</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>267620</td>
			<td>Used to cap the ends of the capillary tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tube filters (Corning Costar Spin-X)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>CLS8163</td>
			<td>Used to wash beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compact Lab Jack</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>LJ750</td>
			<td>Used for adjusting the magnetic levitation device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS, no calcium, no magnesium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-144</td>
			<td>Solution for bead suspensions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanolamine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E9508-100ML</td>
			<td>Used during a wash step for beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent Plasma Membrane Stain (CellMask Green)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C37608</td>
			<td>Used to stain Rh+ cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gadoteridol Injection</td>
			<td>ProHance</td>
			<td>NDC 0270-1111-03</td>
			<td>Gadolinium (Gd3+); magnetic solution used to suspend cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS++</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14025-092</td>
			<td>Solution for sample preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human C5b,6 complex</td>
			<td>Complement Technology, Inc</td>
			<td>A122</td>
			<td>Used to generate RBC Evs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human C7 protein</td>
			<td>Complement Technology, Inc</td>
			<td>A124</td>
			<td>Used to generate RBC Evs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human C8 protein</td>
			<td>Complement Technology, Inc</td>
			<td>A125</td>
			<td>Used to generate RBC Evs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human C9 protein</td>
			<td>Complement Technology, Inc</td>
			<td>A126</td>
			<td>Used to generate RBC Evs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini Series Post Collar</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>MSR2</td>
			<td>Used to secure magnetic levitation device to lab jacks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-(3-Dimethylaminopropyl)-N&#8242;-ethylcarbodiimide hydrochloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E1769-10G</td>
			<td>(EDC); used in antibody coupling reaction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Rabbit IgG Control</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>AB-105-C</td>
			<td>Used to coat beads as a control condition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (10X Solution, pH 7.4)</td>
			<td>Boston Bioproducts</td>
			<td>BM-220</td>
			<td>Component of coupling buffer, used for washing steps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polysorbate 20 (Tween 20)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P7949-500ML</td>
			<td>Component of activation buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene Carboxyl Polymer</td>
			<td>Bangs Laboratories</td>
			<td>PC06004</td>
			<td>Top density beads (1.05 g/mL), used for antibody coupling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit RhD Polyclonal Antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>PA5-112694</td>
			<td>Used to coat beads for the dectection of Rh factor in red blood cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Research Grade Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>Provis AX-70</td>
			<td>Microscoped used to mount magnetic levitation device and view levitating cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rubber Dampening Feet</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>RDF1</td>
			<td>Used to support the breadboard table</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Square Boro Tubing</td>
			<td>VitroTubes</td>
			<td>8100-050</td>
			<td>Capillary tube used for loading sample into Maglev</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfo-NHS</td>
			<td>Thermoscientific</td>
			<td>24510</td>
			<td>Used in antibody coupling reaction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Translational Stage</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>PT1</td>
			<td>Used for focusing and for scanning capillary tube</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification of cellular densities and antigenic properties using magnetic levitation

Açıklanan yöntem, hücreleri ve parçacıkları yoğunluklarına ve manyetik özelliklerine göre ayıran manyetik yükselme ilkelerine dayanarak geliştirilmiştir. Yoğunluk, metabolik hızı, farklılaşması ve aktivasyon durumuyla doğrudan ilişkili bir hücre türü tanımlama özelliğidir. Manyetik yükselme, dolaşımdaki kan hücrelerini başarıyla ayırmak, görüntünü ve karakterize etmek ve anemiyi, orak hücre hastalığını ve dolaşımdaki tümör hücrelerini yoğunluk ve manyetik özelliklere göre tespit etmek için tek adımlı bir yaklaşım sağlar. Bu yaklaşım, sırasıyla yakalama ve algılama antikorları ile kaplanmış düşük ve yüksek yoğunluklu boncuk setleri kullanarak bir çözeltide bulunan çözünür antijenleri tespit etmeye de elverişlidir. Antijen çözeltide mevcutsa, iki boncuk kümesini köprüleyecek ve antikor kaplı boncuk sıraları arasında kabaracak yeni bir boncuk boncuk kompleksi üretecektir. Çözeltideki hedef antijenin artan konsantrasyonu, daha düşük antijen konsantrasyonlarına kıyasla daha fazla sayıda boncuk-boncuk kompleksi üretecek ve böylece hedef antijenin nicel ölçümlerine izin verecektir. Manyetik yükselme, azalan numune hazırlama süresi ve klasik okuma yöntemlerine olan bağlı olmaması nedeniyle diğer yöntemlere göre avantajlıdır. Oluşturulan görüntü, akıllı telefon veya tablet gibi standart bir mikroskop veya mobil cihaz kullanılarak kolayca yakalanır ve analiz edilir.

Manyetik yükselme, nesnenin yoğunluğuna, manyetik imzasına, paramanyetik çözeltinin konsantrasyonuna ve iki güçlü, nadir toprak mıknatısının yarattığı manyetik alanın gücüne bağlı olarak farklı yoğunluklardaki nesneleri farklı yükselme yüksekliklerinde odaklar. İki mıknatıs üst üste yerleştirildikçe, yükselen numuneler sadece Köhler aydınlatmasını korurken, yan tarafında bir mikroskop kullanılarak görüntülenebilir (Şekil 1). Her hücre tipinin ula?...

