Name: selection of transporter-targeted inhibitory nanobodies by solid-supported-membrane (ssm)-based electrophysiology
Uploaded: 2021-05-03T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Selection of Transporter-Targeted Inhibitory Nanobodies by Solid-Supported-Membrane SSM-Based Electrophysiology at JoVE.com

אנו מודים סדריק א.ג. הוטר ומרקוס א. סיגר מהמכון למיקרוביולוגיה רפואית באוניברסיטת ציריך, ולגונזלו קברו מ-Biozentrum מאוניברסיטת באזל על שיתוף פעולה בדור הננו-בודיות הסינתטיות (sybodies). אנו מודים למריה ברתמס ואנדרה בזון מ-NANION Technologies על הסיוע הטכני. עבודה זו נתמכה על ידי הקרן הלאומית השוויצרית למדע (SNSF) (יוזמת מענק המחקר PP00P3_170607 ו-NANION ל- C.P.).

1. שחזור חלבון ממברנה
<ol><li>מערבבים 3 מ"ל של שומנים קוטביים E. coli עם 1 מ"ל של פוספטידילכולין בבקבוקון תחתון עגול מתחת למכסה המנוע מאוורר.</li>
	<li>יבש את תערובת השומנים במשך 20 דקות תחת ואקום באמצעות מאייד סיבובי ואמבט מים ב 37 °C (50 °F) כדי להסיר כלורופורם. במידת הצורך, יבש עוד יותר תחת חנקן או גז ?...

