Name: utilizing in vivo postnatal electroporation to study cerebellar granule neuron morphology and synapse development
Uploaded: 2021-06-09T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Utilizing In Vivo Postnatal Electroporation to Study Cerebellar Granule Neuron Morphology and Synapse Development at JoVE.com

Arbeidet ble støttet av NIH-tilskudd R01NS098804 (AEW), F31NS113394 (UC) og Duke Universitys Summer Neuroscience Program (DG).

MERK: Alle prosedyrer ble utført under protokoller godkjent av Duke University Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC).
1. DNA-forberedelse for in vivo elektroporering eller IVE (1 dag før operasjonen)
<ol><li>Samle følgende materialer: renset DNA (0,5-25 μg per dyr), 3 M natriumacetat, etanol, Fast Green fargestoff, ultrarent destillert vann, fosfatbufferløsning (PBS) (se materialtabellen). MERK: For DNA ble en konstruksjon som uttrykker grønt fluoresce...

<ol>
	<li>Altman, J., Bayer, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Development of the cerebellar system : in relation to its evolution, structure, and functions. , (1997).</li><li>Rahimi-Balaei, M., Bergen, H., Kong, J., Marzban, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+migration+during+development+of+the+cerebellum.">Neuronal migration during development of the cerebellum.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 484 (2018).</li><li>Alder, J., Cho, N. K., Hatten, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+precursor+cells+from+the+rhombic+lip+are+specified+to+a+cerebellar+granule+neuron+identity.">Embryonic precursor cells from the rhombic lip are specified to a cerebellar granule neuron identity.</a> Neuron. 17 (3), 389-399 (1996).</li><li>Hatten, M. E., Heintz, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+neural+patterning+and+specification+in+the+developing+cerebellum.">Mechanisms of neural patterning and specification in the developing cerebellum.</a> Annual Review of Neuroscience. 18, 385-408 (1995).</li><li>Ben-Arie, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Math1+is+essential+for+genesis+of+cerebellar+granule+neurons.">Math1 is essential for genesis of cerebellar granule neurons.</a> Nature. 390 (6656), 169-172 (1997).</li><li>Borghesani, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BDNF+stimulates+migration+of+cerebellar+granule+cells.">BDNF stimulates migration of cerebellar granule cells.</a> Development. 129 (6), 1435-1442 (2002).</li><li>Espinosa, J. S., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Timing+neurogenesis+and+differentiation:+insights+from+quantitative+clonal+analyses+of+cerebellar+granule+cells.">Timing neurogenesis and differentiation: insights from quantitative clonal analyses of cerebellar granule cells.</a> Journal of Neuroscience. 28 (10), 2301-2312 (2008).</li><li>Markwalter, K. H., Yang, Y., Holy, T. E., Bonni, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensorimotor+coding+of+vermal+granule+neurons+in+the+developing+mammalian+cerebellum.">Sensorimotor coding of vermal granule neurons in the developing mammalian cerebellum.</a> Journal of Neuroscience. 39 (34), 6626-6643 (2019).</li><li>Shalizi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PIASx+is+a+MEF2+SUMO+E3+ligase+that+promotes+postsynaptic+dendritic+morphogenesis.">PIASx is a MEF2 SUMO E3 ligase that promotes postsynaptic dendritic morphogenesis.</a> Journal of Neuroscience. 27 (37), 10037-10046 (2007).</li><li>Shalizi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Calcium-regulated+MEF2+sumoylation+switch+controls+poststynaptic+differentiation.">A Calcium-regulated MEF2 sumoylation switch controls poststynaptic differentiation.</a> Science. 311 (5763), 1012-1017 (2006).</li><li>Konishi, Y., Stegmuller, J., Matsuda, T., Bonni, S., Bonni, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cdh1-APC+controls+axonal+growth+and+patterning+in+the+mammalian+brain.">Cdh1-APC controls axonal growth and patterning in the mammalian brain.</a> Science. 303 (5660), 1026-1030 (2004).