Name: selection of transporter-targeted inhibitory nanobodies by solid-supported-membrane (ssm)-based electrophysiology
Uploaded: 2021-05-03T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Selection of Transporter-Targeted Inhibitory Nanobodies by Solid-Supported-Membrane SSM-Based Electrophysiology at JoVE.com

We bedanken Cedric A. J. Hutter en Markus A. Seeger van het Instituut voor Medische Microbiologie aan de Universiteit van Zürich, en Gonzalo Cebrero van Biozentrum van de Universiteit van Basel voor de samenwerking bij het genereren van synthetische nanobodies (sybodies). Wij danken Maria Barthmes en Andre Bazzone van NANION Technologies voor de technische assistentie. Dit werk werd ondersteund door de Swiss National Science Foundation (SNSF) (PP00P3_170607 en NANION Research Grant Initiative to C.P.).

1. Reconstitutie van membraaneiwitten
<ol><li>Meng 3 ml E. coli polaire lipiden met 1 ml fosfatidylcholine in een ronde bodemkolf onder een geventileerde kap.</li>
	<li>Droog het lipidenmengsel gedurende 20 minuten onder vacuüm met behulp van een roterende verdamper en een waterbad bij 37 °C om chloroform te verwijderen. Droog indien nodig verder onder stikstof of argongas.</li>
	<li>Met behulp van TS-buffer (20 mM Tris-HCl pH 8,0, 150 mM NaCl) met 2 mM β-mercaptoethanol, resuspend lipiden tot 25 mg / ml.</...

