Perlebelastning er en billig analyse til lastning af membran, uigennemtrængelige partikler i levende klæbende celler. Denne protokol har vist sig yderst nyttig til lastning sonder til enkelt celle eller et enkelt molekyle eller fluorescens mikroskopi eksperimenter. Perlebelastning gør det muligt for forskere hurtigt at indlæse alle slags molekyler, herunder proteiner, DNA, RNA, syntetiske partikler eller en kombination af disse samtidigt i enkelte celler.
Når du først udfører perlebelastning, er det vigtigt at teste tappekraften. Cellelinjer reagerer forskelligt på perlebelastning. Og så antallet og kraften af vandhanerne kan ændres for optimal cellebelastning og samtidig minimere celle pealing.
For at demonstrere proceduren matthew Saxton og jeg vil få følgeskab af vores kolleger, Dr.Amanda Cook og Gabriel Galindo. Begynd med at måle ca. fem milliliter glasperler i et 50 milliliter konisk rør. Tilsæt 25 milliliter af to molar natriumhydroxid til røret og bland forsigtigt i to timer ved hjælp af en shaker eller en rotor.
Drej ned røret af perler kort i en centrifuge, hvis perlerne er i suspension, derefter dekantere natriumhydroxid og samtidig bevare så mange perler som muligt. Vask perlerne grundigt med cellekulturkvalitetsvand, indtil pH'en er neutral og dekanter vandet hver gang. Brug pH-teststrimlen på spildevandet til at bekræfte en neutral pH-pc, og vask derefter perlerne grundigt med 100% ethanol, to til tre gange.
Dekantere ethanol hver gang. Tør perlerne og drys dem for at danne et tyndt lag inde i en steril beholder. Lad derefter beholderen stå åben inde i et biosikkerhedsskab for at lufttørre perlerne natten over.
Tryk eller ryst forsigtigt beholderen og kontroller, at perlerne har en Sandy tekstur uden klumpning eller afskalning for at sikre, at perlerne er helt tørre. Tilsæt perlerne til apparatet og dække hele åbningen af perlen bedrift kammer ved hjælp af en polypropylen mesh eller tilsvarende materiale med 105 mikrometer åbninger til at tillade perlerne at passere igennem. Fastgør masken mellem de mandlige og kvindelige ender af et metal genanvendeligt billedkammer, og forsegle det derefter tæt med den voksagtige film og UV sterilisere apparatet i 15 minutter.
Perlelæsserapparatet kan nu bruges til at udføre hundredvis af belastningsanalyser. Apparatet opbevares i en tør beholder, der udtørres med silicagel eller andet tørremiddel, og forsegles. Hvis perlerne bliver dump grundigt tør og sterilisere perlelæsseren og erstatte den med friske perler, som påvist tidligere.
Fjern mediet fra cellerne og konspirer forsigtigt alle medier fra omkring kammerets kanter. Derefter vippe kammeret på ca en 45 graders vinkel og fjerne den resterende dråbe af medier i midten mikro godt. Pipette perlen lastning opløsning forsigtigt på glasset mikro godt til stede i midten af kammeret.
Brug perlebelastningsapparatet til forsigtigt at sprede en monolag af glasperler oven på cellerne. Sørg for, at perlerne dækker cellerne helt. Klem kammeret med to fingre, løft det omkring to inches og bringe det ned fast ved hjælp af en kraft omtrent svarende til at droppe fadet fra denne højde forsigtigt tilføje mediet tilbage i kammeret ved pipetter langsomt på plast side af kammeret.
Aspirere eventuelle flydende perler uden at forstyrre cellerne, hele perlen belastning procedure bør udføres relativt hurtigt. Så cellerne tørrer ikke ud, når de er uden medium. Inkuber derefter cellerne 4,5 til to timer i inkubatoren.
Før billeddannelse vaskes cellerne tre gange med mediet for at fjerne perler og overskydende belastningskomponenter i lasteopløsningen. Billede cellerne med det samme, eller når det kræves af eksperimentet ved hjælp af instruktioner i tekstmanuskriptet. Celler, der med succes perle lastet, næsten altid havde Cy3-Pa57 og A488-H3K11ac mærket proteinerne sammen.
Et mikrogram plasmid DNA og kodning GFP og 0,5 mikrogram Cy3 mærket protein blev også indført i cellerne via perle lastning udtrykt og visualiseret. 40% af cellerne var perle fyldt med fab protein og 21% af perlen indlæst celler udtrykke kernen indlæst Plasmid. Perlen indlæst celler udtrykt varierende niveauer af plasmid.
Resultatet af denne Fisher ratio test viste, at selv om proteiner en og to havde lignende intensitet fordelinger, hvert protein havde en betydeligt mindre fordeling end plasmid. Niveauet af perle lastede proteiner havde lidt celle til celle varians og niveauet af to samtidig lastet proteiner var stærkt korreleret med hinanden. Korrekt perlebelastning havde næsten ingen mærkbar effekt på antallet af menneskelige U2OS-celler eller deres morfologi, når de blev afbildet direkte før, direkte efter og 24 timer efter perlebelastning.
Dårlig perlebelastning med overdreven perler og tappekraft forårsagede celletab, dårlig cellemorfologi og klynger af perler tilbage på dækglasset. selv om celler menes at gennemgå mekaniske skader under perle lastning celler voksede og formere sig i korrekt perle lastet kammer. Det blev også observeret, at perle indlæst celler, gennemgå celledeling.
RPE1 og en HeLa celle linjer var perle fyldt med fab for at demonstrere alsidigheden af perlen lastning teknik. U2OS celler var også perle fyldt med en Cy5-RNA 9-mer, og Cy3-DNA 28-mer sammen. Når du forsøger denne protokol sikre at tilføje kun en monolayer af perler til cellerne, da alt for mange perler forårsage celler til at løsne.
Så efter en kort 30 minutters opsving post til perle lastning celler er klar til billeddannelse enten umiddelbart eller timer til dage senere, hvis proceduren kræver yderligere skridt såsom farvning, der kan gøres efter inddrivelse periode så godt.