<ol>
	<li>Braden, B. C., Goldman, E. R., Mariuzza, R. A., Poljak, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomy+an+antibody+molecule:+structure,+kinetics,+thermodynamics,+and+mutational+studies+of+the+antilysozyme+antibody+D1.3.">Anatomy an antibody molecule: structure, kinetics, thermodynamics, and mutational studies of the antilysozyme antibody D1.3.</a> Immunology Reviews. 163, 45-57 (1998).</li><li>Hamers-Casterman, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Naturally+occurring+antibodies+devoid+of+light+chains.">Naturally occurring antibodies devoid of light chains.</a> Nature. 363, 446-448 (1993).</li><li>Perez, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+of+inhibition+of+lipid-linked+oligosaccharide+flippase+PglK+by+a+conformational+nanobody.">Structural basis of inhibition of lipid-linked oligosaccharide flippase PglK by a conformational nanobody.</a> Science Reports. 7, 46641 (2017).</li><li>Grahl, A., Abiko, L. A., Isogai, S., Sharpe, T., Grzesiek, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-resolution+description+of+beta1-adrenergic+receptor+functional+dynamics+and+allosteric+coupling+from+backbone+NMR.">A high-resolution description of beta1-adrenergic receptor functional dynamics and allosteric coupling from backbone NMR.</a> Nature Communication. 11, 2216 (2020).</li><li>Schenck, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+and+characterization+of+anti-VGLUT+nanobodies+acting+as+inhibitors+of+transport.">Generation and characterization of anti-VGLUT nanobodies acting as inhibitors of transport.</a> Biochemistry. 56, 3962-3971 (2017).</li><li>Mireku, S. A., Sauer, M. M., Glockshuber, R., Locher, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+of+nanobody-mediated+blocking+of+BtuF,+the+cognate+substrate-binding+protein+of+the+Escherichia+coli+vitamin+B12+transporter+BtuCD.">Structural basis of nanobody-mediated blocking of BtuF, the cognate substrate-binding protein of the Escherichia coli vitamin B12 transporter BtuCD.</a> Science Reports. 7, 14296 (2017).</li><li>Manglik, A., Kobilka, B. K., Steyaert, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanobodies+to+study+G+protein-coupled+receptor+structure+and+function.">Nanobodies to study G protein-coupled receptor structure and function.</a> Annual Reviews of Pharmacology Toxicology. 57, 19-37 (2017).</li><li>Rasmussen, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+a+nanobody-stabilized+active+state+of+the+beta(2)+adrenoceptor.">Structure of a nanobody-stabilized active state of the beta(2) adrenoceptor.</a> Nature. 469 (2), 175-180 (2011).</li><li>Jiang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+a+LacY-nanobody+complex+in+a+periplasmic-open+conformation.">Crystal structure of a LacY-nanobody complex in a periplasmic-open conformation.</a> Proceeding of the National Academy of Science U. S. A. 113, 12420-12425 (2016).</li><li>Geertsma, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+a+prokaryotic+fumarate+transporter+reveals+the+architecture+of+the+SLC26+family.">Structure of a prokaryotic fumarate transporter reveals the architecture of the SLC26 family.</a> Nature Structural Molecular Biology. 22, 803-808 (2015).</li><li>Harmsen, M. M., De Haard, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Properties,+production,+and+applications+of+camelid+single-domain+antibody+fragments.">Properties, production, and applications of camelid single-domain antibody fragments.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 77, 13-22 (2007).</li><li>Pardon, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+general+protocol+for+the+generation+of+nanobodies+for+structural+biology.">A general protocol for the generation of nanobodies for structural biology.</a> Nature Protocols. 9, 674-693 (2014).</li><li>Nguyen, V. K., Desmyter, A., Muyldermans, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+heavy-chain+antibodies+in+Camelidae.">Functional heavy-chain antibodies in Camelidae.</a> Advances in Immunology. 79, 261-296 (2001).</li><li>Zimmermann, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+single+domain+antibodies+for+the+conformational+trapping+of+membrane+proteins.">Synthetic single domain antibodies for the conformational trapping of membrane proteins.</a> Elife. 7, 34317 (2018).</li><li>McMahon, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+surface+display+platform+for+rapid+discovery+of+conformationally+selective+nanobodies.">Yeast surface display platform for rapid discovery of conformationally selective nanobodies.</a> Nature Structural Molecular Biology. 25, 289-296 (2018).</li><li>Olichon, A., de Marco, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+a+naive+library+of+camelid+single+domain+antibodies.">Preparation of a naive library of camelid single domain antibodies.</a> Methods in Molecular Biology. 911, 65-78 (2012).</li><li>Moutel, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NaLi-H1:+A+universal+synthetic+library+of+humanized+nanobodies+providing+highly+functional+antibodies+and+intrabodies.">NaLi-H1: A universal synthetic library of humanized nanobodies providing highly functional antibodies and intrabodies.</a> Elife. 5, 16228 (2016).</li><li>Yan, J., Li, G., Hu, Y., Ou, W., Wan, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+of+a+synthetic+phage-displayed+nanobody+library+with+CDR3+regions+randomized+by+trinucleotide+cassettes+for+diagnostic+applications.">Construction of a synthetic phage-displayed nanobody library with CDR3 regions randomized by trinucleotide cassettes for diagnostic applications.</a> Journal of Translational Medicine. 12, 343 (2014).</li><li>Sabir, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+of+naive+camelids+VHH+repertoire+in+phage+display-based+library.">Construction of naive camelids VHH repertoire in phage display-based library.</a> Comptes Rendus Biologies. 337, 244-249 (2014).</li><li>Yau, K. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selection+of+hapten-specific+single-domain+antibodies+from+a+non-immunized+llama+ribosome+display+library.">Selection of hapten-specific single-domain antibodies from a non-immunized llama ribosome display library.</a> Journal of Immunology Methods. 281, 161-175 (2003).</li><li>vander Linden, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+physical+chemical+properties+of+llama+VHH+antibody+fragments+and+mouse+monoclonal+antibodies.">Comparison of physical chemical properties of llama VHH antibody fragments and mouse monoclonal antibodies.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1431, 37-46 (1999).</li><li>Dumoulin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-domain+antibody+fragments+with+high+conformational+stability.">Single-domain antibody fragments with high conformational stability.</a> Protein Science. 11, 500-515 (2002).</li><li>Iezzi, M. E., Policastro, L., Werbajh, S., Podhajcer, O., Canziani, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-domain+antibodies+and+the+promise+of+modular+targeting+in+cancer+imaging+and+treatment.">Single-domain antibodies and the promise of modular targeting in cancer imaging and treatment.</a> Frontiers in Immunology. 9, 273 (2018).</li><li>Yu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanobodies+derived+from+camelids+represent+versatile+biomolecules+for+biomedical+applications.">Nanobodies derived from camelids represent versatile biomolecules for biomedical applications.</a> Biomaterials Science. 8, 3559-3573 (2020).</li><li>Jahnichen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CXCR4+nanobodies+(VHH-based+single+variable+domains)+potently+inhibit+chemotaxis+and+HIV-1+replication+and+mobilize+stem+cells.">CXCR4 nanobodies (VHH-based single variable domains) potently inhibit chemotaxis and HIV-1 replication and mobilize stem cells.</a> Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 107, 20565-20570 (2010).</li><li>Nguyen, V. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+type+VI+secretion+by+an+anti-TssM+llama+nanobody.">Inhibition of type VI secretion by an anti-TssM llama nanobody.</a> PLoS One. 10, 0122187 (2015).</li><li>Bazzone, A., Barthmes, M., Fendler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SSM-Based+Electrophysiology+for+Transporter+Research.">SSM-Based Electrophysiology for Transporter Research.</a> Methods in Enzymology. 594, 31-83 (2017).</li><li>Schulz, P., Garcia-Celma, J. J., Fendler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SSM-based+electrophysiology.">SSM-based electrophysiology.</a> Methods. 46, 97-103 (2008).</li><li>Barthmes, M., Liao, J., Jiang, Y., Bruggemann, A., Wahl-Schott, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophysiological+characterization+of+the+archaeal+transporter+NCX_Mj+using+solid+supported+membrane+technology.">Electrophysiological characterization of the archaeal transporter NCX_Mj using solid supported membrane technology.</a> Journal of General Physiology. 147, 485-496 (2016).</li><li>Watzke, N., Diekert, K., Obrdlik, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophysiology+of+respiratory+chain+complexes+and+the+ADP-ATP+exchanger+in+native+mitochondrial+membranes.">Electrophysiology of respiratory chain complexes and the ADP-ATP exchanger in native mitochondrial membranes.</a> Biochemistry. 49, 10308-10318 (2010).</li><li>Zuber, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetics+of+charge+translocation+in+the+passive+downhill+uptake+mode+of+the+Na+/H++antiporter+NhaA+of+Escherichia+coli.">Kinetics of charge translocation in the passive downhill uptake mode of the Na+/H+ antiporter NhaA of Escherichia coli.</a> Biochim Biophys Acta. 1709, 240-250 (2005).</li><li>Garcia-Celma, J. J., Smirnova, I. N., Kaback, H. R., Fendler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophysiological+characterization+of+LacY.">Electrophysiological characterization of LacY.</a> Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 106, 7373-7378 (2009).</li><li>Bazzone, A., Madej, M. G., Kaback, H. R., Fendler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=pH+regulation+of+electrogenic+sugar/H++symport+in+MFS+sugar+permeases.">pH regulation of electrogenic sugar/H+ symport in MFS sugar permeases.</a> PLoS One. 11, 0156392 (2016).</li><li>Williamson, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+two-lane+mechanism+for+selective+biological+ammonium+transport.">A two-lane mechanism for selective biological ammonium transport.</a> Elife. 9, 57183 (2020).</li><li>Mirandela, G. D., Tamburrino, G., Hoskisson, P. A., Zachariae, U., Javelle, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+lipid+environment+determines+the+activity+of+the+Escherichia+coli+ammonium+transporter+AmtB.">The lipid environment determines the activity of the Escherichia coli ammonium transporter AmtB.</a> FASEB Journal. 33, 1989-1999 (2019).</li><li>Kaplan, R. S., Pedersen, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+microgram+quantities+of+protein+in+the+presence+of+milligram+levels+of+lipid+with+amido+black+10B.">Determination of microgram quantities of protein in the presence of milligram levels of lipid with amido black 10B.</a> Annals of Biochemistry. 150, 97-104 (1985).</li><li>Kermani, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structural+basis+of+promiscuity+in+small+multidrug+resistance+transporters.">The structural basis of promiscuity in small multidrug resistance transporters.</a> Nature Communication. 11, 6064 (2020).</li><li>Weitz, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+and+structural+characterization+of+a+prokaryotic+peptide+transporter+with+features+similar+to+mammalian+PEPT1.">Functional and structural characterization of a prokaryotic peptide transporter with features similar to mammalian PEPT1.</a> Journal of Biological Chemistry. 282, 2832-2839 (2007).</li></ol>