<ol>
	<li>Braden, B. C., Goldman, E. R., Mariuzza, R. A., Poljak, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomy+an+antibody+molecule:+structure,+kinetics,+thermodynamics,+and+mutational+studies+of+the+antilysozyme+antibody+D1.3.">Anatomy an antibody molecule: structure, kinetics, thermodynamics, and mutational studies of the antilysozyme antibody D1.3.</a> Immunology Reviews. 163, 45-57 (1998).</li><li>Hamers-Casterman, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Naturally+occurring+antibodies+devoid+of+light+chains.">Naturally occurring antibodies devoid of light chains.</a> Nature. 363, 446-448 (1993).</li><li>Perez, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+of+inhibition+of+lipid-linked+oligosaccharide+flippase+PglK+by+a+conformational+nanobody.">Structural basis of inhibition of lipid-linked oligosaccharide flippase PglK by a conformational nanobody.</a> Science Reports. 7, 46641 (2017).</li><li>Grahl, A., Abiko, L. A., Isogai, S., Sharpe, T., Grzesiek, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-resolution+description+of+beta1-adrenergic+receptor+functional+dynamics+and+allosteric+coupling+from+backbone+NMR.">A high-resolution description of beta1-adrenergic receptor functional dynamics and allosteric coupling from backbone NMR.</a> Nature Communication. 11, 2216 (2020).</li><li>Schenck, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+and+characterization+of+anti-VGLUT+nanobodies+acting+as+inhibitors+of+transport.">Generation and characterization of anti-VGLUT nanobodies acting as inhibitors of transport.</a> Biochemistry. 56, 3962-3971 (2017).</li><li>Mireku, S. A., Sauer, M. M., Glockshuber, R., Locher, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+of+nanobody-mediated+blocking+of+BtuF,+the+cognate+substrate-binding+protein+of+the+Escherichia+coli+vitamin+B12+transporter+BtuCD.">Structural basis of nanobody-mediated blocking of BtuF, the cognate substrate-binding protein of the Escherichia coli vitamin B12 transporter BtuCD.</a> Science Reports. 7, 14296 (2017).</li><li>Manglik, A., Kobilka, B. K., Steyaert, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanobodies+to+study+G+protein-coupled+receptor+structure+and+function.">Nanobodies to study G protein-coupled receptor structure and function.</a> Annual Reviews of Pharmacology Toxicology. 57, 19-37 (2017).</li><li>Rasmussen, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+a+nanobody-stabilized+active+state+of+the+beta(2)+adrenoceptor.">Structure of a nanobody-stabilized active state of the beta(2) adrenoceptor.</a> Nature. 469 (2), 175-180 (2011).</li><li>Jiang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+a+LacY-nanobody+complex+in+a+periplasmic-open+conformation.">Crystal structure of a LacY-nanobody complex in a periplasmic-open conformation.</a> Proceeding of the National Academy of Science U. S. A. 113, 12420-12425 (2016).</li><li>Geertsma, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+a+prokaryotic+fumarate+transporter+reveals+the+architecture+of+the+SLC26+family.">Structure of a prokaryotic fumarate transporter reveals the architecture of the SLC26 family.</a> Nature Structural Molecular Biology. 22, 803-808 (2015).</li><li>Harmsen, M. M., De Haard, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Properties,+production,+and+applications+of+camelid+single-domain+antibody+fragments.">Properties, production, and applications of camelid single-domain antibody fragments.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 77, 13-22 (2007).</li><li>Pardon, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+general+protocol+for+the+generation+of+nanobodies+for+structural+biology.">A general protocol for the generation of nanobodies for structural biology.</a> Nature Protocols. 9, 674-693 (2014).</li><li>Nguyen, V. K., Desmyter, A., Muyldermans, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+heavy-chain+antibodies+in+Camelidae.">Functional heavy-chain antibodies in Camelidae.</a> Advances in Immunology. 79, 261-296 (2001).</li><li>Zimmermann, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+single+domain+antibodies+for+the+conformational+trapping+of+membrane+proteins.">Synthetic single domain antibodies for the conformational trapping of membrane proteins.</a> Elife. 7, 34317 (2018).</li><li>McMahon, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+surface+display+platform+for+rapid+discovery+of+conformationally+selective+nanobodies.">Yeast surface display platform for rapid discovery of conformationally selective nanobodies.</a> Nature Structural Molecular Biology. 25, 289-296 (2018).</li><li>Olichon, A., de Marco, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+a+naive+library+of+camelid+single+domain+antibodies.">Preparation of a naive library of camelid single domain antibodies.</a> Methods in Molecular Biology. 911, 65-78 (2012).</li><li>Moutel, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NaLi-H1:+A+universal+synthetic+library+of+humanized+nanobodies+providing+highly+functional+antibodies+and+intrabodies.">NaLi-H1: A universal synthetic library of humanized nanobodies providing highly functional antibodies and intrabodies.</a> Elife. 5, 16228 (2016).</li><li>Yan, J., Li, G., Hu, Y., Ou, W., Wan, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+of+a+synthetic+phage-displayed+nanobody+library+with+CDR3+regions+randomized+by+trinucleotide+cassettes+for+diagnostic+applications.">Construction of a synthetic phage-displayed nanobody library with CDR3 regions randomized by trinucleotide cassettes for diagnostic applications.</a> Journal of Translational Medicine. 12, 343 (2014).</li><li>Sabir, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+of+naive+camelids+VHH+repertoire+in+phage+display-based+library.">Construction of naive camelids VHH repertoire in phage display-based library.</a> Comptes Rendus Biologies. 337, 244-249 (2014).</li><li>Yau, K. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selection+of+hapten-specific+single-domain+antibodies+from+a+non-immunized+llama+ribosome+display+library.">Selection of hapten-specific single-domain antibodies from a non-immunized llama ribosome display library.</a> Journal of Immunology Methods. 281, 161-175 (2003).</li><li>vander Linden, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+physical+chemical+properties+of+llama+VHH+antibody+fragments+and+mouse+monoclonal+antibodies.">Comparison of physical chemical properties of llama VHH antibody fragments and mouse monoclonal antibodies.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1431, 37-46 (1999).</li><li>Dumoulin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-domain+antibody+fragments+with+high+conformational+stability.">Single-domain antibody fragments with high conformational stability.</a> Protein Science. 11, 500-515 (2002).</li><li>Iezzi, M. E., Policastro, L., Werbajh, S., Podhajcer, O., Canziani, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-domain+antibodies+and+the+promise+of+modular+targeting+in+cancer+imaging+and+treatment.">Single-domain antibodies and the promise of modular targeting in cancer imaging and treatment.</a> Frontiers in Immunology. 9, 273 (2018).</li><li>Yu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanobodies+derived+from+camelids+represent+versatile+biomolecules+for+biomedical+applications.">Nanobodies derived from camelids represent versatile biomolecules for biomedical applications.</a> Biomaterials Science. 8, 3559-3573 (2020).</li><li>Jahnichen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CXCR4+nanobodies+(VHH-based+single+variable+domains)+potently+inhibit+chemotaxis+and+HIV-1+replication+and+mobilize+stem+cells.">CXCR4 nanobodies (VHH-based single variable domains) potently inhibit chemotaxis and HIV-1 replication and mobilize stem cells.</a> Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 107, 20565-20570 (2010).</li><li>Nguyen, V. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+type+VI+secretion+by+an+anti-TssM+llama+nanobody.">Inhibition of type VI secretion by an anti-TssM llama nanobody.</a> PLoS One. 10, 0122187 (2015).</li><li>Bazzone, A., Barthmes, M., Fendler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SSM-Based+Electrophysiology+for+Transporter+Research.">SSM-Based Electrophysiology for Transporter Research.</a> Methods in Enzymology. 594, 31-83 (2017).</li><li>Schulz, P., Garcia-Celma, J. J., Fendler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SSM-based+electrophysiology.">SSM-based electrophysiology.</a> Methods. 46, 97-103 (2008).</li><li>Barthmes, M., Liao, J., Jiang, Y., Bruggemann, A., Wahl-Schott, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophysiological+characterization+of+the+archaeal+transporter+NCX_Mj+using+solid+supported+membrane+technology.">Electrophysiological characterization of the archaeal transporter NCX_Mj using solid supported membrane technology.</a> Journal of General Physiology. 147, 485-496 (2016).</li><li>Watzke, N., Diekert, K., Obrdlik, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophysiology+of+respiratory+chain+complexes+and+the+ADP-ATP+exchanger+in+native+mitochondrial+membranes.">Electrophysiology of respiratory chain complexes and the ADP-ATP exchanger in native mitochondrial membranes.</a> Biochemistry. 49, 10308-10318 (2010).</li><li>Zuber, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetics+of+charge+translocation+in+the+passive+downhill+uptake+mode+of+the+Na+/H++antiporter+NhaA+of+Escherichia+coli.">Kinetics of charge translocation in the passive downhill uptake mode of the Na+/H+ antiporter NhaA of Escherichia coli.</a> Biochim Biophys Acta. 1709, 240-250 (2005).</li><li>Garcia-Celma, J. J., Smirnova, I. N., Kaback, H. R., Fendler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophysiological+characterization+of+LacY.">Electrophysiological characterization of LacY.</a> Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 106, 7373-7378 (2009).</li><li>Bazzone, A., Madej, M. G., Kaback, H. R., Fendler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=pH+regulation+of+electrogenic+sugar/H++symport+in+MFS+sugar+permeases.">pH regulation of electrogenic sugar/H+ symport in MFS sugar permeases.</a> PLoS One. 11, 0156392 (2016).</li><li>Williamson, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+two-lane+mechanism+for+selective+biological+ammonium+transport.">A two-lane mechanism for selective biological ammonium transport.</a> Elife. 9, 57183 (2020).</li><li>Mirandela, G. D., Tamburrino, G., Hoskisson, P. A., Zachariae, U., Javelle, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+lipid+environment+determines+the+activity+of+the+Escherichia+coli+ammonium+transporter+AmtB.">The lipid environment determines the activity of the Escherichia coli ammonium transporter AmtB.</a> FASEB Journal. 33, 1989-1999 (2019).</li><li>Kaplan, R. S., Pedersen, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+microgram+quantities+of+protein+in+the+presence+of+milligram+levels+of+lipid+with+amido+black+10B.">Determination of microgram quantities of protein in the presence of milligram levels of lipid with amido black 10B.</a> Annals of Biochemistry. 150, 97-104 (1985).</li><li>Kermani, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structural+basis+of+promiscuity+in+small+multidrug+resistance+transporters.">The structural basis of promiscuity in small multidrug resistance transporters.</a> Nature Communication. 11, 6064 (2020).</li><li>Weitz, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+and+structural+characterization+of+a+prokaryotic+peptide+transporter+with+features+similar+to+mammalian+PEPT1.">Functional and structural characterization of a prokaryotic peptide transporter with features similar to mammalian PEPT1.</a> Journal of Biological Chemistry. 282, 2832-2839 (2007).</li></ol>

