Name: in vitro three-dimensional sprouting assay of angiogenesis using mouse embryonic stem cells for vascular disease modeling and drug testing
Uploaded: 2021-05-11T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Three-Dimensional Sprouting Assay of Angiogenesis Using Mouse Embryonic Stem Cells for Vascular Disease Modeling and Drug Testing at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af tilskud fra Nederlandse organisatie voor gezondheidsonderzoek en zorginnovatie (ZonMW 446002501), Health Holland (LSHM19057-H040), Leading Fellows Programme Marie Skłodowska-Curie COFUND og af Association Maladie de Rendu-Osler (AMRO).

1. Medieforberedelse og kultur af mESC
<ol><li>Forbered konditioneret medium +/- (CM+/-) ved hjælp af tilskuddet 1x Glasgow MEM (G-MEM BHK-21) medium med 10% (vol/vol) varmeinaktiveret føtalt bovint serum (FBS), 0,05 mM β-mercaptoethanol, 1x ikke-essentielle aminosyrer (NEAA 1x), 2 mM L-glutamin og 1 mM natriumpyruvat.</li>
	<li>Forbered konditioneret medium +/+ (CM+/+) ved hjælp af tilskuddet CM+/- medium med leukæmihæmmende faktor (LIF) (1.500 U / ml) og 0,1 mM β-mercaptoethanol.</li>
	<li>Der fremstilles kond...