הטכניקה המוצגת כאן מסווגת ננו-ביגודיות עם תכונות מעכבות ולא מעכבות המתמקדות במשגרים אלקטרוגניים. הערכת הובלת המצע אפשרית בשל זיהוי תנועת המטענים באמצעות המשגר המוטמע בקרום הפרוטאוליפוזומים. חלק מהצעדים הקריטיים במהלך ההתקנה של ניסוי הם שחזור של חלבון פעיל בליפוזומים, הכנת monolayers יציב על...

הנוגדנים מורכבים משתי שרשראות כבדות זהות ושתי שרשראות אור האחראיות על כריכת האנטיגן. לקמלים יש נוגדנים בעלי שרשרת כבדה בלבד שמפגינים זיקה דומה לאנטיגן הקוגנייט שלהם בהשוואה לנוגדנים קונבנציונליים1,2. התחום המשתנה היחיד (VHH) של נוגדנים כבדי שרשרת בלבד שומר על הפוטנציאל המלא של איגוד האנטיגן והוכח כיציב מאוד1,2. מולקולות VHH מבודדות אלה או "ננו-בודים" יושמו במחקרים הקשורים לביוכימיה של חלבוני ממברנה ככלים לייצוב קונפורמציות3,4, כמעכבים5,6, כסוכני ייצוב7, וכקאדג'טים לקביעת מבנה8,9,10 . Nanobodies יכול להיווצר על ידי חיסון של camelids עבור טרום העשרה של תאי B המקודדים ננו-בודים ספציפיים למטרה ובידוד לאחר מכן של תאי B, ואחריו שיבוט של ספריית nanobody ובחירה על ידי תצוגת פאג'11,12,13. דרך חלופית ליצירת ננו-ביגודים מבוססת על שיטות בחירה במבחנה הנשענות על בניית ספריות ובחירה על ידי תצוגת פאג ', תצוגת ריבוזום או תצוגת שמרים14,15,16,17,18,19,20. שיטות הפריה חוץ גופית אלה דורשות גדלי ספרייה גדולים אך נהנות מהימנעות מחיסון בעלי חיים ומעדיפים את בחירת הננו-ביגודים המתמקדים בחלבונים ביציבות נמוכה יחסית.
הגודל הקטן של nanobodies, היציבות הגבוהה שלהם מסיסות, זיקה אנטיגן חזקה, אימונוגניות נמוכה, וייצור קל יחסית, להפוך אותם מועמדים חזקים לפיתוח של טיפולי21,22,23. בפרט, nanobodies המעכב את הפעילות של חלבונים ממברנה מרובים הם נכסים פוטנציאליים עבור יישומים קליניים5,24,25,26. במקרה של מובילי ממברנה, כדי להעריך אם לננו-גוף יש פעילות מעכבת, יש צורך לפתח בבדיקה המאפשרת זיהוי של מצעים מועברים ו/או מצעים משותפים. בדיקות כאלה כרוכות בדרך כלל במולקולות מסומנות או בעיצוב שיטות זיהוי ספציפיות למצע, אשר עשויות להיות חסרות יישום אוניברסלי. יתר על כן, זיהוי של nanobodies מעכב בדרך כלל דורש הקרנה של מספר גדול של קלסרים. לכן, שיטה שניתן להשתמש בה במצב תפוקה גבוהה ואינה מסתמכת על מצעים מסומנים חיונית לבחירה זו.
אלקטרופיזיולוגיה מבוססת SSM היא טכניקה רגישה ביותר, פתורה מאוד זמן המאפשר זיהוי של תנועה של מטענים על פני ממברנות (למשל, יונים מחייב / הובלה)27,28. טכניקה זו יושמה כדי לאפיין מובילים אלקטרוגניים, אשר קשה ללמוד באמצעות טכניקות אלקטרופיזיולוגיות אחרות בשל המחזור הנמוך יחסית של חלבונים אלה29,30,31,32,33,34,35. אלקטרופיזיולוגיה SSM אינה דורשת שימוש במצעים מסומנים, היא מתאימה להקרנה בתפוקה גבוהה, וניתן להשתמש בפרוטואוליפוזומים או בשלל ממברנה המכיל את המשגר של עניין. כאן, אנו מדגימים כי אלקטרופיזיולוגיה מבוססת SSM יכולה לשמש כדי לסווג ננו-בודיות ממוקדות טרנספורטר עם תכונות מעכבות ולא מעכבות. כהוכחה לעקרון, אנו מתארים את השיקום של טרנספורטר כולין חיידקי לליפוזומים, ואחריו צעדים מפורטים לשתקת פרוטאוליפוזומים בחיישני SSM. לאחר מכן אנו מתארים כיצד לבצע מדידות אלקטרופיזיולוגיות מבוססות SSM של הובלת כולין וכיצד לקבוע את הריכוז האפקטיבי למחצה (EC50). לאחר מכן אנו מראים כיצד להשתמש באלקטרופיזיולוגיה מבוססת SSM כדי לסנן ננו-בודיות מרובות ולזהות מעכבים של הובלת כולין. לבסוף, אנו מתארים כיצד לקבוע את ריכוזי המעכבים המקסימליים למחצה (IC50) של ננו-בודיות מעכבות נבחרות.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1-octadecanethiol solution</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>O1858-25ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2-diphytanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850356C-25mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-Beads SM-2 Adsorbent (Polystyrene adsorbent beads)</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>#152-3920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PD 10 Desalting Columns</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>GE17-0851-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter 200 nm membrane</td>
			<td>Whatman Nucleopore</td>
			<td>WHA800282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Propanol</td>
			<td>Merck</td>
			<td>33539-1L-R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Decane</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>8034051000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-dodecyl-&#223;-D-maltoside (DDM)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850520P-25g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>131659.1211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(SSM setup) SURFE2R N1</td>
			<td>Nanion</td>
			<td>-----</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SURFE2R N1 Single Sensor Chips</td>
			<td>Nanion</td>
			<td># 161001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma Base</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T1503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli Polar Lipid Extract</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>100600C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Egg PC L-&#945;-phosphatidylcholine </td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>840051C</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

