Name: selection of transporter-targeted inhibitory nanobodies by solid-supported-membrane (ssm)-based electrophysiology
Uploaded: 2021-05-03T14:00:00
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Nous remercions Cedric A. J. Hutter et Markus A. Seeger de l’Institut de microbiologie médicale de l’Université de Zurich, et Gonzalo Cebrero du Biozentrum de l’Université de Bâle pour leur collaboration dans la génération de nanocorps synthétiques (corps sybodies). Nous remercions Maria Barthmes et André Bazzone de NANION Technologies pour leur assistance technique. Ce travail a été soutenu par le Fonds national suisse (FNS) (PP00P3_170607 et NANION Research Grant Initiative to C.P.).

1. Reconstitution des protéines membranaires
<ol><li>Mélanger 3 mL de lipides polaires d’E. coli avec 1 mL de phosphatidylcholine dans une fiole à fond rond sous une hotte ventilée.</li>
	<li>Sécher le mélange lipidique pendant 20 min sous vide à l’aide d’un évaporateur rotatif et d’un bain-marie à 37 °C pour éliminer le chloroforme. Si nécessaire, sécher davantage sous azote ou argon gazeux.</li>
	<li>À l’aide d’un tampon TS (20 mM Tris-HCl pH 8,0, 150 mM NaCl) contenant 2 mM β-merc...