</li><li>Holubowska, A., Mukherjee, C., Vadhvani, M., Stegmuller, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+manipulation+of+cerebellar+granule+neurons+in+vitro+and+in+vivo+to+study+neuronal+morphology+and+migration.">Genetic manipulation of cerebellar granule neurons in vitro and in vivo to study neuronal morphology and migration.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (85), e51070 (2014).</li><li>Yang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+remodeling+inactivates+activity+genes+and+regulates+neural+coding.">Chromatin remodeling inactivates activity genes and regulates neural coding.</a> Science. 353 (6296), 300-305 (2016).</li><li>Herculano-Houzel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordinated+scaling+of+cortical+and+cerebellar+numbers+of+neurons.">Coordinated scaling of cortical and cerebellar numbers of neurons.</a> Frontiers in Neuroanatomy. 4, 12 (2010).</li><li>Wilson, P. M., Fryer, R. H., Fang, Y., Hatten, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astn2,+a+novel+member+of+the+astrotactin+gene+family,+regulates+the+trafficking+of+ASTN1+during+glial-guided+neuronal+migration.">Astn2, a novel member of the astrotactin gene family, regulates the trafficking of ASTN1 during glial-guided neuronal migration.</a> Journal of Neuroscience. 30 (25), 8529-8540 (2010).</li><li>Kokubo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BDNF-mediated+cerebellar+granule+cell+development+is+impaired+in+mice+null+for+CaMKK2+or+CaMKIV.">BDNF-mediated cerebellar granule cell development is impaired in mice null for CaMKK2 or CaMKIV.</a> Journal of Neuroscience. 29 (28), 8901-8913 (2009).</li><li>Schwartz, P. M., Borghesani, P. R., Levy, R. L., Pomeroy, S. L., Segal, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abnormal+cerebellar+development+and+foliation+in+BDNF-/-+mice+reveals+a+role+for+neurotrophins+in+CNS+patterning.">Abnormal cerebellar development and foliation in BDNF-/- mice reveals a role for neurotrophins in CNS patterning.</a> Neuron. 19 (2), 269-281 (1997).</li><li>Segal, R. A., Pomeroy, S. L., Stiles, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+growth+and+fasciculation+linked+to+differential+expression+of+BDNF+and+NT3+receptors+in+developing+cerebellar+granule+cells.">Axonal growth and fasciculation linked to differential expression of BDNF and NT3 receptors in developing cerebellar granule cells.</a> Journal of Neuroscience. 15 (7), 4970-4981 (1995).</li><li>Zhou, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polarized+signaling+endosomes+coordinate+BDNF-induced+chemotaxis+of+cerebellar+precursors.">Polarized signaling endosomes coordinate BDNF-induced chemotaxis of cerebellar precursors.</a> Neuron. 55 (1), 53-68 (2007).</li><li>Dhar, M., Hantman, A. W., Nishiyama, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+pattern+and+structural+factors+of+dendritic+survival+in+cerebellar+granule+cells+in+vivo.">Developmental pattern and structural factors of dendritic survival in cerebellar granule cells in vivo.</a> Scientific Reports. 8 (1), 17561 (2018).</li><li>Ito, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+plasticity+in+the+cerebellar+cortex+and+its+role+in+motor+learning.">Synaptic plasticity in the cerebellar cortex and its role in motor learning.</a> Canadian Journal of Neurological Sciences. 20, 70-74 (1993).</li><li>Jorntell, H., Hansel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+memories+upside+down:+bidirectional+plasticity+at+cerebellar+parallel+fiber-Purkinje+cell+synapses.">Synaptic memories upside down: bidirectional plasticity at cerebellar parallel fiber-Purkinje cell synapses.</a> Neuron. 52 (2), 227-238 (2006).</li><li>Nakanishi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+manipulation+study+of+information+processing+in+the+cerebellum.">Genetic manipulation study of information processing in the cerebellum.</a> Neuroscience. 162 (3), 723-731 (2009).</li><li>Chang, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atoh1+controls+primary+cilia+formation+to+allow+for+SHH-triggered+granule+neuron+progenitor+proliferation.">Atoh1 controls primary cilia formation to allow for SHH-triggered granule neuron progenitor proliferation.</a> Developmental Cell. 48 (2), 184-199 (2019).</li></ol>