<ol>
	<li>Moffat, J. G., Vincent, F., Lee, J. A., Eder, J., Prunotto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Opportunities+and+challenges+in+phenotypic+drug+discovery:+an+industry+perspective.">Opportunities and challenges in phenotypic drug discovery: an industry perspective.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 16 (8), 531-543 (2017).</li><li>Horvath, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+out+irrelevant+cell-based+models+of+disease.">Screening out irrelevant cell-based models of disease.</a> Nature Reviews. Drug Discovery. 15 (11), 751-769 (2016).</li><li>Low, L. A., Mummery, C., Berridge, B. R., Austin, C. P., Tagle, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organs-on-chips:+into+the+next+decade.">Organs-on-chips: into the next decade.</a> Nature Reviews. Drug Discovery. , (2020).</li><li>Ma, C., Peng, Y., Li, H., Chen, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organ-on-a-Chip:+A+new+paradigm+for+drug+development.">Organ-on-a-Chip: A new paradigm for drug development.</a> Trends in Pharmacological Sciences. 42 (2), 119-133 (2021).</li><li>Swinney, D. C., Anthony, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+were+new+medicines+discovered.">How were new medicines discovered.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 10 (7), 507-519 (2011).</li><li>Hussain, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-content+image+generation+for+drug+discovery+using+generative+adversarial+networks.">High-content image generation for drug discovery using generative adversarial networks.</a> Neural Networks: The Official Journal of the INternational Neural Network Society. 132, 353-363 (2020).</li><li>Scheeder, C., Heigwer, F., Boutros, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Machine+learning+and+image-based+profiling+in+drug+discovery.">Machine learning and image-based profiling in drug discovery.</a> Current Opinion in Systems Biology. 10, 43-52 (2018).</li><li>Wagner, B. K., Schreiber, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+power+of+sophisticated+phenotypic+screening+and+modern+mechanism-of-action+methods.">The power of sophisticated phenotypic screening and modern mechanism-of-action methods.</a> Cell Chemical Biology. 23 (1), 3-9 (2016).</li><li>Scannell, J. W., Bosley, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=When+quality+beats+quantity:+Decision+theory,+drug+discovery,+and+the+reproducibility+crisis.">When quality beats quantity: Decision theory, drug discovery, and the reproducibility crisis.</a> PLoS One. 11 (2), 0147215 (2016).</li><li>Webster, J. D., Santagostino, S. F., Foreman, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+and+considerations+for+the+use+of+genetically+engineered+mouse+models+in+drug+development.">Applications and considerations for the use of genetically engineered mouse models in drug development.</a> Cell and Tissue Research. 380 (2), 325-340 (2020).</li><li>Howland, D. S., Munoz-Sanjuan, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mind+the+gap:+models+in+multiple+species+needed+for+therapeutic+development+in+Huntington's+disease.">Mind the gap: models in multiple species needed for therapeutic development in Huntington's disease.</a> Movement Disorders: Official Journal of the Movement Disorder Scoiety. 29 (11), 1397-1403 (2014).</li><li>Galaris, G., Thalgott, J. H., Lebrin, F. P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pericytes+in+hereditary+hemorrhagic+telangiectasia.">Pericytes in hereditary hemorrhagic telangiectasia.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 1147, 215-246 (2019).</li><li>Thalgott, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decreased+expression+of+vascular+endothelial+growth+factor+receptor+1+contributes+to+the+pathogenesis+of+hereditary+hemorrhagic+telangiectasia+type+2.">Decreased expression of vascular endothelial growth factor receptor 1 contributes to the pathogenesis of hereditary hemorrhagic telangiectasia type 2.</a> Circulation. 138 (23), 2698-2712 (2018).</li><li>Lebrin, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thalidomide+stimulates+vessel+maturation+and+reduces+epistaxis+in+individuals+with+hereditary+hemorrhagic+telangiectasia.">Thalidomide stimulates vessel maturation and reduces epistaxis in individuals with hereditary hemorrhagic telangiectasia.</a> Nature Medicine. 16 (4), 420-428 (2010).</li><li>Czechanski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+and+characterization+of+mouse+embryonic+stem+cells+from+permissive+and+nonpermissive+strains.">Derivation and characterization of mouse embryonic stem cells from permissive and nonpermissive strains.</a> Nature Protocols. 9 (3), 559-574 (2014).</li><li>Elling, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+reversible+haploid+mouse+embryonic+stem+cell+biobank+resource+for+functional+genomics.">A reversible haploid mouse embryonic stem cell biobank resource for functional genomics.</a> Nature. 550 (7674), 114-118 (2017).</li><li>Cheng, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+pericytes+for+therapeutic+approaches+to+neurological+disorders.">Targeting pericytes for therapeutic approaches to neurological disorders.</a> Acta Neuropathologica. 136 (4), 507-523 (2018).</li><li>Chade, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+vessels,+big+role:+Renal+microcirculation+and+progression+of+renal+injury.">Small vessels, big role: Renal microcirculation and progression of renal injury.</a> Hypertension. 69 (4), 551-563 (2017).</li><li>Jourde-Chiche, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelium+structure+and+function+in+kidney+health+and+disease.">Endothelium structure and function in kidney health and disease.</a> Nature Reviews. Nephrology. 15 (2), 87-108 (2019).</li><li>van Duinen, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardized+and+scalable+assay+to+study+perfused+3D+angiogenic+sprouting+of+iPSC-derived+endothelial+cells+in+vitro.">Standardized and scalable assay to study perfused 3D angiogenic sprouting of iPSC-derived endothelial cells in vitro.</a> Journal of Visualized Experiment: JoVE. (153), e59678 (2019).</li><li>Chappell, J. C., Taylor, S. M., Ferrara, N., Bautch, V. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+guidance+of+emerging+vessel+sprouts+requires+soluble+Flt-1.">Local guidance of emerging vessel sprouts requires soluble Flt-1.</a> Developmental Cell. 17 (3), 377-386 (2009).