selection of transporter-targeted inhibitory nanobodies by solid-supported-membrane (ssm)-based electrophysiology

נוגדנים חד-תחומיים (ננו-בודים) שימשו בהרחבה במחקרים מכניים ומבניים של חלבונים והם מהווים פוטנציאל עצום ככלים לפיתוח טיפולים קליניים, שרבים מהם תלויים בעיכוב חלבונים ממברנים כגון מובילים. עם זאת, רוב השיטות המשמשות לקביעת עיכוב פעילות התחבורה קשה לבצע בשגרות תפוקה גבוהה ותלויים בזמינות מצעים מסומנים ובכך לסבך את ההקרנה של ספריות ננו-גוף גדולות. אלקטרופיזיולוגיה של ממברנה מוצקה (SSM) היא שיטה בעלת תפוקה גבוהה, המשמשת לאפיון מובילים אלקטרוגניים ולמדידת קינטיקה ועיכוב ההובלה שלהם. כאן אנו מראים את היישום של אלקטרופיזיולוגיה מבוססת SSM כדי לבחור ננו-בודיות מעכבות ולא מעכבות המתמקדות במשגר משני אלקטרוגני ולחשב קבועים מעכבי ננו-בונים. טכניקה זו עשויה להיות שימושית במיוחד לבחירת ננו-בומניות מעכבות המתמקדות במשגרים שעבורם מצעים מסומנים אינם זמינים.