<ol>
	<li>Braden, B. C., Goldman, E. R., Mariuzza, R. A., Poljak, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomy+an+antibody+molecule:+structure,+kinetics,+thermodynamics,+and+mutational+studies+of+the+antilysozyme+antibody+D1.3.">Anatomy an antibody molecule: structure, kinetics, thermodynamics, and mutational studies of the antilysozyme antibody D1.3.</a> Immunology Reviews. 163, 45-57 (1998).</li><li>Hamers-Casterman, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Naturally+occurring+antibodies+devoid+of+light+chains.">Naturally occurring antibodies devoid of light chains.</a> Nature. 363, 446-448 (1993).</li><li>Perez, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+of+inhibition+of+lipid-linked+oligosaccharide+flippase+PglK+by+a+conformational+nanobody.">Structural basis of inhibition of lipid-linked oligosaccharide flippase PglK by a conformational nanobody.</a> Science Reports. 7, 46641 (2017).</li><li>Grahl, A., Abiko, L. A., Isogai, S., Sharpe, T., Grzesiek, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-resolution+description+of+beta1-adrenergic+receptor+functional+dynamics+and+allosteric+coupling+from+backbone+NMR.">A high-resolution description of beta1-adrenergic receptor functional dynamics and allosteric coupling from backbone NMR.</a> Nature Communication. 11, 2216 (2020).</li><li>Schenck, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+and+characterization+of+anti-VGLUT+nanobodies+acting+as+inhibitors+of+transport.">Generation and characterization of anti-VGLUT nanobodies acting as inhibitors of transport.</a> Biochemistry. 56, 3962-3971 (2017).</li><li>Mireku, S. A., Sauer, M. M., Glockshuber, R., Locher, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+of+nanobody-mediated+blocking+of+BtuF,+the+cognate+substrate-binding+protein+of+the+Escherichia+coli+vitamin+B12+transporter+BtuCD.">Structural basis of nanobody-mediated blocking of BtuF, the cognate substrate-binding protein of the Escherichia coli vitamin B12 transporter BtuCD.</a> Science Reports. 7, 14296 (2017).</li><li>Manglik, A., Kobilka, B. K., Steyaert, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanobodies+to+study+G+protein-coupled+receptor+structure+and+function.">Nanobodies to study G protein-coupled receptor structure and function.</a> Annual Reviews of Pharmacology Toxicology. 57, 19-37 (2017).</li><li>Rasmussen, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+a+nanobody-stabilized+active+state+of+the+beta(2)+adrenoceptor.">Structure of a nanobody-stabilized active state of the beta(2) adrenoceptor.</a> Nature. 469 (2), 175-180 (2011).</li><li>Jiang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+a+LacY-nanobody+complex+in+a+periplasmic-open+conformation.">Crystal structure of a LacY-nanobody complex in a periplasmic-open conformation.</a> Proceeding of the National Academy of Science U. S. A. 113, 12420-12425 (2016).</li><li>Geertsma, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+a+prokaryotic+fumarate+transporter+reveals+the+architecture+of+the+SLC26+family.">Structure of a prokaryotic fumarate transporter reveals the architecture of the SLC26 family.</a> Nature Structural Molecular Biology. 22, 803-808 (2015).</li><li>Harmsen, M. M., De Haard, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Properties,+production,+and+applications+of+camelid+single-domain+antibody+fragments.">Properties, production, and applications of camelid single-domain antibody fragments.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 77, 13-22 (2007).</li><li>Pardon, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+general+protocol+for+the+generation+of+nanobodies+for+structural+biology.">A general protocol for the generation of nanobodies for structural biology.</a> Nature Protocols. 9, 674-693 (2014).</li><li>Nguyen, V. K., Desmyter, A., Muyldermans, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+heavy-chain+antibodies+in+Camelidae.">Functional heavy-chain antibodies in Camelidae.</a> Advances in Immunology. 79, 261-296 (2001).</li><li>Zimmermann, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+single+domain+antibodies+for+the+conformational+trapping+of+membrane+proteins.">Synthetic single domain antibodies for the conformational trapping of membrane proteins.</a> Elife. 7, 34317 (2018).</li><li>McMahon, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+surface+display+platform+for+rapid+discovery+of+conformationally+selective+nanobodies.">Yeast surface display platform for rapid discovery of conformationally selective nanobodies.</a> Nature Structural Molecular Biology. 25, 289-296 (2018).</li><li>Olichon, A., de Marco, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+a+naive+library+of+camelid+single+domain+antibodies.">Preparation of a naive library of camelid single domain antibodies.</a> Methods in Molecular Biology. 911, 65-78 (2012).</li><li>Moutel, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NaLi-H1:+A+universal+synthetic+library+of+humanized+nanobodies+providing+highly+functional+antibodies+and+intrabodies.">NaLi-H1: A universal synthetic library of humanized nanobodies providing highly functional antibodies and intrabodies.</a> Elife. 5, 16228 (2016).</li><li>Yan, J., Li, G., Hu, Y., Ou, W., Wan, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+of+a+synthetic+phage-displayed+nanobody+library+with+CDR3+regions+randomized+by+trinucleotide+cassettes+for+diagnostic+applications.">Construction of a synthetic phage-displayed nanobody library with CDR3 regions randomized by trinucleotide cassettes for diagnostic applications.</a> Journal of Translational Medicine. 12, 343 (2014).</li><li>Sabir, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+of+naive+camelids+VHH+repertoire+in+phage+display-based+library.">Construction of naive camelids VHH repertoire in phage display-based library.</a> Comptes Rendus Biologies. 337, 244-249 (2014).</li><li>Yau, K. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selection+of+hapten-specific+single-domain+antibodies+from+a+non-immunized+llama+ribosome+display+library.">Selection of hapten-specific single-domain antibodies from a non-immunized llama ribosome display library.</a> Journal of Immunology Methods. 281, 161-175 (2003).</li><li>vander Linden, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+physical+chemical+properties+of+llama+VHH+antibody+fragments+and+mouse+monoclonal+antibodies.">Comparison of physical chemical properties of llama VHH antibody fragments and mouse monoclonal antibodies.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1431, 37-46 (1999).</li><li>Dumoulin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-domain+antibody+fragments+with+high+conformational+stability.">Single-domain antibody fragments with high conformational stability.</a> Protein Science. 11, 500-515 (2002).</li><li>Iezzi, M. E., Policastro, L., Werbajh, S., Podhajcer, O., Canziani, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-domain+antibodies+and+the+promise+of+modular+targeting+in+cancer+imaging+and+treatment.">Single-domain antibodies and the promise of modular targeting in cancer imaging and treatment.</a> Frontiers in Immunology. 9, 273 (2018).</li><li>Yu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanobodies+derived+from+camelids+represent+versatile+biomolecules+for+biomedical+applications.">Nanobodies derived from camelids represent versatile biomolecules for biomedical applications.</a> Biomaterials Science. 8, 3559-3573 (2020).</li><li>Jahnichen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CXCR4+nanobodies+(VHH-based+single+variable+domains)+potently+inhibit+chemotaxis+and+HIV-1+replication+and+mobilize+stem+cells.">CXCR4 nanobodies (VHH-based single variable domains) potently inhibit chemotaxis and HIV-1 replication and mobilize stem cells.</a> Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 107, 20565-20570 (2010).</li><li>Nguyen, V. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+type+VI+secretion+by+an+anti-TssM+llama+nanobody.">Inhibition of type VI secretion by an anti-TssM llama nanobody.</a> PLoS One. 10, 0122187 (2015).</li><li>Bazzone, A., Barthmes, M., Fendler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SSM-Based+Electrophysiology+for+Transporter+Research.">SSM-Based Electrophysiology for Transporter Research.</a> Methods in Enzymology. 594, 31-83 (2017).</li><li>Schulz, P., Garcia-Celma, J. J., Fendler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SSM-based+electrophysiology.">SSM-based electrophysiology.</a> Methods. 46, 97-103 (2008).</li><li>Barthmes, M., Liao, J., Jiang, Y., Bruggemann, A., Wahl-Schott, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophysiological+characterization+of+the+archaeal+transporter+NCX_Mj+using+solid+supported+membrane+technology.">Electrophysiological characterization of the archaeal transporter NCX_Mj using solid supported membrane technology.</a> Journal of General Physiology. 147, 485-496 (2016).</li><li>Watzke, N., Diekert, K., Obrdlik, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophysiology+of+respiratory+chain+complexes+and+the+ADP-ATP+exchanger+in+native+mitochondrial+membranes.">Electrophysiology of respiratory chain complexes and the ADP-ATP exchanger in native mitochondrial membranes.</a> Biochemistry. 49, 10308-10318 (2010).</li><li>Zuber, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetics+of+charge+translocation+in+the+passive+downhill+uptake+mode+of+the+Na+/H++antiporter+NhaA+of+Escherichia+coli.">Kinetics of charge translocation in the passive downhill uptake mode of the Na+/H+ antiporter NhaA of Escherichia coli.</a> Biochim Biophys Acta. 1709, 240-250 (2005).</li><li>Garcia-Celma, J. J., Smirnova, I. N., Kaback, H. R., Fendler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophysiological+characterization+of+LacY.">Electrophysiological characterization of LacY.</a> Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 106, 7373-7378 (2009).</li><li>Bazzone, A., Madej, M. G., Kaback, H. R., Fendler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=pH+regulation+of+electrogenic+sugar/H++symport+in+MFS+sugar+permeases.">pH regulation of electrogenic sugar/H+ symport in MFS sugar permeases.</a> PLoS One. 11, 0156392 (2016).</li><li>Williamson, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+two-lane+mechanism+for+selective+biological+ammonium+transport.">A two-lane mechanism for selective biological ammonium transport.</a> Elife. 9, 57183 (2020).</li><li>Mirandela, G. D., Tamburrino, G., Hoskisson, P. A., Zachariae, U., Javelle, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+lipid+environment+determines+the+activity+of+the+Escherichia+coli+ammonium+transporter+AmtB.">The lipid environment determines the activity of the Escherichia coli ammonium transporter AmtB.</a> FASEB Journal. 33, 1989-1999 (2019).</li><li>Kaplan, R. S., Pedersen, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+microgram+quantities+of+protein+in+the+presence+of+milligram+levels+of+lipid+with+amido+black+10B.">Determination of microgram quantities of protein in the presence of milligram levels of lipid with amido black 10B.</a> Annals of Biochemistry. 150, 97-104 (1985).</li><li>Kermani, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structural+basis+of+promiscuity+in+small+multidrug+resistance+transporters.">The structural basis of promiscuity in small multidrug resistance transporters.</a> Nature Communication. 11, 6064 (2020).</li><li>Weitz, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+and+structural+characterization+of+a+prokaryotic+peptide+transporter+with+features+similar+to+mammalian+PEPT1.">Functional and structural characterization of a prokaryotic peptide transporter with features similar to mammalian PEPT1.</a> Journal of Biological Chemistry. 282, 2832-2839 (2007).</li></ol>