De hier gepresenteerde techniek classificeert nanobodies met remmende en niet-remmende eigenschappen gericht op elektrogene transporters. Het beoordelen van het substraattransport is mogelijk door de detectie van de beweging van ladingen door de transporter ingebed in het membraan van proteoliposomen. Enkele van de kritieke stappen tijdens het opzetten van een experiment zijn reconstitutie van actief eiwit in liposomen, voorbereiding van stabiele monolagen op SSM-chips en herstel van de begincondities na de toepassing va...

Antilichamen bestaan uit twee identieke zware ketens en twee lichte ketens die verantwoordelijk zijn voor de antigeenbinding. Kameelachtigen hebben alleen antilichamen met een zware keten die vergelijkbare affiniteit vertonen voor hun verwante antigeen in vergelijking met conventionele antilichamen1,2. Het single variable domain (VHH) van heavy-chain only antilichamen behoudt de volledige antigeenbindende potentiaal en is zeer stabielgebleken 1,2. Deze geïsoleerde VHH-moleculen of "nanobodies" zijn geïmplementeerd in studies met betrekking tot de biochemie van membraaneiwitten als hulpmiddelen voor het stabiliseren van conformaties3,4,alsremmers 5,6,als stabilisatiemiddelen7en als gadgets voor structuurbepaling8,9,10 . Nanobodies kunnen worden gegenereerd door de immunisatie van kameelachtigen voor de voorverrijking van B-cellen die coderen voor doelspecifieke nanobodies en daaropvolgende isolatie van B-cellen, gevolgd door het klonen van de nanobody-bibliotheek en selectie door faagweergave11,12,13. Een alternatieve manier om nanobodies te genereren is gebaseerd op in vitro selectiemethoden die afhankelijk zijn van de constructie van bibliotheken en selectie door faagweergave, ribosoomweergave of gistweergave14,15,16,17,18,19,20. Deze in vitro methoden vereisen grote bibliotheekgroottes, maar profiteren van het vermijden van dierlijke immunisatie en geven de voorkeur aan de selectie van nanobodies gericht op eiwitten met een relatief lage stabiliteit.
De kleine omvang van nanobodies, hun hoge stabiliteit en oplosbaarheid, sterke antigeenaffiniteit, lage immunogeniciteit en relatief eenvoudige productie, maken ze sterke kandidaten voor de ontwikkeling van therapeutica21,22,23. Met name nanobodies die de activiteit van meerdere membraaneiwitten remmen, zijn potentiële activa voor klinische toepassingen5,24,25,26. In het geval van membraantransporters is het, om te evalueren of een nanolichaam remmende activiteit heeft, noodzakelijk om een test te ontwikkelen die de detectie van getransporteerde substraten en /of co-substraten mogelijk maakt. Dergelijke testen omvatten meestal gelabelde moleculen of het ontwerp van substraatspecifieke detectiemethoden, die mogelijk geen universele toepassing hebben. Bovendien vereist de identificatie van remmende nanobodies over het algemeen de screening van grote aantallen bindmiddelen. Een methode die kan worden gebruikt in een high-throughput-modus en die niet afhankelijk is van gelabelde substraten is dus essentieel voor deze selectie.
SSM-gebaseerde elektrofysiologie is een uiterst gevoelige, zeer tijd-opgeloste techniek die de detectie van beweging van ladingen over membranen (bijv. Ionbinding / transport) mogelijk maakt27,28. Deze techniek is toegepast om elektrogene transporters te karakteriseren, die moeilijk te bestuderen zijn met behulp van andere elektrofysiologische technieken vanwege de relatief lage omzet van deze eiwitten29,30,31,32,33,34,35. SSM-elektrofysiologie vereist geen gebruik van gelabelde substraten, het is geschikt voor screening met hoge doorvoer en proteoliposomen of membraanblaasjes met de transporter van belang kunnen worden gebruikt. Hier tonen we aan dat op SSM gebaseerde elektrofysiologie kan worden gebruikt om transporter-gerichte nanobodies met remmende en niet-remmende eigenschappen te classificeren. Als proof-of-principle beschrijven we de reconstitutie van een bacteriële cholinetransporter in liposomen, gevolgd door gedetailleerde stappen voor immobilisatie van proteoliposomen op de SSM-sensoren. Vervolgens beschrijven we hoe op SSM gebaseerde elektrofysiologische metingen van cholinetransport kunnen worden uitgevoerd en hoe de half-maximale effectieve concentratie kan worden bepaald (EC50). Vervolgens laten we zien hoe we op SSM gebaseerde elektrofysiologie kunnen gebruiken om meerdere nanobodies te screenen en remmers van cholinetransport te identificeren. Ten slotte beschrijven we hoe de half maximale remmende concentraties (IC50) van geselecteerde remmende nanobodies kunnen worden bepaald.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1-octadecanethiol solution</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>O1858-25ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2-diphytanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850356C-25mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-Beads SM-2 Adsorbent (Polystyrene adsorbent beads)</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>#152-3920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PD 10 Desalting Columns</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>GE17-0851-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter 200 nm membrane</td>
			<td>Whatman Nucleopore</td>
			<td>WHA800282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Propanol</td>
			<td>Merck</td>
			<td>33539-1L-R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Decane</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>8034051000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-dodecyl-&#223;-D-maltoside (DDM)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850520P-25g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>131659.1211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(SSM setup) SURFE2R N1</td>
			<td>Nanion</td>
			<td>-----</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SURFE2R N1 Single Sensor Chips</td>
			<td>Nanion</td>
			<td># 161001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma Base</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T1503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli Polar Lipid Extract</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>100600C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Egg PC L-&#945;-phosphatidylcholine </td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>840051C</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