</li><li>Sato, Y., Rifkin, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+endothelial+cell+movement+by+pericytes+and+smooth+muscle+cells:+activation+of+a+latent+transforming+growth+factor-beta+1-like+molecule+by+plasmin+during+co-culture.">Inhibition of endothelial cell movement by pericytes and smooth muscle cells: activation of a latent transforming growth factor-beta 1-like molecule by plasmin during co-culture.</a> Journal of Cell Biology. 109 (1), 309-315 (1989).</li><li>Tchaikovski, V., Olieslagers, S., Bohmer, F. D., Waltenberger, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diabetes+mellitus+activates+signal+transduction+pathways+resulting+in+vascular+endothelial+growth+factor+resistance+of+human+monocytes.">Diabetes mellitus activates signal transduction pathways resulting in vascular endothelial growth factor resistance of human monocytes.</a> Circulation. 120 (2), 150-159 (2009).</li><li>Staton, C. A., Reed, M. W., Brown, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+critical+analysis+of+current+in+vitro+and+in+vivo+angiogenesis+assays.">A critical analysis of current in vitro and in vivo angiogenesis assays.</a> International Journal of Experimental Pathology. 90 (3), 195-221 (2009).</li><li>Herbert, S. P., Stainier, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+control+of+endothelial+cell+behaviour+during+blood+vessel+morphogenesis.">Molecular control of endothelial cell behaviour during blood vessel morphogenesis.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 12 (9), 551-564 (2011).</li><li>Nakatsu, M. N., Hughes, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimized+three-dimensional+in+vitro+model+for+the+analysis+of+angiogenesis.">An optimized three-dimensional in vitro model for the analysis of angiogenesis.</a> Methods in Enzymology. 443, 65-82 (2008).</li><li>Nakatsu, M. N., Davis, J., Hughes, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+fibrin+gel+bead+assay+for+the+study+of+angiogenesis.">Optimized fibrin gel bead assay for the study of angiogenesis.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (186), (2007).</li><li>Gau, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacological+intervention+of+MKL/SRF+signaling+by+CCG-1423+impedes+endothelial+cell+migration+and+angiogenesis.">Pharmacological intervention of MKL/SRF signaling by CCG-1423 impedes endothelial cell migration and angiogenesis.</a> Angiogenesis. 20 (4), 663-672 (2017).</li><li>Torres-Estay, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Androgens+modulate+male-derived+endothelial+cell+homeostasis+using+androgen+receptor-dependent+and+receptor-independent+mechanisms.">Androgens modulate male-derived endothelial cell homeostasis using androgen receptor-dependent and receptor-independent mechanisms.</a> Angiogenesis. 20 (1), 25-38 (2017).</li><li>Merjaneh, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pro-angiogenic+capacities+of+microvesicles+produced+by+skin+wound+myofibroblasts.">Pro-angiogenic capacities of microvesicles produced by skin wound myofibroblasts.</a> Angiogenesis. 20 (3), 385-398 (2017).</li><li>Rezzola, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+and+ex+vivo+retina+angiogenesis+assays.">In vitro and ex vivo retina angiogenesis assays.</a> Angiogenesis. 17 (3), 429-442 (2014).</li><li>Wang, X., Phan, D. T. T., George, S. C., Hughes, C. C. W., Lee, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+Anastomosed+microvascular+network+model+with+living+capillary+networks+and+endothelial+cell-lined+microfluidic+channels.">3D Anastomosed microvascular network model with living capillary networks and endothelial cell-lined microfluidic channels.</a> Methods in Molecular Biology. 1612, 325-344 (2017).</li><li>Nicosia, R. F., Ottinetti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+of+microvessels+in+serum-free+matrix+culture+of+rat+aorta.+A+quantitative+assay+of+angiogenesis+in+vitro.">Growth of microvessels in serum-free matrix culture of rat aorta. A quantitative assay of angiogenesis in vitro.</a> Laboratory Investigation; A Journal of Technical Methods and Pathology. 63 (1), 115-122 (1990).</li><li>Nicosia, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+aortic+ring+model+of+angiogenesis:+a+quarter+century+of+search+and+discovery.">The aortic ring model of angiogenesis: a quarter century of search and discovery.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 13 (10), 4113-4136 (2009).</li><li>Nowak-Sliwinska, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Consensus+guidelines+for+the+use+and+interpretation+of+angiogenesis+assays.">Consensus guidelines for the use and interpretation of angiogenesis assays.</a> Angiogenesis. 21 (3), 425 (2018).</li><li>Belair, D. G., Schwartz, M. P., Knudsen, T., Murphy, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+iPSC-derived+endothelial+cell+sprouting+assay+in+synthetic+hydrogel+arrays.">Human iPSC-derived endothelial cell sprouting assay in synthetic hydrogel arrays.</a> Acta Biomaterialia. 39, 12-24 (2016).</li><li>Bezenah, J. R., Kong, Y. P., Putnam, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluating+the+potential+of+endothelial+cells+derived+from+human+induced+pluripotent+stem+cells+to+form+microvascular+networks+in+3D+cultures.">Evaluating the potential of endothelial cells derived from human induced pluripotent stem cells to form microvascular networks in 3D cultures.</a> Scientific Reports. 8 (1), 2671 (2018).</li><li>Henderson, A. R., Choi, H., Lee, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood+and+lymphatic+vasculatures+on-chip+platforms+and+their+applications+for+organ-specific+in+vitro+modeling.">Blood and lymphatic vasculatures on-chip platforms and their applications for organ-specific in vitro modeling.</a> Micromachines (Basel). 11 (2), 147 (2020).</li><li>Lin, D. S. Y., Guo, F., Zhang, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+organ-specific+vasculature+with+organ-on-a-chip+devices.">Modeling organ-specific vasculature with organ-on-a-chip devices.</a> Nanotechnology. 30 (2), 024002 (2019).</li><li>Pollet, A., den Toonder, J. M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recapitulating+the+vasculature+using+organ-on-chip+technology.">Recapitulating the vasculature using organ-on-chip technology.</a> Bioengineering. 7 (1), 17 (2020).</li><li>Cochrane, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+in+vitro+models+of+vascular+biology:+Human+induced+pluripotent+stem+cells+and+organ-on-chip+technology.">Advanced in vitro models of vascular biology: Human induced pluripotent stem cells and organ-on-chip technology.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 140, 68-77 (2019).</li></ol>

