비드 로딩은 살아있는 부착 셀에 멤브레인, 불투과성 입자를 적재하기위한 저렴한 분석이다. 이 프로토콜은 단일 세포 또는 단일 분자 또는 형광 현미경 실험에 대한 프로브를 적재하는 데 매우 유용하다는 것이 입증되었습니다. 비드 로딩을 통해 연구자들은 단백질, DNA, RNA, 합성 입자 또는 이들의 조합을 포함한 모든 종류의 분자를 단일 세포로 동시에 적재할 수 있습니다.
비드 로딩을 처음 수행할 때는 태핑 력을 테스트하는 것이 중요합니다. 셀라인은 비드 로딩에 다르게 반응합니다. 따라서 탭의 수와 힘을 최적의 셀 로딩용으로 수정하여 셀 피링을 최소화할 수 있습니다.
절차를 보여주기 위해 매튜 색스턴과 나는 우리의 동료에 의해 결합됩니다, 박사 아만다 쿡과 가브리엘 갈린도. 50 밀리리터 원물 튜브에서 약 5 밀리리터의 유리 구슬을 측정하여 시작합니다. 2개의 어금니 나트륨 수산화나트륨 25밀리리터를 튜브에 넣고 셰이커나 로터를 사용하여 2시간 동안 부드럽게 섞습니다.
구슬이 현탁액에 있는 경우 원심분리기에서 비드 튜브를 잠시 회전한 다음 수산화 나트륨을 가능한 한 많이 유지합니다. pH가 중성될 때까지 세포 배양 등급의 물로 구슬을 철저히 세척하고 매번 물을 데수합니다. 유출물에 pH 테스트 스트립을 사용하여 중립 pH를 확인한 다음 구슬을 100% 에탄올로 2~3회 철저히 세척합니다.
매번 에탄올을 해독합니다. 구슬을 건조하고 살균 용기 내부에 얇은 층을 형성하기 위해 뿌려. 그런 다음 컨테이너를 생물 안전 캐비닛 내부에 열어 밤새 구슬을 공기 건조시합니다.
용기를 부드럽게 누르거나 흔들어 서 구슬이 완전히 건조되었는지 확인하기 위해 응집이나 박리없이 샌디 텍스처가 있는지 확인합니다. 구슬을 장치에 추가하고 105 마이크로미터 개구부를 가진 폴리 프로필렌 메쉬 또는 동등한 재료를 사용하여 비드 홀딩 챔버의 전체 개구부를 덮어 구슬이 통과할 수 있도록 합니다. 금속 재사용 가능한 이미징 챔버의 수컷과 암컷 끝 사이에 메쉬를 고정한 다음 왁시 필름으로 단단히 밀봉하고 15 분 동안 장치를 살균하십시오.
상기 비드 로더 장치는 이제 수백 개의 적재 적재 방법을 수행하는 데 사용될 수 있다. 실리카 젤 또는 기타 건조제 배지에 의해 건조된 건조 용기에 장치를 보관하고 밀봉하십시오. 비드가 덤프가 완전히 건조되고 비드 로더를 살균하고 이전에 설명한 대로 신선한 구슬로 교체하십시오.
세포에서 배지를 제거하고 챔버 가장자리 주위의 모든 배지를 부드럽게 흡인시합니다. 그런 다음 챔버를 약 45도 각도로 기울이고 중앙 마이크로에서 나머지 한 방울의 매체를 제거합니다. 파이프 는 챔버의 중앙에 잘 존재하는 유리 마이크로에 부드럽게 비드 로딩 솔루션을 한다.
비드 로딩 장치를 사용하여 셀 위에 유리 구슬의 단층이 부드럽게 분산됩니다. 구슬이 세포를 완전히 덮는지 확인합니다. 두 손가락으로 챔버를 꼬집어 2 인치 정도 들어 올리고 그 높이에서 접시를 떨어 뜨리는 것과 거의 동등한 힘을 사용하여 단단히 내려 놓고 챔버의 플라스틱 측면에 천천히 파이펫을 하여 중간 을 챔버에 다시 넣습니다.
세포를 방해하지 않고 부동 구슬을 흡인하고, 전체 비드 로딩 절차를 비교적 빠르게 수행해야 합니다. 따라서 세포는 중간 크기가 없을 때 건조하지 않습니다. 그런 다음 인큐베이터에서 세포 4.5 ~2 시간을 배양합니다.
이미징 전에 배지로 세포를 세 번 세척하여 적재 용액에서 구슬 및 과도한 적재 성분을 제거합니다. 텍스트 원고의 지침을 사용하여 실험에서 필요할 때 즉시 또는 필요할 때 셀을 이미지화합니다. 성공적으로 비드로드 된 세포, 거의 항상 Cy3-Pa57 및 A488-H3K11ac 는 함께 단백질을 표시했다.
플라스미드 DNA및 코딩 GFP의 1마이크로그램과 Cy3 표지 단백질의 0.5 마이크로그램은 또한 비드 로딩을 통해 세포로 발현되고 시각화되었다. 세포의 40%는 팹 단백질로 로드된 비드와 비드 로드 셀의 21%가 로드된 플라스미드 코어를 발현하였다. 비드 로드 된 세포는 플라스미드의 다양한 수준을 표현했다.
그 Fisher 비율 시험의 결과는 단백질 1개와 2개가 유사한 강렬 분포가 있더라도, 각 단백질은 플라스미드 보다는 현저하게 더 작은 분포가 있었다는 것을 보여주었습니다. 비드장전 단백질의 수준은 세포 분산에 작은 세포를 가지고 있었고, 동시에 로드 된 두 단백질의 수준은 서로 매우 상관 관계가 있었다. 적절한 비드 로딩은 비드 로딩 후 24시간 전에 직접 이미지화할 때 인간 U2OS 세포 또는 형태의 수에 거의 눈에 띄는 영향을 미치지 않았다.
과도한 구슬과 두드리는 힘으로 비드 로딩이 좋지 않은 경우 세포 손실, 세포 형태 불량 및 덮개 유리에 남아있는 구슬 클러스터가 발생했습니다. 세포가 비드 로딩 세포가 제대로 비드 로드 된 챔버에서 성장하고 확산되는 동안 기계적 손상을 겪는 것으로 생각되더라도. 또한 비드로드 된 세포가 세포 분열을 겪는 것으로 관찰되었습니다.
RPE1 및 HeLa 세포주는 비드 로딩 기술의 다재다능함을 입증하기 위해 팹으로 로드된 비드였다. U2OS 세포는 또한 Cy5-RNA 9-mer, 및 Cy3-DNA 28-mer를 함께 로드한 비드를 했다. 이 프로토콜을 시도할 때 너무 많은 구슬이 세포를 분리하기 때문에 구슬의 단층만 세포에 추가해야 합니다.
따라서 비드 로딩 셀에 대한 짧은 30 분 복구 게시물 후 즉시 또는 며칠 후 이미징을 위한 준비가 되어 있으며, 시술시 염색과 같은 추가 단계가 필요한 경우 회복 기간 이후에도 수행 할 수 있습니다.