selection of transporter-targeted inhibitory nanobodies by solid-supported-membrane (ssm)-based electrophysiology

Single domain antilichamen (nanobodies) zijn op grote schaal gebruikt in mechanistische en structurele studies van eiwitten en ze vormen een enorm potentieel als hulpmiddelen voor het ontwikkelen van klinische therapieën, waarvan er vele afhankelijk zijn van de remming van membraaneiwitten zoals transporters. De meeste methoden die worden gebruikt om de remming van transportactiviteit te bepalen, zijn echter moeilijk uit te voeren in routines met hoge doorvoer en zijn afhankelijk van de beschikbaarheid van gelabelde substraten, waardoor de screening van grote nanobodybibliotheken wordt bemoeilijkt. Solid-supported membrane (SSM) elektrofysiologie is een high-throughput methode, gebruikt voor het karakteriseren van elektrogene transporters en het meten van hun transportkinetiek en remming. Hier tonen we de implementatie van SSM-gebaseerde elektrofysiologie om remmende en niet-remmende nanobodies te selecteren die zich richten op een elektrogene secundaire transporter en om nanobodies remmende constanten te berekenen. Deze techniek kan vooral nuttig zijn voor het selecteren van remmende nanobodies gericht op transporters waarvoor geen gelabelde substraten beschikbaar zijn.

SSM-gebaseerde elektrofysiologie is op grote schaal gebruikt voor de karakterisering van elektrogene transporters. In het protocol dat hier wordt gepresenteerd, laten we zien hoe SSM-gebaseerde elektrofysiologie kan worden gebruikt om nanobodies te classificeren die zich richten op een secundaire transporter (hier een bacteriële cholinesymporter) op basis van hun remmende en niet-remmende eigenschappen. Een van de meest nuttige kenmerken van deze techniek is dat het de high-throughput screening van meerdere buffercondit...

Watch this Scientific Journal Video about Selection of Transporter-Targeted Inhibitory Nanobodies by Solid-Supported-Membrane SSM-Based Electrophysiology at JoVE.com

Selection of Transporter-Targeted Inhibitory Nanobodies by Solid-Supported-Membrane SSM-Based Electrophysiology

Nanobodies zijn belangrijke hulpmiddelen in de structurele biologie en vormen een groot potentieel voor de ontwikkeling van therapieën. De selectie van nanobodies met remmende eigenschappen kan echter een uitdaging zijn. Hier demonstreren we het gebruik van solid-supported-membrane (SSM)-gebaseerde elektrofysiologie voor de classificatie van remmende en niet-remmende nanobodies gericht op elektrogene membraantransporters.