Denne protokol beskriver et upartisk, robust og reproducerbart 3D EB-baseret vaskulært spiringsassay, der kan screenes for lægemidler og gener, der modulerer angiogenese. Denne metode giver fordele i forhold til mange udbredte todimensionelle (2D) assays ved anvendelse af endotelcellekulturer såsom humane navlestrengendotelceller (HUVEC'er) til overvågning af migration (lateral ridseanalyse eller Boyden-kammerassayet)22,23 eller proliferation (tælling af celleantal, påvisning af DNA-syntese, påvisning a...

I de sidste tre årtier har målbaseret lægemiddelopdagelse (TDD) været bredt anvendt i lægemiddelopdagelse af medicinalindustrien. TDD inkorporerer et defineret molekylært mål, der spiller en vigtig rolle i en sygdom og er afhængig af udviklingen af relativt enkle cellekultursystemer og aflæsninger til lægemiddelscreening1. De fleste typiske sygdomsmodeller, der anvendes i TDD-programmer, omfatter traditionelle cellekulturmetoder såsom kræftceller eller udødeliggjorte cellelinjer dyrket i kunstige miljøer og ikke-fysiologiske substrater. Selv om mange af disse modeller har givet levedygtige værktøjer til at identificere vellykkede lægemiddelkandidater, kan brugen af sådanne systemer være tvivlsom på grund af deres ringe sygdomsrelevans2.
For de fleste sygdomme er de underliggende mekanismer faktisk komplekse, og forskellige celletyper, uafhængige signalveje og flere sæt gener viser sig ofte at bidrage til en bestemt sygdomsfænotype. Dette gælder også for arvelige sygdomme, hvor den primære årsag er en mutation i et enkelt gen. Med den nylige fremkomst af humant inducerede pluripotente stamcelleteknologier (iPSC) og genredigeringsværktøjer er det nu muligt at generere 3D-organoider og organ-on-chip-sygdomsmodeller, der bedre kan rekapitulere in vivo-menneskelig kompleksitet 3,4. Udviklingen af sådanne teknologier er forbundet med en genopblussen i interessen for fænotypiske lægemiddelopdagelsesprogrammer (PDD)1. PDD kan sammenlignes med empirisk screening, da de ikke er afhængige af viden om identiteten af et specifikt lægemiddelmål eller en hypotese om dets rolle i sygdom. PDD-tilgangen anerkendes nu i stigende grad for at bidrage stærkt til opdagelsen af førsteklasses lægemidler5. Da udviklingen af humane organoid- og organ-on-chip-teknologier stadig er i sin vorden, forventes det, at iPSC-modeller (suppleret med innovative billeddannelses- og maskinlæringsværktøjer 6,7) i den nærmeste fremtid vil tilvejebringe flere nye komplekse cellebaserede sygdomsmodeller til lægemiddelscreening og tilhørende PDD-programmer for at overvinde TDD-metodens ringe produktivitet8 — 9.
Mens humane organoid- og organ-on-chip-modeller kan give vigtig indsigt i sygdomskompleksitet og identifikation af nye lægemidler, er det også stærkt afhængigt af data fra dyremodeller at bringe lægemidler ind i ny klinisk praksis for at vurdere deres effektivitet og sikkerhed. Blandt dem er genetisk modificerede mus bestemt de mest foretrukne pattedyrmodeller. De har mange fordele, da de har en relativt kort generationstid for pattedyr, har mange lignende fænotyper som menneskelige sygdomme og let kan genmanipuleres. De anvendes derfor i vid udstrækning i narkotikaforskningsprogrammer10. Det er dog fortsat en vigtig udfordring at bygge bro over kløften mellem mus og mennesker11. Udviklingen af in vitro-musemodeller svarende til humane organoid- og organ-on-chip-modeller vil i det mindste delvis kunne udfylde dette hul, da det vil muliggøre direkte lægemiddeleffektivitets- og sikkerhedssammenligninger mellem in vivo-data fra mus og in vitro-data fra mennesker. 
Her beskrives et vaskulært spiringsassay i museembryoidlegemer (EB'er). Blodkar består af endotelceller (indre foring af karvægge), vægmalerier (vaskulære glatte muskelceller og pericytter)12. Denne protokol er baseret på differentieringen af embryonale stamceller fra mus (mESC'er) i vaskulariserede EB'er ved hjælp af hængende dråber, der rekapitulerer de novo-endotelcelle- og vægmalericelledifferentiering13,14. Muse-ESC'er kan let etableres i kultur fra isolerede dag 3.5 museblastocyster med forskellig genetisk baggrund15. De giver også muligheder for klonanalyse, afstamningssporing og kan let genetisk manipuleres til at generere sygdomsmodeller13,16.
Da blodkar nærer alle organer, er det ikke overraskende, at mange sygdomme, hvis ikke alle, er forbundet med ændringer i mikrovaskulaturen. Under patologiske tilstande kan endotelceller vedtage en aktiveret tilstand eller kan blive dysfunktionelle, hvilket resulterer i vægmaleridød eller migration væk fra blodkar. Disse kan resultere i overdreven angiogenese eller i karsjældenhed, kan fremkalde unormal blodgennemstrømning og defekt blodkarbarriere, der fører til ekstravasation af immunceller og betændelse12,17,18,19. Forskning til udvikling af lægemidler, der modulerer blodkar, er derfor høj, og flere molekylære aktører og koncepter er allerede blevet identificeret til terapeutisk målretning. I denne sammenhæng er den beskrevne protokol særligt velegnet til opbygning af sygdomsmodeller og til lægemiddeltestning, da den rekapitulerer nøglefunktioner i in vivo-spirende angiogenese, herunder valg af endotelspids og stilkcelle, endotelcellemigration og -proliferation, endotelcellevejledning, rørdannelse og rekruttering af vægmalericeller. Det viser også ligheder med nyligt beskrevne 3D vaskulære assays baseret på humane iPSC-teknologier20.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-mercaptoethanol</td>
			<td>Milipore, Merck</td>
			<td>805740</td>
			<td>Biohazard: adequate safety instructions should be taken when handling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar Noble</td>
			<td>Difco, BD Pharmigen</td>
			<td>214220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluo 555 goat anti rat IgG</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>A21434</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC conjugated rat anti-mouse PECAM-1 antibody (clone MEC13.3)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>551262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC Rat IgG2a &#954; Isotype Control (Clone&#160; R35-95)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553932</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axiovert 25 inverted phase contrast tissue culture microscope</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Basic Fibroblast Growth Factor-2 (bFGF)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>450-33</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop Centrifuge, Allegra X-15R</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>392932</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biosafety cabinet BioVanguard (Green Line)</td>
			<td>Telstar</td>
			<td>133H401001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell counting chamber, Buerker, 0.100mm</td>
			<td>Marienfeld</td>
			<td>640211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture dishes 60 x 15mm</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353802</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture dishes, 35 x 10 mm</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture plates 12-well</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>1855196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C5405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR-99021 (CT99021) HCl</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S2924</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen I, High Concentration, Rat Tail, 100mg</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354249</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase A</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10103586001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Laser Scanning Microscope, TCS SP5</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover glasses, 24 &#215; 50 mm</td>
			<td>Vwr</td>
			<td>631-0146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPT &#947;&#8209;secretase inhibitor</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D5942</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DC101 anti mouse VEGFR-2 Clone</td>
			<td>BioXcell</td>
			<td>BP0060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DC101 isotype rat IgG1</td>
			<td>BioXcell</td>
			<td>BP0290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2438-5X</td>
			<td>Biohazard: adequate safety instructions should be taken when handling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS (10x), no calcium, no magnesium</td>
			<td>Gibco, Thermofisher scientific</td>
			<td>14200067</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA 40 mM</td>
			<td>Gibco, Thermofisher scientific</td>
			<td>15575-038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embryonic stem-cell Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco, Thermofisher scientific</td>
			<td>16141-079</td>
			<td>Should be lot-tested for maximum ES cell viability and growth. Heat inactivate at 60&#176;C and store at &#8722;20 &#176;C for up to 1 year</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Microcentrifuge 5415R</td>
			<td>Eppendorf AG</td>
			<td>&#160;Z605212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Erythropoietin, human (hEPO), 250 U (2.5 &#181;g) (1 mL)</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11120166001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ESGRO Recombinant Mouse LIF Protein (10&#8311; units&#160;&#160;1 mL)</td>
			<td>Milipore, Merck</td>
			<td>ESG1107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tubes 15 mL</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>188271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tubes 50 mL</td>
			<td>Greiner Bio-0ne</td>