Cerebellar granulatneuroner er de mest tallrike nevronene i pattedyrhjernen, og utgjør nesten 60-70% av den totale nevronpopulasjonen i gnagerhjernen 1,14. Lillehjernen har blitt mye brukt for å belyse mekanismer for cellulær proliferasjon, migrasjon, dendrittdannelse og synapseutvikling 6,9,10,11,15,16,17,18,19,20 <sup cl...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62568">Utilizing In Vivo Postnatal Electroporation to Study Cerebellar Granule Neuron Morphology and Synapse Development</a>. A figure was updated.
Figure 2 was updated from:
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62568/62568fig02.jpg" /> 
Figure 2: In vivo cerebellar electroporation of granule neuron progenitors in P7 wildtype mouse pups. (A) Pups are anesthetized with 4% isoflurane delivered at a rate of 0.8L/min&#160;to ensure anesthesia throughout the injection of the DNA solution. Isoflurane is delivered at a rate of 0.8 L/min. (B) After sterilizing the mouse 3 times with betadine and 70% ethanol, an incision is made that spans the distance of the ears, revealing the hindbrain. (C) A magnified image of a white demarcation on the cranium, a landmark for the injection site. DNA construct should be injected within 1 mm above the mark; dotted lines outline the demarcation, and black arrow denotes the injection site. The ridges of the cerebellar vermis may be visible and can be useful for finding the injection site. (D) Tweezer-type electrode orientation for efficient electroporation. Plus (+) end must be oriented downwards to pull negatively charged DNA into the cerebellar parenchyma prior to administration of electrical pulses. (E) Test injection of 1 &#181;L of a 0.02% Fast Green dye shows injection is localized to the middle of the cerebellar vermis between lobules 5-7. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62568/62568fig02large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>
to:
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62568/62568fig2v2.jpg" /> 
Figure 2: In vivo cerebellar electroporation of granule neuron progenitors in P7 wildtype mouse pups. (A) Pups are anesthetized with 4% isoflurane delivered at a rate of 0.8L/min&#160;to ensure anesthesia throughout the injection of the DNA solution. Isoflurane is delivered at a rate of 0.8 L/min. (B) After sterilizing the mouse 3 times with betadine and 70% ethanol, an incision is made that spans the distance of the ears, revealing the hindbrain. (C) A magnified image of a white demarcation on the cranium, a landmark for the injection site. DNA construct should be injected within 1 mm above the mark; dotted lines outline the demarcation, and black arrow denotes the injection site. The ridges of the cerebellar vermis may be visible and can be useful for finding the injection site. (D) Tweezer-type electrode orientation for efficient electroporation. Plus (+) end must be oriented downwards to pull negatively charged DNA into the cerebellar parenchyma prior to administration of electrical pulses. (E) Test injection of 1 &#181;L of a 0.02% Fast Green dye shows injection is localized to the middle of the cerebellar vermis between lobules 5-7. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62568/62568fig2v2large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62568">Utilizing In Vivo Postnatal Electroporation to Study Cerebellar Granule Neuron Morphology and Synapse Development</a>. A figure was updated.

Erratum: Utilizing In Vivo Postnatal Electroporation to Study Cerebellar Granule Neuron Morphology and Synapse Development