Watch this Scientific Journal Video about Quantification of Cellular Densities and Antigenic Properties using Magnetic Levitation at JoVE.com

Quantification of Cellular Densities and Antigenic Properties using Magnetic Levitation

Bu makalede, sabit yoğunluklu yakalama boncuklarının kaldırma yüksekliğindeki değişiklikleri ölçerek çözünür veya zara bağlı antijenlerin varlığını özellikle tespit edebilen manyetik kaldırma tabanlı bir yöntem açıklanmaktadır.

Manyetik Levitasyon Kullanılarak Hücresel Yoğunlukların ve Antijenik Özelliklerin Nicelleştirilmesi

The described method was developed based on the principles of magnetic levitation, which separates cells and particles based on their density and magnetic ...

Bu teknik, kısa bir süre içinde çok az veya hiç manipülasyon yapılmadan sadece yoğunluğa dayalı olarak çeşitli işlemlerden geçen çeşitli hücre tiplerinin ve hücrelerin ayrılmasına izin verir. Bu yöntemin ana avantajları, minimal invaziv olması, küçük hacimler gerektirmesi, hızlı sonuçlar sağlaması, klasik okumalara bağlı olmaması ve uzman personelin gerekli olmamasıdır. Bu teknik, anemi ve sepsis gibi birden fazla hastalığın tespiti için uygulanabilir.Başlamak için rhesus faktörü pozitif kan donörün parmağını delmek için tek tıklamayla lancing cihazını kullanın ve bir mililitre DPBS'de 10 mikrolitre kan toplayın. Plazma zarını floresan olarak lekelemek ve 15 dakika boyunca 37 santigrat derecede kuluçkaya yatmak için rhesus faktör pozitif hücrelerinin bir mililitre süspansiyonunda bir mikrolitre floresan boya ekleyin. Hücreleri 15 saniye boyunca 5.600 kez G'de döndürerek peletlayın ve bir mililitre DPBS kullanarak pelezi üç kez yıkayın.Peletin bir mililitre HBSS'de kalsiyum ve magnezyum ile yeniden biriktirin. Rhesus faktörü negatif kan donörün parmağını delmek ve iki mikrolitre kan toplamak için tek tıklamayla geğme cihazını kullanın. Sadece boncuk içeren deneysel tüpü hazırlamak için, kalsiyum ve magnezyumlu 174 mikrolitre HBSS, bir mikrolitre IgG kontrol boncukları, mililitre başına 1,2 gram yoğunluğa sahip bir mikrolitre ağır boncuk ve 500 milimoler gadolinyumun 24 mikrolitresini ekleyin.IgG içeren deneysel kontrol tüpünü hazırlamak için, kalsiyum ve magnezyum içeren 172 mikrolitre HBSS, bir mikrolitre IgG kontrol boncukları, bir mikrolitre ağır boncuk, bir mikrolitre rhesus faktörü negatif kan, bir mikrolitre lekeli rhesus faktörü pozitif kan süspansiyonu ve 500 milimolar gadolinyum 24 mikrolitre ekleyin. Örnek deneysel tüpü hazırlamak için, kalsiyum ve magnezyumlu 172 mikrolitre HBSS, bir mikrolitre anti-RhD kaplı boncuk, bir mikrolitre ağır boncuk, bir mikrolitre rhesus faktörü negatif kan, bir mikrolitre lekeli rhesus faktörü pozitif kan süspansiyonu ve 500 milimolar gadolinyum 24 mikrolitre ekleyin. Manyetik kaldırma cihazını kurun.Ve numunenin 50 mikrolitresini tüp dolana kadar kılcal bir tüpe yükleyin. Kılcal borunun uçlarını, kabarcık olmamasını sağlayan bir kılcal dolgu macunu ile kapatın. Kılcal boruyu üst ve alt mıknatıslar arasındaki kılcal kapağa yerleştirin, sahneyi ayarlayın ve optimum görüntüleme için odaklanın.Hücrelerin ve boncukların manyetik denge konumlarına yerleşmeleri için yaklaşık beş ila 20 dakika bekleyin. Bu protokol kullanılarak, kan hücreleri manyetik levitasyon cihazı kullanılarak yükselme yüksekliğine bağlı olarak ayrıldı. Yoğunluk yükselme yükseklikleri ve boyut referansları sağlamak için düşük ve yüksek yoğunluklu boncuklar kullanılmıştır.Polimorfonuklear hücreler kırmızı kan hücrelerinin üzerinde 21 milimolar gadolinyum iyon konsantrasyonuyla dalgalanıyordu. Eski kan hücreleri 60 milimoler gadolinyum iyon konsantrasyonuyla havaya uçuyordu. Kırmızı kan hücreleri, polimorfonukleer hücreler ve lenfositler, iç yoğunluklarına göre 40 milimoler gadolinyum iyon konsantrasyonunda ayrıldı.Kırmızı kan hücrelerinde IgG ve anti-RhD antikor kaplı boncuklar kullanılarak rhesus faktör antijeni saptandı. Boncuk kırmızı hücre kompleksleri IgG kontrol örneğinde üretilmedi, ancak rhesus faktörü pozitif boncuklar tarafından yakalanan floresan lekeli kırmızı kan hücreleri tespit edildi. Anti-RhB'nin rhesus faktör pozitif hücrelere bağlanması, merkezde ilişkisiz boncukların ve negatif kırmızı kan hücrelerinin aralıklı yoğunluğunda bir boncuk hücresi kompleksi oluşturdu.Ayrıca, yayılan floresan gözlemlenerek karmaşık oluşum doğrulandı. CR1 ve CD47 antikorları ile kaplanmış yüksek ve düşük yoğunluklu boncuklar arasında oluşan B boncuk kompleksleri, hücre dışı veziklinlerden elde edilen kırmızı kan hücresinin varlığını gösterir. Kabarcıkları tanıtmadan kılcal damarları kapatmak en zorlu adımdır ve pratik gerektirir.Bu yöntem, özellikle kırmızı kan hücresi hastalıklarına odaklanan hematoloji için içgörü sağlayabilir.