			<td>227270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter tip ,clear ,sterile F.Gilson, P-200</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>739288</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter tip ,clear ,sterile F.Gilson, P10</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>771288</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter tip ,clear ,sterile F.Gilson, P1000</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>740288</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC conjugated anti-&#945; Smooth Muscle Actin (SMA) (clone 1A4)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F3777</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC conjugated rat anti-mouse CD45 (clone 30-F11)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>103107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC Rat IgG2b, &#954; Isotype Ctrl Antibody (clone RTK4530)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>400605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorscent mounting media</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>S3023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gascompress</td>
			<td>Cutisoft</td>
			<td>45846</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gauze Cutisoft 10 x 10 cm</td>
			<td>Bsn Medical</td>
			<td>45844_00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel blotting paper, Grade GB003</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>WHA10547922</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin solution, type B</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G1393-100 ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glasgow&#39;s MEM (GMEM)</td>
			<td>Gibco, Thermofisher scientific</td>
			<td>21710082</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IHC Zinc Fixative</td>
			<td>BD Pharmigen</td>
			<td>550523</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IncuSafe CO2 Incubator</td>
			<td>PHCBi</td>
			<td>MCO-170AICUV-PE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Interleukin-6, human (hIL-6)</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11138600001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine 200 mM</td>
			<td>Gibco, Thermofisher scientific</td>
			<td>25030-024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x)</td>
			<td>Gibco, Thermofisher scientific</td>
			<td>11140035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slide box</td>
			<td>Kartell Labware</td>
			<td>278</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slide, Starfrost</td>
			<td>Knittel glass</td>
			<td>VS113711FKB.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mm_Cdh5_1_SG QuantiTect Primer Assay</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>QT00110467</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mm_Eng_1_SG QuantiTect Primer Assay</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>QT00148981</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mm_Epha4_1_SG QuantiTect Primer Assay</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>QT00093576</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mm_Ephb2_1_SG QuantiTect Primer Assay</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>QT00154014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mm_Flt1_1_SG QuantiTect Primer Assay</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>QT00096292</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mm_Flt4_1_SG QuantiTect Primer Assay</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>QT00099064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mm_Gapdh_3_SG QuantiTect Primer Assay</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>QT01658692</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mm_Kdr_1_SG QuantiTect Primer Assay</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>QT00097020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mm_Notch1_1_SG QuantiTect Primer</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>QT00156982</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mm_Nr2f2_1_SG QuantiTect Primer Assay</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>QT00153104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mm_Pecam1_1_SG QuantiTect Primer</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>QT01052044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mm_Tek_1_SG QuantiTect Primer Assay</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>QT00114576</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse (ICR) Inactivated Embryonic Fibroblasts&#160; (2 M)</td>
			<td>Gibco, Thermofisher scientific</td>
			<td>A24903</td>
			<td>Store vials in liquid nitrogen (195.79 &#176;C) indefinitely</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse embryonic stem cell line 7AC5/EYFP (ATCC SCRC-1033)</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>SCRC-1033</td>
			<td>Generated by Dr A Nagy, Samuel Lunenfeld Research Institute, Mount Sinai Hospital, 600 University Ave, Toronto, Ontario, M5G 1X5, Canada. [Hadjantonakis, A. K., et al. Mechanisms of Development. 76 (1&#8211;2), 79&#8211;90 (1998)].</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse embryonic stem cell lines Acvrl1 +/- and Acvrl1 +/+</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Generated at Leiden University Medical Centre [Thalgott, J.H. et al. Circulation. 138 (23), 2698&#8211;2712 (2018)].</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse embryonic stem cells line E14</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Provided by M Letarte laboratory and generated according to Cho, S. K., et al. Blood. 98 (13), 3635&#8211;3642 (2001).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse embryonic stem cells line R1 (ATCC SCRC-1011)</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>SCRC-1011</td>
			<td>Generated by Dr A Nagy, Samuel Lunenfeld Research Institute, Mount Sinai Hospital, 600 University Ave, Toronto, Ontario, M5G 1X5, Canada. [Nagy, A., et al. Procedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (18), 8424&#8211;8428 (1993)].</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse embryonic stem cells line Z/Red (strain 129/Ola)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Generated by Dr A Nagy, Samuel Lunenfeld Research Institute, Mount Sinai Hospital, 600 University Ave, Toronto, Ontario, M5G 1X5, Canada [Vintersten, K., et al. Genesis. 40 (4), 241&#8211;246 (2004)].</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop 1000 UV/VIS Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>ND-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PD0325901</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S1036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDGF-BB, Recombinant Human</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-14B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pecam-1 antibody, Rat Anti-Mouse</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>550274</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td>Gibco, Thermofisher scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish, PS, 94/16 mm, standard ,with vents, sterile</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>633181</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetboy acu 2</td>
			<td>Integra-Biosciences</td>
			<td>155 019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetman G Multichannel P8 x 200G</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F144072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetman G Starter Kit, 4 Pipette Kit, P2G, P20G, P200G, P1000G</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F167360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human BMP-4 Protein</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>314-BP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Plus mini Kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>74134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipettes, 10 mL</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>607 180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipettes, 25 mL</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>760 180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipettes, 5 mL</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>606 180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide (NaOH)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>106498</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate 100 mM</td>
			<td>Gibco, Thermofisher scientific</td>
			<td>11360039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Test tubes 5ml round-bottom with cell-strainer cap</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermal cycler, T100</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>1861096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100 (BioXtra)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T9284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution, 0.4%</td>
			<td>Gibco, Thermofisher scientific</td>
			<td>15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin (2.5%)</td>
			<td>Gibco, Thermofisher scientific</td>
			<td>15090046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum Filter/Storage Bottle System, 500 mL</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VEGFA165 , recombinant murine</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>450-32</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water, Sterile</td>
			<td>Fresenius-Kabi</td>
			<td>B230531</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waterbath, Lab-Line Digital</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>18052A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro three-dimensional sprouting assay of angiogenesis using mouse embryonic stem cells for vascular disease modeling and drug testing