Hjernens utvikling er en langvarig prosess som strekker seg fra embryogenese til postnatal liv. I løpet av denne tiden integrerer hjernen en kombinasjon av inneboende og ekstrinsiske stimuli som former ledningene til synapser mellom dendritter og axoner for til slutt å lede atferd. Gnagerlillehjernen er et ideelt modellsystem for å studere hvordan synapser utvikler seg fordi utviklingen av en enkelt nevrontype, cerebellar granulnevron (CGN), kan spores når den overgår fra en stamcelle til et modent nevron. Dette skyldes delvis det faktum at et flertall av cerebellarcortex utvikler seg postnatalt, noe som muliggjør enkel genetisk manipulering og cellemerking etter fødselen1.
Hos pattedyr begynner CGN-differensiering på slutten av embryonal utvikling når en delmengde av proliferative celler i bakhjernen migrerer over den rombiske leppen for å danne en sekundær germinal sone på overflaten av cerebellum 2,3,4. Selv om de er fullt forpliktet til en granulatnevronprogenitoridentitet (BNP), fortsetter disse cellene å proliferere i den ytre delen av det ytre granulatlaget (EGL) til postnatal dag 14 (P14). Spredning av dette laget resulterer i en massiv utvidelse av lillehjernen da disse cellene gir opphav utelukkende til CGN5. Når nyfødte CGN-er forlater cellesyklusen i EGL, migrerer de innover mot det indre granulatlaget (IGL), og etterlater et axon som vil fordele seg og bevege seg i det molekylære laget av cerebellum, og danne parallelle fibre som synapser på Purkinje-celler6. Plasseringen av disse fibrene i molekyllaget er avhengig av tidspunktet for cellesyklusutgang.
CGN-er som differensierer først, forlater sine parallelle fibre mot bunnen av molekyllaget, mens aksonene til CGN-er som skiller seg senere, er gruppert på toppen 7,8. Når CGN-cellelegemene når IGL, begynner de å utarbeide dendritter og danne synapser med nærliggende hemmende og eksitatoriske nevroner. Det modne dendrittiske treet til en CGN viser en stereotyp arkitektur med fire hovedprosesser. I løpet av CGN-modning danner strukturene på slutten av disse dendrittene en klo som blir beriket med postsynaptiske proteiner 9,10. Disse spesialiserte strukturene, kalt dendrittiske klør, inneholder flertallet av synapsene på granulatneuroner og er viktige for å motta både eksitatoriske innganger fra mosefiberinnerveringer som stammer fra pons, samt hemmende innganger fra lokale Golgi-celler. Når de er fullstendig konfigurert, tillater de synaptiske forbindelsene til CGN-er disse cellene å videresende innganger fra pre-cerebellare kjerner til Purkinje-celler, som projiserer ut av cerebellar cortex til de dype cerebellare kjernene.
In vivo postnatal elektroporering av BNP er fordelaktig i forhold til andre merkingsbaserte metoder, for eksempel virusinfeksjon og generering av transgene muselinjer, fordi uttrykket av ønskede konstruksjoner kan oppnås på en rask tidslinje, og metoden retter seg mot en liten populasjon av celler, som er nyttige for å studere celleautonome effekter. Denne metoden har blitt brukt i tidligere studier for å studere morfologisk utvikling av CGN; Imidlertid har disse studiene fokusert på enten et enkelt tidspunkt eller et kort tidsvindu 9,10,11,12,13. Denne merkemetoden ble parret med bildeanalyse for å dokumentere endringene i CGN-morfologi som forekommer over hele tidsforløpet av CGN-differensiering i løpet av de første tre ukene av postnatallivet. Disse dataene avslører dynamikken i CGN-dendrittutvikling som ligger til grunn for konstruksjon av cerebellarkretser.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Betadine</td>
			<td>Purdue Production</td>
			<td>67618-150-17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cemented 10 &#181;L needle</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>1701SN (80008)</td>
			<td>33 gauge, 1.27 cm (0.5 in), 4 point style</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken anti-GFP</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>AB16901</td>
			<td>Our lab uses this antibody at a 1:1000 concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton-tip applicator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-chicken Cy2</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>703-225-155</td>
			<td>Our lab uses this antibody at a 1:500 concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol (200 proof)</td>
			<td>Koptec</td>
			<td>V1016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporator ECM 830</td>
			<td>BTX Harvard Apparatus</td>
			<td>45-0052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast Green FCF</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F7252-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FUGW plasmid</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>14883</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slides</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48311-703</td>
			<td>Superfrost plus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating pad</td>
			<td>Softheat</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoescht 33342 fluorescent dye</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>62249</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaris</td>
			<td>Bitplane</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Patterson Veterinary</td>
			<td>07-893-1389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro cover glass</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48382-138</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nail polish</td>
			<td>Sally Hansen</td>
			<td>Color 109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal goat serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16210064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O.C.T. embedding compound</td>
			<td>Tissue-Tek</td>
			<td>4583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus MVX10 Dissecting Scope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>MVX10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P200 pipette reach tip</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>02-707-138</td>
			<td>Used for needle spacer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Bemis</td>
			<td>PM-996</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS pH 7.4 (10x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>70011-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Simple Neurite Tracer</td>
			<td>FIJI</td>
			<td></td>
			<td>https://imagej.net/Simple_Neurite_Tracer:_Basic_ 
			Instructions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S0389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical tools</td>
			<td>RWD Life Science</td>
			<td></td>
			<td>Small scissors and tweezers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11332481001</td>
			<td>non-ionic detergent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezertrodes</td>
			<td>BTX Harvard Apparatus</td>
			<td>45-0489</td>
			<td>5 mm, platinum plated tweezer-type electrodes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure distilled water</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10977-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vectashield mounting media</td>
			<td>Vectashield</td>
			<td>H1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vetbond tissue adhesive</td>
			<td>3M</td>
			<td>1469SB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss 780 Upright Confocal</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>780</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

utilizing in vivo postnatal electroporation to study cerebellar granule neuron morphology and synapse development