La technique présentée ici classe les nanocorps aux propriétés inhibitrices et non inhibitrices ciblant les transporteurs électrogéniques. L’évaluation du transport du substrat est possible grâce à la détection du mouvement des charges à travers le transporteur intégré dans la membrane des protéoliposomes. Certaines des étapes critiques lors de la mise en place d’une expérience sont la reconstitution de protéines actives dans les liposomes, la préparation de monocouches stables sur des puces SSM et ...

Les anticorps sont composés de deux chaînes lourdes identiques et de deux chaînes légères responsables de la liaison à l’antigène. Les camélidés ont des anticorps à chaîne lourde seulement qui présentent une affinité similaire pour leur antigène apparenté par rapport aux anticorps conventionnels1,2. Le domaine variable unique (VHH) des anticorps à chaîne lourde conserve le plein potentiel de liaison à l’antigène et s’est avéré très stable1,2. Ces molécules VHH isolées ou « nanocorps » ont été mises en œuvre dans des études liées à la biochimie des protéines membranaires comme outils de stabilisation des conformations3,4,comme inhibiteurs5,6,comme agents de stabilisation7,et comme gadgets pour la détermination de la structure8,9,10 . Les nanocorps peuvent être générés par l’immunisation des camélidés pour le pré-enrichissement des cellules B qui codent des nanocorps spécifiques à la cible et l’isolement ultérieur des cellules B, suivi du clonage de la bibliothèque de nanocorps et de la sélection par affichage dephages 11,12,13. Une autre façon de générer des nanocorps est basée sur des méthodes de sélection in vitro qui reposent sur la construction de bibliothèques et la sélection par affichage de phages, affichage de ribosomes ou affichage de levure14,15,16,17,18,19,20. Ces méthodes in vitro nécessitent de grandes bibliothèques mais bénéficient d’éviter l’immunisation animale et favorisent la sélection de nanocorps ciblant des protéines relativement peu stables.
La petite taille des nanocorps, leur grande stabilité et solubilité, leur forte affinité antigénique, leur faible immunogénicité et leur production relativement facile en font de bons candidats pour le développement de thérapies21,22,23. En particulier, les nanocorps inhibant l’activité de protéines membranaires multiples sont des atouts potentiels pour des applications cliniques5,24,25,26. Dans le cas des transporteurs membranaires, pour évaluer si un nanocorps a une activité inhibitrice, il est nécessaire de développer un test permettant la détection de substrats transportés et/ou de co-substrats. De tels tests impliquent généralement des molécules marquées ou la conception de méthodes de détection spécifiques au substrat, qui peuvent ne pas avoir d’application universelle. De plus, l’identification de nanocorps inhibiteurs nécessite généralement le criblage d’un grand nombre de liants. Ainsi, une méthode qui peut être utilisée en mode haut débit et qui ne repose pas sur des substrats étiquetés est essentielle pour cette sélection.
L’électrophysiologie basée sur le MSU est une technique extrêmement sensible et très résolue dans le temps qui permet de détecter le mouvement des charges à travers les membranes (par exemple, la liaison /transport d’ions)27,28. Cette technique a été appliquée pour caractériser les transporteurs électrogéniques, qui sont difficiles à étudier en utilisant d’autres techniques d’électrophysiologie en raison du renouvellement relativement faible de ces protéines29,30,31,32,33,34,35. L’électrophysiologie SSM ne nécessite pas l’utilisation de substrats marqués, elle convient au criblage à haut débit et des protéoliposomes ou des vésicules membranaires contenant le transporteur d’intérêt peuvent être utilisés. Ici, nous démontrons que l’électrophysiologie basée sur le MSU peut être utilisée pour classer les nanocorps ciblés par les transporteurs avec des propriétés inhibitrices et non inhibitrices. Comme preuve de principe, nous décrivons la reconstitution d’un transporteur de choline bactérienne en liposomes, suivie d’étapes détaillées pour l’immobilisation des protéoliposomes sur les capteurs SSM. Nous décrivons ensuite comment effectuer des mesures électrophysiologiques basées sur le MSU du transport de la choline et comment déterminer la concentration efficace demi-maximale (EC50). Nous montrons ensuite comment utiliser l’électrophysiologie basée sur le MSU pour dépister plusieurs nanocorps et identifier les inhibiteurs du transport de la choline. Enfin, nous décrivons comment déterminer les concentrations inhibitrices demi-maximales (IC50)de nanocorps inhibiteurs sélectionnés.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1-octadecanethiol solution</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>O1858-25ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2-diphytanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850356C-25mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-Beads SM-2 Adsorbent (Polystyrene adsorbent beads)</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>#152-3920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PD 10 Desalting Columns</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>GE17-0851-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter 200 nm membrane</td>
			<td>Whatman Nucleopore</td>
			<td>WHA800282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Propanol</td>
			<td>Merck</td>
			<td>33539-1L-R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Decane</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>8034051000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-dodecyl-&#223;-D-maltoside (DDM)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850520P-25g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>131659.1211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(SSM setup) SURFE2R N1</td>
			<td>Nanion</td>
			<td>-----</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SURFE2R N1 Single Sensor Chips</td>
			<td>Nanion</td>
			<td># 161001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma Base</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T1503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli Polar Lipid Extract</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>100600C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Egg PC L-&#945;-phosphatidylcholine </td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>840051C</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