Selectie van transporter-gerichte remmende nanobodies door solid-supported-membrane (SSM)-gebaseerde elektrofysiologie

Single domain antibodies (nanobodies) have been extensively used in mechanistic and structural studies of proteins and they pose an enormous potential as ...

Het gepresenteerde protocol wordt gebruikt voor high-throughput screening en identificatie van remmende en niet-remmende nanobodies gericht op elektrogene transporters gereconstitueerd in proteoliposomen of aanwezig in membraanblaasjes. Het ontwerpen van transfertests kan in meerdere gevallen moeilijk zijn, vooral als gelabelde substraten niet beschikbaar zijn. Als dezelfde elektrofysiologie het mogelijk maakt om het effect van nanobodies op transport voor vrijwel elke elektrogene transporter te bestuderen, omdat SSM-elektrofysiologie geen gelabelde substraten vereist.Nanobodies zijn onderzocht op hun gebruik in medische toepassingen. Deze techniek kan helpen bij het screenen van potentiële remmers gericht op specifieke elektrogene transporters van mensen of menselijke pathogenen. Neem om te beginnen 10 schone buizen en breng 10 milliliter van het niet-activerende solid-supported membraan, of SSM, buffer over in elke buis.Om de activerende SSM-buffers voor te bereiden, voegt u het substraat toe aan de buizen met behulp van een reeks concentraties rond de verwachte halve maximale concentratie. Start de SSM-software en laat de machine automatisch initialiseren. Stel het opslagpad voor gegevens in.Bevestig door op de knop OK te drukken. Selecteer het standaard initiële reinigingsprotocol in de workflowopties en klik op Uitvoeren. Monteer vervolgens de met proteoliposoom gecoate chip op de socket.Beweeg de arm om de chip te vergrendelen. Omsluit de gemonteerde chip met de dop. Selecteer het programma CapCom in de workflow en laat het uitvoeren om de geleidbaarheid en capaciteit te bepalen.Bevestig dat de geleidbaarheid lager is dan vijf nanosiemens en de capaciteit tussen 15 en 35 nanofarad voordat u deze voor de meting gebruikt. Breng de activerende oplossingen over in injectieflacons en plaats de buffers in de sondebemonsteraar. Breng de niet-activerende buffer over in een reservoir en plaats deze naast de spaanhouder op de reservoirpositie aan de rechterkant.Maak een protocol voor de workflow met behulp van een reeks niet-activerende, activerende en niet-activerende oplossingssequenties, of een BAB-reeks, in een lus die drie metingen uitvoert en naar de volgende activerende buffer voor alle 10 buffers gaat. Gebruik de standaardstroomsnelheid van 200 microliter per seconde met één seconde, één seconde, één seconde stroomtijden voor de BAB-sequentie en klikspel om de meting te starten. Sla het protocol op en laat de workflow uitvoeren door op de afspeelknop te klikken.Voer vervolgens hetzelfde experiment uit met eiwitvrije liposomen. Gebruik voorkeurssoftware voor gegevensanalyse om de gemeten stroom versus tijd uit te zetten en gebruik de functie voor piekhoogteschatting in het bereik van de toevoeging van de activeringsbuffer. Zet de piekstroom uit tegen de substraatconcentratie om het half maximale effect van de concentratie, of EC50, van het substraat via niet-lineaire regressie te bepalen.Breng 50 milliliter van de niet-activerende SSM-buffer over in een schone buis. Voeg het substraat choline toe aan een eindconcentratie van vijf millimol en gebruik dit voor een positieve controlemeting. Breng 10 milliliter van de niet-activerende SSM-buffer over in een schone buis.Voeg substraat choline toe aan vijf millimolar en nanobody aan 500 nanomolaire eindconcentratie. Herhaal de stap voor elk nanolichaam om de activerende oplossingen voor te bereiden zoals gedemonstreerd. Start de SSM-machine en meet de capaciteit en geleidbaarheid van de met proteoliposoom gecoate chip, zoals eerder aangetoond.Breng de activerende oplossing zonder nanobody over in een injectieflacon en plaats de buffer in de sondebemonsteraar. Breng de niet-activerende buffer zonder nanobody over in een reservoir en plaats deze in de sondebemonsteraar. Herhaal dit proces vervolgens voor alle oplossingen die nanobodies bevatten met activerende en niet-activerende oplossing.Maak een protocol voor de workflow met behulp van een BAB-reeks. Maak een lus die drie metingen van de BAB-sequentie uitvoert met behulp van buffers zonder nanobodies, twee metingen van de BAB-sequentie met buffers die