Nevroner gjennomgår dynamiske endringer i deres struktur og funksjon under hjernens utvikling for å danne passende forbindelser med andre celler. Gnagerlillehjernen er et ideelt system for å spore utvikling og morfogenese av en enkelt celletype, cerebellar granulnevronet (CGN), over tid. Her ble in vivo elektroporering av granulatnevronprogenitorer i det utviklende musens lillehjerne brukt til sparsomt å merke celler for påfølgende morfologiske analyser. Effekten av denne teknikken er demonstrert i sin evne til å vise frem viktige utviklingsstadier av CGN-modning, med et spesifikt fokus på dannelsen av dendritiske klør, som er spesialiserte strukturer der disse cellene mottar flertallet av sine synaptiske innganger. I tillegg til å gi øyeblikksbilder av CGN-synaptiske strukturer gjennom cerebellar utvikling, kan denne teknikken tilpasses for å genetisk manipulere granulatneuroner på en celleautonom måte for å studere rollen til ethvert gen av interesse og dets effekt på CGN-morfologi, kloutvikling og synaptogenese.

<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62568/62568fig04.jpg"> Figur 4: Analyse av granulatnevronmorfologi under lillehjernens utvikling. (A) Maksimale projeksjonsbilder av elektroporerte CGN-er fra 3-DPI til 14-DPI (postnatal alder P10 til P21), kjerner (blå) og GFP (grønn); Pilspisser indikerer individuell dendritt, og skalastangen er 10 μm. (B) Gjennomsnittlig antall dendritter. (C) Gjennomsnittl...

Watch this Scientific Journal Video about Utilizing In Vivo Postnatal Electroporation to Study Cerebellar Granule Neuron Morphology and Synapse Development at JoVE.com

Utilizing In Vivo Postnatal Electroporation to Study Cerebellar Granule Neuron Morphology and Synapse Development

Her beskriver vi en metode for å visualisere synaptogenese av granulatneuroner i musens lillehjerne over tidsforløpet av postnatal hjerneutvikling når disse cellene forbedrer sine synaptiske strukturer og danner synapser for å integrere seg i den generelle hjernekretsen.

Bruk av in vivo postnatal elektroporering for å studere cerebellar granulatneuronmorfologi og synapseutvikling

Neurons undergo dynamic changes in their structure and function during brain development to form appropriate connections with other cells. The rodent ...

Protokollen studerer cerebellære granulatneuroner på tvers av ulike utviklingsstadier for å visualisere viktig morfologisk vekst. Fordelene ved teknikken inkluderer cellespesifikk målretting, raskt uttrykk for transfekterte konstruksjoner og sparsom merking av celler som gjør det mulig å studere celleautonome effekter. Start med å kutte et segment på 11,2 millimeter fra en lastepipettespiss og plasser den kuttede delen over tuppen av Hamilton-sprøyten som et inhalasjonskammer for å begrense injeksjonsdybden til 1,5 millimeter.Fest inhalasjonskammeret på sprøytespissen med plaster eller parafilm. For å studere morfologien til enkeltelektroporerte CGN-er fra sagittale hjerneseksjoner av den eksperimentelle valpen, ta Z-stack-bilder på 0.5 mikrometer per stabel på et konfokalmikroskop. Bilde én celle per bildevindu for å gjøre det enkelt å analysere bilder og rekonstruere 3D.Analyser nevrittlengde og dendritisk klodannelse på en blindet måte ved hjelp av enkel neurittsporer. Last opp enkeltkanals Z-stack-bilder av elektroporerte CGN-er til Fiji og klikk på Plugins"Segmentering"og Simple Neurite Tracer"Velg Opprett ny 3D-visning"fra rullegardinmenyen. Bla til bunnen av en dendrit som kobles til celle soma og start en sti ved å klikke på krysset.Spor banen manuelt ved å klikke gjennom seksjonene der cellefyllingssignalet lyser sterkest og trykke på Y for å beholde sporet. Spor til slutten av dendritten og bekreft banen ved å trykke F.Alternativt kan du spore til bunnen av kloen. Deretter spores kløen fra bunnen av strukturen til slutten av den lengste nevitten.Spor sekundære og tertiære grener ved å holde nede Kontroll på vinduer eller ALT på en macOS og klikke på banen. Bekreft banen ved å trykke på F.Vær oppmerksom på at målinger for sporene er synlige i et eget vindu. Legg sammen alle størrelsene på klogrenene for å oppnå den totale lengden for hver klo.I den representative analysen viste projeksjonsbilder av elektroporerte CGN fra 3 til 14 dager etter injeksjon en progressiv nedgang i antall dendritter. CGN gjennomgikk en fase med dendritisk vekst etterfulgt av raffinement fra 3 DPI til 7 DPI som resulterte i beskjæring av mer enn 50% av overflødige dendritter. Denne hendelsen sammenfaller med den gradvise forlengelsen av de gjenværende arborene i dannelsen av klolignende strukturer på slutten av hver dendrit, noe som indikerer at disse utviklingsprosessene skjer samtidig.Ved 7 DPI ble klør funnet på omtrent 75% av dendrittene. Hver merket CGN ble rekonstruert i NMRS for å kvantifisere det totale somato-dendrittiske overflatearealet og volumet. Ingen signifikant forskjell i CGN-størrelse ble observert på tvers av utviklingen.Selv om CGN-er ved 7 DPI viste en betydelig volumreduksjon på 20 % sammenlignet med 3, 5 og 10 DPI. Det viktigste i prosedyren er å nøyaktig lokalisere cerebellum før injeksjonen. Metoden kan tilpasses genetisk manipulere gener in vivo for å studere deres rolle i granulatnevronutvikling ved transfeksjon av enten shRNA, siRNA eller Cre Recombinase.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Utilizing In Vivo Postnatal Electroporation to Study Cerebellar Granule Neuron Morphology and Synapse Development