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation of Labile Multi-protein Complexes by in vivo Controlled Cellular Cross-Linking and Immuno-magnetic Affinity Chromatography

Isolation of Labile Multi-protein Complexes by in vivo Controlled Cellular Cross-Linking and Immuno-magnetic Affinity Chromatography

Dayanıksız Multi-protein Kompleksleri izolasyonu In vivo Kontrollü Hücresel Çapraz Bağlama ve immuno-manyetik Afinite Kromatografisi

The dynamic nature of cellular machineries is frequently built on transient and/or weak protein associations. These low affinity interactions preclude ...

Biyoloji

Rapid Homogeneous Detection of Biological Assays Using Magnetic Modulation Biosensing System

Biyolojik Tahliller Manyetik Modülasyon Biyoalgılayıcı Sistemi kullanarak hızlı Homojen Algılama

A magnetic modulation biosensing system (MMB) [1,2] rapidly and homogeneously detected biological targets at low concentrations without any washing or ...

Quantifying Mixing using Magnetic Resonance Imaging

Manyetik Rezonans Görüntüleme kullanarak Karışım miktarının

Mixing is a unit operation that combines two or more components into a homogeneous mixture.  This work involves mixing two viscous liquid streams using an ...

AFM-based Mapping of the Elastic Properties of Cell Walls: at Tissue, Cellular, and Subcellular Resolutions

Hücre Duvarları Elastik Özelliklerinin AFM-tabanlı Haritalama: doku, hücresel ve Subselüler Çözünürlüklerde

We describe a recently developed method to measure mechanical properties of the surfaces of plant tissues using atomic force microscopy (AFM) ...

Selected Reaction Monitoring Mass Spectrometry for Absolute Protein Quantification

Mutlak Protein Niceleme Kütle Spektrometresi İzleme Seçilen Tepki

Absolute quantification of target proteins within complex biological samples is critical to a wide range of research and clinical applications. This ...

Automated Quantification and Analysis of Cell Counting Procedures Using ImageJ Plugins

ImageJ Eklentileri Kullanma Hücre Sayım Usul Otomatik Niceleme ve Analizi

The National Institute of Health&#39;s ImageJ is a powerful, freely available image processing software suite. ImageJ has comprehensive particle analysis ...

Cellular Redox Profiling Using High-content Microscopy

Yüksek İçerikli Mikroskopi Kullanılarak Hücresel Redoks Profillemesi

Reactive oxygen species (ROS) regulate essential cellular processes including gene expression, migration, differentiation and proliferation. However, ...

Visualizing Lymph Node Structure and Cellular Localization using Ex-Vivo Confocal Microscopy

Ex-Vivo Konfokal Mikroskopi ile Lenf Nodal Yapısı nın Ve Hücresel Lokalizasyonun Görselleştirilmesi

Lymph nodes (LNs) are organs spread within the body, where the innate immune responses can connect with the adaptive immunity. In fact, LNs are ...

Cryogenic Sample Loading into a Magic Angle Spinning Nuclear Magnetic Resonance Spectrometer that Preserves Cellular Viability

Hücresel Canlılığı Koruyan Sihirli Açı Dönen Nükleer Manyetik Rezonans Spektrometresine Kriyojenik Örnek Yükleme

Dynamic nuclear polarization (DNP) can dramatically increase the sensitivity of magic angle spinning (MAS) nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy. ...

Quantification of Interbacterial Competition using Single-Cell Fluorescence Imaging

Tek Hücreli Floresan Görüntüleme Kullanılarak Interbakteriyel Rekabetin Nicelemesi

Interbacterial competition can directly impact the structure and function of microbiomes. This work describes a fluorescence microscopy approach that can ...