Nylige fremskridt inden for inducerede pluripotente stamceller (iPSC) og genredigeringsteknologier muliggør udvikling af nye humane cellebaserede sygdomsmodeller til fænotypiske lægemiddelopdagelsesprogrammer (PDD). Selv om dette nye udstyr kunne forudsige forsøgslægemidlers sikkerhed og virkning hos mennesker mere præcist, er deres udvikling til klinikken stadig stærkt afhængig af pattedyrsdata, navnlig brugen af modeller for sygdomme hos mus. Parallelt med humane organoid- eller organ-on-chip-sygdomsmodeller er udviklingen af relevante in vitro-musemodeller derfor et uopfyldt behov for at evaluere direkte lægemiddeleffektivitets- og sikkerhedssammenligninger mellem arter og in vivo- og in vitro-tilstande. Her beskrives et vaskulært spiringsassay, der udnytter museembryonale stamceller differentieret til embryoidlegemer (EB'er). Vaskulariserede EB'er dyrket på 3D-kollagen gel udvikler nye blodkar, der udvides, en proces kaldet spirende angiogenese. Denne model rekapitulerer nøglefunktioner i in vivo spirende angiogenesedannelse af blodkar fra et allerede eksisterende vaskulært netværk - herunder valg af endotelspidscelle, endotelcellemigration og proliferation, cellevejledning, rørdannelse og rekruttering af vægmalericeller. Det er egnet til screening for lægemidler og gener, modulerende angiogenese og viser ligheder med nyligt beskrevne tredimensionelle (3D) vaskulære assays baseret på humane iPSC-teknologier.