אלקטרופיזיולוגיה מבוססת SSM שימשה בהרחבה לאפיון של מובילים אלקטרוגניים. בפרוטוקול המוצג כאן, אנו מראים כיצד להשתמש באלקטרופיזיולוגיה מבוססת SSM כדי לסווג ננו-בודיות המתמקדות במשגר משני (כאן סימפורטר כולין חיידקי) בהתבסס על תכונותיהם המעכבות והלא מעכבות. אחת התכונות השימושיות ביותר של טכני...

Watch this Scientific Journal Video about Selection of Transporter-Targeted Inhibitory Nanobodies by Solid-Supported-Membrane SSM-Based Electrophysiology at JoVE.com

Selection of Transporter-Targeted Inhibitory Nanobodies by Solid-Supported-Membrane SSM-Based Electrophysiology

ננו-בודים הם כלים חשובים בביולוגיה מבנית ומהווים פוטנציאל גדול להתפתחות של מטיפולים. עם זאת, הבחירה של nanobodies עם תכונות מעכבות יכול להיות מאתגר. כאן אנו מדגימים את השימוש באלקטרופיזיולוגיה מבוססת ממברנה מוצקה (SSM) לסיווג של ננו-בודיות מעכבות ולא מעכבות המתמקדות במשגרי ממברנות אלקטרוגניות.

מבחר ננו-בודיות מעכבות ממוקדות טרנספורטר על-ידי אלקטרופיזיולוגיה מבוססת ממברנה מוצקה (SSM)

Single domain antibodies (nanobodies) have been extensively used in mechanistic and structural studies of proteins and they pose an enormous potential as ...