selection of transporter-targeted inhibitory nanobodies by solid-supported-membrane (ssm)-based electrophysiology

Les anticorps à domaine unique (nanocorps) ont été largement utilisés dans les études mécanistes et structurelles des protéines et ils présentent un énorme potentiel en tant qu’outils pour le développement de thérapies cliniques, dont beaucoup dépendent de l’inhibition des protéines membranaires telles que les transporteurs. Cependant, la plupart des méthodes utilisées pour déterminer l’inhibition de l’activité de transport sont difficiles à effectuer dans les routines à haut débit et dépendent de la disponibilité des substrats marqués, ce qui complique le criblage de grandes bibliothèques de nanocorps. L’électrophysiologie à membrane solide (SSM) est une méthode à haut débit, utilisée pour caractériser les transporteurs électrogéniques et mesurer leur cinétique de transport et leur inhibition. Nous montrons ici la mise en œuvre de l’électrophysiologie basée sur le MSU pour sélectionner des nanocorps inhibiteurs et non inhibiteurs ciblant un transporteur secondaire électrogénique et pour calculer les constantes inhibitrices des nanocorps. Cette technique peut être particulièrement utile pour sélectionner des nanocorps inhibiteurs ciblant des transporteurs pour lesquels des substrats marqués ne sont pas disponibles.

L’électrophysiologie basée sur le MSU a été largement utilisée pour la caractérisation des transporteurs électrogéniques. Dans le protocole présenté ici, nous montrons comment utiliser l’électrophysiologie basée sur le MSU pour classer les nanocorps ciblant un transporteur secondaire (ici un symporteur de choline bactérienne) en fonction de leurs propriétés inhibitrices et non inhibitrices. L’une des caractéristiques les plus utiles de cette technique est qu’elle permet le criblage à haut débit ...