een nanobody bevatten, 120 seconden vertragingstijd incubatie met het nanobody en drie metingen van de BAB-sequentie met buffers die het nanobody bevatten. Sla de workflow op en laat deze uitvoeren door op de afspeelknop te klikken.Maak vervolgens een nieuw protocol voor de workflow met behulp van een BAB-sequentie en een lus van vijf metingen om het reversibel gebonden nanolichaam uit te spoelen. Sla de workflow op en laat deze uitvoeren door op de afspeelknop te klikken. Vergelijk de laatste piekstroom van de metingen met de initiële substraat-only meting.Als de piekstroom de beginwaarde bereikt, is het nanolichaam met succes weggespoeld en zijn de begincondities hersteld. Anders herhaalt u de workflow of wijzigt u een nieuwe chip. Herhaal dit proces met behulp van afzonderlijke chips voor elk nanobody-scherm, of herhaal dit met meerdere nanobodies met dezelfde chip.Gebruik voorkeurssoftware voor gegevensanalyse om de gemeten stroom versus tijd uit te zetten. Vervolgens selecteert de software automatisch de functie voor piekhoogteschatting in het bereik van de toevoeging van de activeringsbuffer. Normaliseer de piekstroom en de aanwezigheid van het nanolichaam op basis van de voortschrijdende substraat-only meting.Plot de piekstromen in het histogram en vergelijk de piekstromen van de substraat-only metingen met de piekstromen gemeten in de aanwezigheid van nanobodies om remmende nanobodies te identificeren. Breng 50 milliliter van de niet-activerende SSM-buffer over in een schone buis en voeg het substraat choline toe aan een eindconcentratie van vijf millimolar en gebruik dit als de activerende oplossing voor positieve controle. Voeg vijf milliliter van de niet-activerende oplossing toe aan acht schone buizen en voeg vervolgens substraat choline en remmend nanolichaam toe aan de buizen in concentraties in het verwachte IC50-bereik.Voeg 10 milliliter van de niet-activerende oplossing toe aan de acht buizen en voeg remmend nanolichaam toe aan elke buis die overeenkomt met de niet-activeringsbuffer. Start de SSM-opstelling en meet de capaciteit en geleidbaarheid van de met proteoliposomen gecoate chip. Breng de activerende oplossing zonder nanobody over in een injectieflacon en plaats deze in de sondebemonsteraar.Breng vervolgens de niet-activerende buffer zonder nanobody over in een reservoir en plaats deze op de reservoirpositie naast de chiphouder aan de rechterkant. Breng de activerende en niet-activerende oplossingen die nanobodies bevatten over in injectieflacons en plaats de buffers in de sondebemonsteraar. Maak een protocol voor de workflow met behulp van een BAB-reeks.Voeg een lus toe om elke concentratie twee keer te meten, incubaleer gedurende 120 seconden en meet nog drie keer. Gebruik voorkeurssoftware voor gegevensanalyse om de gemeten stroom versus tijd uit te zetten en selecteer de functie voor de piekhoogteschatting in het bereik van de toevoeging van de activeringsbuffer. Zet de piekstromen uit tegen de nanolichaamconcentratie om de IC50 te bepalen via niet-lineaire regressie.Voor het bepalen van de substraatconcentratie die moet worden gebruikt tijdens een screening van nanobodies, werd elektrogeen transport gemeten onder verschillende substraatconcentraties om EC50 te bepalen. Een substraatconcentratie die overeenkomt met de verzadigingsomstandigheden, vijf millimolair, werd geselecteerd en constant gehouden in alle activerende buffers. Het effect van remmende nanobodies op elektrogeen transport werd gevisualiseerd uit de afname van de amplitude van piekstromen.Na het uitvoeren van het wasprotocol om nanobody los te maken, werd een herstel van 80 tot 95% van de initiële piekstroomamplitude waargenomen. Bij het overschakelen van niet-activerende naar activerende omstandigheden werden geen significante artefactstromen geïntroduceerd door nanobodies die in deze buffers aanwezig waren. Na het selecteren van nanobodies met remmende eigenschappen werden de IC50-waarden voor individuele nanobodies bepaald.Het is cruciaal om voldoende tijd te geven voor de kalibratie van de proteoliposomen op de chip met de buffer die het nanobody bevat. Omdat de binding omkeerbaar is, moet het nanobody aanwezig zijn in zowel activerende als niet-activerende buffers.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Selection of Transporter-Targeted Inhibitory Nanobodies by Solid-Supported-Membrane (SSM)-Based Electrophysiology