Protokoloversigten over blodkarspiringsanalysen er vist i figur 1. Ni dage gamle EB'er afledt af tre uafhængige 129/Ola mESC-linjer (Z/Red, R1 og E14) blev enzymatisk dissocieret til enkeltceller ved hjælp af collagenase A. Celler blev farvet for PECAM-1 og analyseret ved fluorescensaktiveret cellesortering (FACS) som beskrevet. Alle cellelinjerne udviste robust endoteldifferentiering, og der blev ikke observeret forskelle i deres evne til at differentiere sig til endotelceller. Alle celle...

Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Three-Dimensional Sprouting Assay of Angiogenesis Using Mouse Embryonic Stem Cells for Vascular Disease Modeling and Drug Testing at JoVE.com

In Vitro Three-Dimensional Sprouting Assay of Angiogenesis Using Mouse Embryonic Stem Cells for Vascular Disease Modeling and Drug Testing

Dette assay anvender embryonale stamceller fra mus, der er differentieret i embryoide kroppe dyrket i 3D-kollagengel, til at analysere de biologiske processer, der styrer spirende angiogenese in vitro. Teknikken kan anvendes til test af lægemidler, modellering af sygdomme og til at studere specifikke gener i forbindelse med deletioner, der er embryonalt dødelige.

In vitro Tredimensionel spireanalyse af angiogenese ved hjælp af museembryonale stamceller til vaskulær sygdomsmodellering og lægemiddeltest

Recent advances in induced pluripotent stem cells (iPSC) and gene editing technologies enable the development of novel human cell-based disease models for ...

Denne protokol beskriver et in vitro spirende angiogeneseassay, der rekapitulerer mange træk ved dannelsen af blodkar og kan bruges til test af lægemidler. Denne metode er nem at implementere i et laboratorium, robust og skalerbar. Det har mange ligheder med assays ved hjælp af humane endotelceller og mikrosfærer.Denne model efterligner robust fænotypen, der viser defekt endotelspidscellevalg og orienteret endotelcellemigration, der fører til patologisk angiogenese. Arbejdet kan give indsigt i de mekanismer, der regulerer spirende angiogenese, de vigtigste gener og de involverede signalveje, især ved at udføre genetisk screening Den største udfordring er at opretholde kvaliteten eller pluripotensen af museembryonale stamceller i kultur. Det er vigtigt regelmæssigt at kontrollere pluripotensstadierne og morfologien af cellelinjerne.Det er også vigtigt at udføre en karyotyping af cellelinjerne, da de har tendens til at dyrke for at miste eller få kromosomer. Begynd med at belægge en brønd af de seks brøndcellekulturplader med 500 mikroliter 0,1% gelatineopløsning og læg den i en kuldioxidinkubator i 30 minutter. Vask derefter de gelatinebelagte plader med PBS og tilsæt 500 mikroliter frisklavet CM plus minus medium.For at opnå en ren population af embryonale stamceller fra mus eller mESC'er trypsiniseres cellekulturpladen med 10x TVP-buffer i 30 sekunder ved stuetemperatur. Derefter resuspenderes cellerne i en milliliter mesodermdifferentieringsmedium, inden de overføres til den gelatinebelagte seks brøndplade i 30 minutter for at tillade musens embryonale fibroblaster at vedhæfte, mens mESC'erne forbliver i suspension. Overfør cellesuspensionen til et 15 ml rør, før du tæller levende celler ved hjælp af et Neubauer-hæmoocytometer i Trypan-blåt farvestof.Derefter centrifugeres cellerne ved 200 gange G i fem minutter ved stuetemperatur. Supernatanten fjernes og cellepellettet resuspenderes i et passende volumen mesodermdifferentieringsmedium. Forbered fire 94 millimeter polystyrenskåle med lav fastgørelse ved at tilsætte 15 ml sterilt vand til bunden.Efter overførsel af cellesuspensionen til et sterilt plastreservoir indlæses fire positioner af en flerkanalpipette med 22 mikroliter cellesuspension pr. Kanal. Løft og placer det omvendte låg på 94 millimeter skålen på flowskabets rene overflade med indersiden opad. Afsæt 40 dråber af cellesuspensionen på indersiden af hvert låg, og vend forsigtigt låget på hovedet uden forstyrrelse for at placere det tilbage på fadet, så dråberne vender mod vandet.Inkuber opvasken i en kuldioxidinkubator i fire dage, idet dette betragtes som differentieringsdag nul. Efter fire dages inkubation samles de hængende dråber i et 15 ml konisk rør ved hjælp af en P1000-pipette. Lad EB bundfælde sig i glasset, inden supernatanten fjernes.EB'erne resuspenderes i tre ml 2x vaskulært differentieringsmedium, før EB-suspension overføres og fordeles ensartet i en 60 millimeter agarbelagt skål. Inkuber opvasken i en kuldioxidinkubator indtil dag ni med en medium opdatering hver anden dag. Forbered en 35 millimeter kulturskål ved at tilsætte en milliliter spiremediet til bunden.For at fremkalde gelering inkuberes skålen ved 37 grader Celsius i fem minutter. Ni dage gamle EB'er samles fra en agarskål i et konisk rør på 15 ml, og supernatanten fjernes. Resuspender EB'erne i to ml koldspirende medium for at overføre dem til kulturskålen belagt med det første lag spiremedium.Fordel EB'erne over hele pladen, og sørg for, at de er i lige stor afstand fra hinanden. Den første spiredannelse bør være tydelig efter inkubation i ca. 24 til 48 timer. På dag 12 skal du bruge en spatel til forsigtigt at overføre kollagengelen, der indeholder EB'er, til et glasglas.Fjern overskydende væske med en pipette og dehydrer gelen ved at placere et gasbind af nylonlinned og absorberende filterkort oven på gelen. Påfør tryk med en vægt på 250 gram i to minutter. Fjern derefter nylonpapirerne for at lade gliderne lufttørre i 30 minutter ved stuetemperatur.Efter tørring fastgøres EB'erne ved hjælp af zinkopløsning natten over ved fire grader Celsius. Den næste dag skal du fjerne fikseringsmidlet, før du vasker diasene fem gange med PBS. Permeabilize EB'erne og PBS indeholdende 0,1%Triton X-100.Efter 15 minutter fjernes permeabiliseringsopløsningen for at vaske diasene fem gange med PBS i fem minutter. EB'erne inkuberes i blokeringsbufferen i en time ved stuetemperatur og vaskes med PBS i fem minutter. Derefter tilsættes det primære antistof fortyndet i blokeringsbufferen og inkuberes ved fire grader Celsius natten over.Inkuber derefter diasene med Goat anti-Rat Alexa 555 sekundært antistof i en blokerende buffer i to timer ved stuetemperatur. Efter inkubation vaskes diasene tre gange med PBS i fem minutter og en gang med vand, før de monteres til mikroskopi. 3D-spirende angiogeneseanalyse blev udført på tre EB'er med to lægemidler, DC101 og DAPT.Begge forbindelser blokerede gradvist angiogenesen i EB-modellen med stigende koncentrationer. De forskellige koncentrationer af lægemidler i EB'er viste, at høje doser DC101 hæmmer antallet og længden af beholderspirerne. DAPT havde modsatte virkninger ved en dosis på en mikromol pr. Liter.DAPT øgede kraftigt antallet af endotelspidsceller pr. karspirer, der havde en vildledt fænotype, selv ved lave doser, sammenlignet med DC101. Defekt karspiring blev observeret i arvelige hæmoragiske telangiectasia EB'er fra ACVRL1-kontrol og ACVRL1-heterozygote genotyper med adskillige fejlledende fænotyper, der spirede i tilfældige vinkler i forhold til moderkarrene. Blandinger af en vildtype mESC-linje i et en-til-en-forhold med en umærket mESC-vildtypelinje førte til et lige stort bidrag til de førende endotelspidsceller.Mikroskopisk analyse af denne repræsentative kimære EB blev udført for at identificere den genotypiske oprindelse af de førende endotelspidsceller. For at kvantificere vægmaleriets celledækning af karspiren blev EB'er fastgjort og farvet til endotelcellemarkører, PECAM og vægmalericellemarkør, alfa-glat muskelaktin. Et billede med høj forstørrelse afslørede, at en enkelt karspire var omgivet af vægmalerier.Den binære transformation blev udført efter farvekanalseparation, og forholdet mellem PECAM-positive kar dækket af alfa SMA-positive vægmalericeller blev kvantificeret. Den genetiske baggrund for den embryonale stamcellelinje er også en nøglefaktor, som forskerne skal overveje, da nogle linjer spirer bedre end andre. Denne metode kan bruges til at udføre genetisk screening ved hjælp af RNAi-tilgange eller en bank af museembryonale stamceller, der huser genmutationer.