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Selection of Transporter-Targeted Inhibitory Nanobodies by Solid-Supported-Membrane SSM-Based Electrophysiology

Les nanocorps sont des outils importants en biologie structurale et présentent un grand potentiel pour le développement de thérapies. Cependant, la sélection de nanocorps ayant des propriétés inhibitrices peut être difficile. Nous démontrons ici l’utilisation de l’électrophysiologie à membrane solide (SSM) pour la classification des nanocorps inhibiteurs et non inhibiteurs ciblant les transporteurs membranaires électrogéniques.

Sélection de nanocorps inhibiteurs ciblant les transporteurs par électrophysiologie à membrane solide (SSM)

Single domain antibodies (nanobodies) have been extensively used in mechanistic and structural studies of proteins and they pose an enormous potential as ...

Le protocole présenté est utilisé pour le criblage à haut débit et l’identification de nanocorps inhibiteurs et non inhibiteurs ciblant les transporteurs électrogéniques reconstitués dans les protéoliposomes ou présents dans les vésicules membranaires. La conception de tests de transfert peut être difficile dans plusieurs cas, surtout si les substrats étiquetés ne sont pas disponibles. Si la même électrophysiologie permet d’étudier l’effet des nanocorps sur le transport de pratiquement tous les transporteurs électrogéniques, puisque l’électrophysiologie SSM ne nécessite pas de substrats marqués.Les nanocorps ont été étudiés pour leur utilisation dans des applications médicales. Cette technique peut aider à dépister les inhibiteurs potentiels ciblant des transporteurs électrogéniques spécifiques d’humains ou d’agents pathogènes humains. Pour commencer, prenez 10 tubes propres et transférez 10 millilitres de tampon à membrane solide non active, ou SSM, dans chaque tube.Pour préparer les tampons SSM activateurs, ajoutez le substrat dans les tubes en utilisant une série de concentrations autour de la demi-concentration maximale attendue. Démarrez le logiciel SSM et laissez la machine s’initialiser automatiquement. Définissez le chemin d’enregistrement des données.Confirmez en appuyant sur le bouton OK. Sélectionnez le protocole de nettoyage initial standard dans les options de flux de travail et cliquez sur Exécuter. Ensuite, montez la puce recouverte de protéoliposome sur la douille.Déplacez le bras pour verrouiller la puce. Entourez la puce montée avec le capuchon. Sélectionnez le programme CapCom dans le flux de travail et laissez-le s’exécuter pour déterminer la conductivité et la capacité.Confirmez que la conductivité est inférieure à cinq nanosiemens et que la capacité est comprise entre 15 et 35 nanofarad avant de l’utiliser pour la mesure. Transférez les solutions d’activation dans des flacons et positionnez les tampons dans l’échantillonneur de sonde. Transférez le tampon non actif dans un réservoir et placez-le à côté du porte-puce à la position du réservoir à droite.Créez un protocole pour le flux de travail à l’aide d’une séquence de solution non active, activée et non active, ou d’une séquence BAB, dans une boucle qui effectue trois mesures et passe au tampon d’activation suivant pour les 10 tampons. Utilisez le débit par défaut de 200 microlitres par seconde avec un temps d’écoulement d’une seconde, d’une seconde et d’une seconde pour la séquence BAB et cliquez sur lecture pour démarrer la mesure. Enregistrez le protocole et laissez le flux de travail s’exécuter en cliquant sur le bouton de lecture.Effectuez ensuite la même expérience en utilisant des liposomes sans protéines. Utilisez n’importe quel logiciel préféré pour l’analyse des données pour tracer le courant mesuré par rapport au temps et utilisez la fonction pour l’estimation de la hauteur de crête dans la plage de l’ajout du tampon d’activation. Tracer le courant de crête par rapport à la concentration du substrat pour déterminer le demi-effet maximal de la concentration, ou CE50, du substrat via une régression non linéaire.Transférer 50 millilitres du tampon SSM non actif dans un tube propre. Ajouter le substrat choline à une concentration finale de cinq millimolaires et l’utiliser pour une mesure de contrôle positif. Transférez 10 millilitres du tampon SSM non activateur dans un tube propre.Ajouter la choline de substrat à cinq millimolaires et le nanocorps à la concentration finale de 500 nanomolaires. Répétez l’étape pour chaque nanocorps afin de préparer les solutions d’activation comme illustré. Démarrez la machine SSM et mesurez la capacité et la conductivité de la puce revêtue de protéoliposomes, comme démontré précédemment.Transférez la solution activatrice sans nanocorps dans un flacon et placez le tampon dans l’échantillonneur de sonde. Transférez le tampon non actif sans nanocorps dans un réservoir et positionnez-le dans l’échantillonneur de sonde. Répétez ensuite ce processus pour toutes les solutions