Gene Delivery to Postnatal Rat Brain by Non-ventricular Plasmid Injection and Electroporation

Creation of transgenic animals is a standard approach in studying functions of a gene of interest in vivo. However, many knockout or transgenic animals ...

In ovo Electroporation in Chick Midbrain for Studying Gene Function in Dopaminergic Neuron Development

In ovo Electroporation in Chick Midbrain for Studying Gene Function in Dopaminergic Neuron Development

I ovo electroporation i Chick midbrain for å studere gen-funksjon i dopaminerg Neuron Development

Dopaminergic neurons located in the ventral midbrain control movement, emotional behavior, and reward mechanisms1-3. The dysfunction of ventral midbrain ...

In vivo Postnatal Electroporation and Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Mouse Acute Brain Slices

In vivo Postnatal Electroporation and Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Mouse Acute Brain Slices

In vivo Postnatal Electroporation og Time-lapse Imaging av neuroblast Migration in Mouse Akutt Brain Slices

The subventricular zone (SVZ) is one of the main neurogenic niches in the postnatal brain. Here, neural progenitors proliferate and give rise to ...

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Genetisk manipulering av Lillehjernen Granule Neuroner<em&gt; In Vitro</em&gt; Og<em&gt; I Vivo</em&gt; Å studere nevrale morfologi og migrasjon

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow ...

Laser Nanosurgery of Cerebellar Axons In Vivo

Laser Nanosurgery of Cerebellar Axons In Vivo

Laser nanosurgery av lillehjernen Axoner<em&gt; I Vivo</em

Only a few neuronal populations in the central nervous system (CNS) of adult mammals show local regrowth upon dissection of their axon. In order to ...

Mouse Hindbrain Ex Vivo Culture to Study Facial Branchiomotor Neuron Migration

Mouse Hindbrain Ex Vivo Culture to Study Facial Branchiomotor Neuron Migration

Mus hindbrain<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Kultur å studere Facial Branchiomotor Neuron Migration

Embryonic neurons are born in the ventricular zone of the brain, but subsequently migrate to new destinations to reach appropriate targets. Deciphering ...

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

Luktsystemet som en modell for å studere aksonal vekst mønstre og morfologi<em&gt; In Vivo</em

The olfactory system has the unusual capacity to generate new neurons throughout the lifetime of an organism. Olfactory stem cells in the basal portion of ...

The Neuromuscular Junction: Measuring Synapse Size, Fragmentation and Changes in Synaptic Protein Density Using Confocal Fluorescence Microscopy

Nevromuskulære krysset: Måling Synapse Størrelse, fragmentering og endringer i Synaptic Protein Tetthet Bruke Confocal Fluorescensmikroskopi

The neuromuscular junction (NMJ) is the large, cholinergic relay synapse through which mammalian motor neurons control voluntary muscle contraction. ...

Ex Vivo Imaging of Postnatal Cerebellar Granule Cell Migration Using Confocal Macroscopy

Ex Vivo Imaging of Postnatal Cerebellar Granule Cell Migration Using Confocal Macroscopy

Ex vivo avbildning av Postnatal Cerebellar Granule Cell Migration Bruke Confocal Macroscopy

During postnatal development, immature granule cells (excitatory interneurons) exhibit tangential migration in the external granular layer, and then ...