Research

JoVE Journal

Biology

In Vitro Three-Dimensional Sprouting Assay of Angiogenesis Using Mouse Embryonic Stem Cells for Vascular Disease Modeling and Drug Testing

In vitro Differentiation of Mouse Embryonic Stem (mES) Cells Using the Hanging Drop Method

In vitro Differentiation of Mouse Embryonic Stem mES Cells Using the Hanging Drop Method

Stem cells have the remarkable potential to develop into many different cell types. When a stem cell divides, each new cell has the potential to either ...

In vitro Labeling of Human Embryonic Stem Cells for Magnetic Resonance Imaging

Human embryonic stem cells (hESC) have demonstrated the ability to restore the injured myocardium. Magnetic resonance imaging (MRI) has emerged as one of ...

Isolation and Derivation of Mouse Embryonic Germinal Cells

The ability of embryonic germinal cells (EG) to differentiate into primordial germinal cells (PGCs) and later into gametes during early developmental ...

Efficient Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells into Motor Neurons

Effektiv differentiering af stamceller fra mus i Motoriske neuroner

Direct differentiation of embryonic stem (ES) cells into functional  motor neurons represents a promising resource to study disease mechanisms, to  screen ...

Preparation of Mouse Embryonic Fibroblast Cells Suitable for Culturing Human Embryonic and Induced Pluripotent Stem Cells

Udarbejdelse af muse embryonale fibroblastceller anvendes til dyrkning af menneskelige embryoner og induceret pluripotente stamceller

In general, human embryonic stem cells (hESCs) and human induced pluripotent stem cells (hiPSCs)1 can be cultured under variable conditions. However, it ...

Endothelial Cell Tube Formation Assay for the In Vitro Study of Angiogenesis

Endothelial Cell Tube Formation Assay for the In Vitro Study of Angiogenesis

Endotelcelle Tube Opstilling assay for<em&gt; In Vitro</em&gt; Undersøgelse af angiogenese

Angiogenesis is a vital process for normal tissue development and wound healing, but is also associated with a variety of pathological conditions. Using ...

Profiling Individual Human Embryonic Stem Cells by Quantitative RT-PCR

Profilering Individuelle humane embryonale stamceller ved kvantitativ RT-PCR

Heterogeneity of stem cell population hampers detailed understanding of stem cell biology, such as their differentiation propensity toward different ...

Zinc-finger Nuclease Enhanced Gene Targeting in Human Embryonic Stem Cells

Zink-finger Nuclease Forbedret genmålretning i humane embryonale stamceller

One major limitation with current human embryonic stem cell (ESC) differentiation protocols is the generation of heterogeneous cell ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

Isolering og primær kultur af muse aortaendotelceller

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

Three-dimensional Reconstruction of the Vascular Architecture of the Passive CLARITY-cleared Mouse Ovary

Tre-dimensionelle genopbygning af den vaskulære arkitektur i passiv klarhed-ryddet mus æggestokkene

The ovary is the main organ of the female reproductive system and is essential for the production of female gametes and for controlling the endocrine ...