contenant des nanocorps avec une solution activatrice et non active.Créez un protocole pour le flux de travail à l’aide d’une séquence BAB. Créez une boucle qui effectue trois mesures de la séquence BAB à l’aide de tampons sans nanocorps, deux mesures de la séquence BAB avec des tampons contenant un nanocorps, une incubation de 120 secondes avec le nanocorps et trois mesures de la séquence BAB avec des tampons contenant le nanocorps. Enregistrez le flux de travail et laissez-le s’exécuter en cliquant sur le bouton de lecture.Ensuite, créez un nouveau protocole pour le flux de travail en utilisant une séquence BAB et une boucle de cinq mesures pour laver le corps nano lié de manière réversible. Enregistrez le flux de travail et laissez-le s’exécuter en cliquant sur le bouton de lecture. Comparez le dernier courant de crête des mesures avec la mesure initiale du substrat uniquement.Si le courant de crête atteint la valeur initiale, le nanocorps a été lavé avec succès et les conditions initiales ont été rétablies. Sinon, répétez le flux de travail ou passez à une nouvelle puce. Répétez ce processus en utilisant des puces individuelles pour chaque écran de nanocorps, ou répétez avec plusieurs nanocorps utilisant la même puce.Utilisez n’importe quel logiciel préféré pour l’analyse des données afin de tracer le courant mesuré par rapport au temps. Ensuite, le logiciel sélectionne automatiquement la fonction d’estimation de la hauteur de crête dans la plage de l’ajout du tampon d’activation. Normalisez le courant de crête et la présence du nanocorps en fonction de la mesure du substrat en cours.Tracez les courants de crête dans l’histogramme et comparez les courants de crête des mesures de substrat uniquement aux courants de crête mesurés en présence de nanocorps pour identifier les nanocorps inhibiteurs. Transférer 50 millilitres du tampon SSM non actif dans un tube propre et ajouter la choline de substrat à une concentration finale de cinq millimolaires, et l’utiliser comme solution activatrice pour le contrôle positif. Ajouter cinq millilitres de la solution non active à huit tubes propres, puis ajouter de la choline de substrat et du nanocorps inhibiteur aux tubes à des concentrations dans la plage IC50 attendue.Ajouter 10 millilitres de la solution non active aux huit tubes et ajouter un nanocorps inhibiteur à chaque tube correspondant au tampon de non-activation. Démarrez la configuration SSM et mesurez la capacité et la conductivité de la puce revêtue de protéoliposome. Transférez la solution activatrice sans nanocorps dans un flacon et placez-la dans l’échantillonneur de sonde.Ensuite, transférez le tampon non actif sans nanocorps dans un réservoir et positionnez-le à la position du réservoir à côté du porte-puce à droite. Transférer les solutions activatrices et non actives contenant des nanocorps dans des flacons et positionner les tampons dans l’échantillonneur de sonde. Créez un protocole pour le flux de travail à l’aide d’une séquence BAB.Inclure une boucle pour mesurer chaque concentration deux fois, incuber pendant 120 secondes et mesurer trois fois de plus. Utilisez n’importe quel logiciel préféré pour l’analyse des données pour tracer le courant mesuré par rapport au temps et sélectionnez la fonction pour l’estimation de la hauteur de crête dans la plage de l’ajout du tampon d’activation. Tracer les courants de crête par rapport à la concentration de nanocorps pour déterminer la CI50 via une régression non linéaire.Pour déterminer la concentration du substrat à utiliser lors d’un criblage de nanocorps, le transport électrogénique a été mesuré sous différentes concentrations de substrat pour déterminer la CE50. Une concentration de substrat correspondant à des conditions saturantes, cinq millimolaires, a été sélectionnée et maintenue constante dans tous les tampons d’activation. L’effet des nanocorps inhibiteurs sur le transport électrogénique a été visualisé à partir de la diminution des amplitudes des courants de crête.Après avoir exécuté le protocole de lavage pour permettre le déliaison des nanocorps, une récupération de 80 à 95% de l’amplitude initiale du courant de crête a été observée. Lors du passage de conditions non actives à des conditions d’activation, aucun courant d’artefact significatif n’a été introduit par les nanocorps présents dans ces tampons. Après avoir sélectionné des nanocorps ayant des propriétés inhibitrices, les valeurs IC50 pour les nanocorps individuels ont été déterminées.Il est crucial de donner suffisamment de temps pour l’étalonnage des protéoliposomes sur la puce avec le tampon contenant le nanocorps. Étant donné que la liaison est réversible, le nanocorps doit être présent dans les tampons activateurs et non activateurs.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Selection of Transporter-Targeted Inhibitory Nanobodies by Solid-Supported-Membrane (SSM)-Based Electrophysiology