Real-time Tracking of DNA Fragment Separation by Smartphone

Real-time Tracking van DNA-fragment scheiding via Smartphone

Slab gel electrophoresis (SGE) is the most common method for the separation of DNA fragments; thus, it is broadly applied to the field of biology and ...

Single-molecule Manipulation of G-quadruplexes by Magnetic Tweezers

Single-molecuul manipulatie van G-quadruplexes door magnetische pincet

Non-canonical nucleic acid secondary structure G-quadruplexes (G4) are involved in diverse cellular processes, such as DNA replication, transcription, RNA ...

Genome-wide Quantification of Translation in Budding Yeast by Ribosome Profiling

Genoom-brede kwantificering van vertaling in de ontluikende gist door het ribosoom profilering

Translation of mRNA into proteins is a complex process involving several layers of regulation. It is often assumed that changes in mRNA transcription ...

Formation of Covalent DNA Adducts by Enzymatically Activated Carcinogens and Drugs In Vitro and Their Determination by 32P-postlabeling

Formation of Covalent DNA Adducts by Enzymatically Activated Carcinogens and Drugs In Vitro and Their Determination by 32P-postlabeling

Vorming van covalente DNA adducten door enzymatisch geactiveerde kankerverwekkende stoffen en Drugs In Vitro en hun vastberadenheid door 32P-postlabeling

Covalent DNA adducts formed by chemicals or drugs with carcinogenic potency are judged as one of the most important factors in the initiation phase of ...

Analysis of Endocytic Uptake and Retrograde Transport to the Trans-Golgi Network Using Functionalized Nanobodies in Cultured Cells

Analyse van endocytotische opname en Retrograde Transport naar het netwerk van de Trans-Golgi matiemaatschappij Nanobodies, waarbij in gekweekte cellen

Transport of proteins and membranes from the cell surface to the Golgi and beyond is essential for homeostasis, organelle identity and physiology. To ...

Imaging of Extracellular Vesicles by Atomic Force Microscopy

Imaging van extracellulaire vesicles door Atoom kracht microscopie

Exosomes and other extracellular vesicles (EVs) are molecular complexes consisting of a lipid membrane vesicle, its surface decoration by membrane ...

Nitropeptide Profiling and Identification Illustrated by Angiotensin II

Nitropeptide profilering en identificatie geïllustreerd door angiotensine II

Protein nitration is one of the most important post-translational modifications (PTM) on tyrosine residues and it can be induced by chemical actions of ...

Interactions with and Membrane Permeabilization of Brain Mitochondria by Amyloid Fibrils

Interacties met en membraan Permeabilization van de mitochondriën van de hersenen door amyloid fibrils

A growing body of evidence indicates that membrane permeabilization, including internal membranes such as mitochondria, is a common feature and primary ...

Creating Highly Specific Chemically Induced Protein Dimerization Systems by Stepwise Phage Selection of a Combinatorial Single-Domain Antibody Library

Het creëren van zeer specifieke chemisch geïnduceerde eiwit Dimerization systemen door stepwise Phage selectie van een Combinatoriale één-domein antilichamen bibliotheek

Protein dimerization events that occur only in the presence of a small-molecule ligand enable the development of small-molecule biosensors for the ...

Rapid Determination of Antibody-Antigen Affinity by Mass Photometry

Snelle bepaling van antilichaam-antigeen affiniteit door massa fotometrie

Measurements of the specificity and affinity of antigen-antibody interactions are critically important for medical and research applications. In this ...