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Modification et fonctionnalisation du groupe Guanidine par Précurseurs sur mesure

The guanidine group is one of the most important pharmacophoric groups in medicinal chemistry. The only amino acid carrying a guanidine group is arginine. ...

Recherche

Biochimie

Real-time Tracking of DNA Fragment Separation by Smartphone

Suivi en temps réel de la séparation des fragments d&#39;ADN par téléphone intelligent

Slab gel electrophoresis (SGE) is the most common method for the separation of DNA fragments; thus, it is broadly applied to the field of biology and ...

Single-molecule Manipulation of G-quadruplexes by Magnetic Tweezers

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Formation of Covalent DNA Adducts by Enzymatically Activated Carcinogens and Drugs In Vitro and Their Determination by 32P-postlabeling

Formation of Covalent DNA Adducts by Enzymatically Activated Carcinogens and Drugs In Vitro and Their Determination by 32P-postlabeling

Formation de l’ADN Covalent adduits cancérogènes enzymatiquement activés et médicaments In Vitro et leur détermination par 32P-post-marquage

Covalent DNA adducts formed by chemicals or drugs with carcinogenic potency are judged as one of the most important factors in the initiation phase of ...

Analysis of Endocytic Uptake and Retrograde Transport to the Trans-Golgi Network Using Functionalized Nanobodies in Cultured Cells

Analyse de l’endocytose absorption et Transport rétrograde au réseau Trans-Golgi dans des cellules cultivées à l’aide de Nanocorps fonctionnalisés

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Imaging of Extracellular Vesicles by Atomic Force Microscopy

Imagerie des vésicules extracellulaires par microscopie de force atomique

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Interactions with and Membrane Permeabilization of Brain Mitochondria by Amyloid Fibrils

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A growing body of evidence indicates that membrane permeabilization, including internal membranes such as mitochondria, is a common feature and primary ...

Creating Highly Specific Chemically Induced Protein Dimerization Systems by Stepwise Phage Selection of a Combinatorial Single-Domain Antibody Library

Création de systèmes de dimerisation des protéines hautement spécifiques induits par des produits chimiques par stepwise Phage Selection of a Combinatorial Single-Domain Un-Domain Un-Domain Un-Domain Body Library

Protein dimerization events that occur only in the presence of a small-molecule ligand enable the development of small-molecule biosensors for the ...

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Gene transcription is an essential process in cell biology, and allows cells to interpret and respond to internal and external cues. Traditional bulk ...