הפרוטוקול המוצג משמש לבדיקה וזיהוי של ננו-בודיות מעכבות ולא מעכבות המתמקדות במשגרים אלקטרוגניים המשוחזרים בפרוטוליפוזומים או נמצאים בשלפוחיות ממברנה. עיצוב עבירות יכול להיות קשה במקרים מרובים, במיוחד אם מצעים מסומנים אינם זמינים. אם אותה אלקטרופיזיולוגיה מאפשרת לחקור את ההשפעה של ננו-בודיות על ההובלה עבור כמעט כל משגר אלקטרוגני, מכיוון שאלקטרופיזיולוגיה של SSM אינה דורשת מצעים מסומנים.ננו-בונים נחקרו על השימוש בהם ביישומים רפואיים. טכניקה זו יכולה לעזור לסנן מעכבים פוטנציאליים מיקוד מובילים אלקטרוגניים ספציפיים של בני אדם או פתוגנים אנושיים. כדי להתחיל, לקחת 10 צינורות נקיים ולהעביר 10 מיליליטר של קרום מוצק הנתמך ללא הפעלה, או SSM, חוצץ לתוך כל צינור.כדי להכין את מאגרי SSM הפעלת, להוסיף את המצע לתוך הצינורות באמצעות סדרה של ריכוזים סביב הריכוז המקסימלי חצי הצפוי. הפעל את תוכנת ה- SSM ותן למחשב לאתחל באופן אוטומטי. הגדר את נתיב השמירה עבור נתונים.אשר על-ידי לחיצה על לחצן אישור. בחר את פרוטוקול הניקוי ההתחלתי הרגיל באפשרויות זרימת העבודה ולחץ על הפעל. לאחר מכן, הר את השבב מצופה פרוטאוליפום על השקע.תזיז את הזרוע כדי לנעול את השבב. הקף את השבב הרכוב עם המכסה. בחר את התוכנית CapCom בזרימת העבודה, ותן לה לפעול כדי לקבוע את המוליכות והקיבות.אשר כי המוליכות היא מתחת לחמישה ננומינים ואת הקיבול הוא בין 15 ל 35 nanofarad לפני השימוש בו למדידה. העבר את פתרונות ההפעלה לבקבוקונים ומיקם את המאגרים בסמפלר הבדיקה. מעבירים את המאגר הלא-הפעלה למאגר ומניחים אותו ליד מחזיק השבב בעמדת המאגר מימין.צור פרוטוקול עבור זרימת העבודה באמצעות רצף של רצף פתרונות לא מופעל, הפעלה ולא מופעל, או רצף BAB, בלולאה המבצעת שלוש מדידות ועוברת למאגר ההפעלה הבא עבור כל 10 המאגרים. השתמש בקצב הזרימה המוגדר כברירת מחדל של 200 מיקרוליטרים לשניה עם שנייה אחת, שנייה אחת, שנייה אחת פעמים זרימה עבור רצף ה- BAB ולחץ על הפעל כדי להתחיל את המדידה. שמור את הפרוטוקול ותן לזרימת העבודה לפעול על-ידי לחיצה על לחצן ההפעלה.לאחר מכן בצעו את אותו ניסוי באמצעות ליפוזומים נטולי חלבונים. השתמש בכל תוכנה מועדפת לניתוח נתונים כדי להתוות את הזרם הנמדד לעומת הזמן ולהשתמש בפונקציה להערכת גובה שיא בטווח התוספת של המאגר המפעיל. התווה את זרם השיא נגד ריכוז המצע כדי לקבוע את ההשפעה המקסימלית למחצה של ריכוז, או EC50, של המצע באמצעות רגרסיה לא ליניארית.העבר 50 מיליליטר של חוצץ SSM לאפעיל לתוך צינור נקי. הוסף את כולין המצע לריכוז הסופי של חמישה מילימולר ולהשתמש בו למדידת שליטה חיובית. העבר 10 מיליליטר של חוצץ SSM שאינו מפעיל לתוך צינור נקי.הוסף כולין מצע ל 5 מילימולר וננו-גוף לריכוז הסופי 500 ננומולר. חזור על השלב עבור כל ננו כדי להכין את פתרונות ההפעלה כפי שהודגם. הפעל את מכונת SSM ולמדוד את הקיבול והמוליכות של השבב מצופה פרוטאוליפום, כפי שהודגם קודם לכן.העבר את פתרון ההפעלה ללא גוף ננו לתוך נביון ומניחים את המאגר בסמפלר הבדיקה. העבר את המאגר הלא-אקטיבי ללא גוף ננו למאגר ומיקם אותו בסמפלר הבדיקה. לאחר מכן חזור על תהליך זה עבור כל הפתרונות המכילים ננו-בומני עם פתרון הפעלה ולא הפעלה.צור פרוטוקול עבור זרימת העבודה באמצעות רצף BAB. צור לולאה המבצעת שלוש מדידות של רצף BAB באמצעות מאגרים ללא ננו-בודיות, שתי מדידות של רצף ה- BAB עם מאגרים המכילים ננו-גוף, דגירה של זמן עיכוב של 120 שניות עם הננו-גוף, ושלוש מדידות של רצף ה- BAB עם מאגרים המכילים את הננו- גוף. שמור את זרימת העבודה ותן לה לפעול על-ידי לחיצה על לחצן ההפעלה.לאחר מכן, צור פרוטוקול חדש עבור זרימת העבודה באמצעות רצף BAB ולולאה של חמש מדידות כדי לשטוף את גוף nano קשור באופן הפיך. שמור את זרימת העבודה ותן לה לפעול על-ידי לחיצה על לחצן ההפעלה. השווה את זרם השיא האחרון של המדידות למדידה הראשונית של המצע בלבד.אם זרם השיא מגיע לערך ההתחלתי, הננו-גוף נשטף בהצלחה והתנאים ההתחלתיים נוצרו מחדש. אחרת, חזור על זרימת העבודה או שנה לשבב חדש. חזור על תהליך זה באמצעות שבבים בודדים עבור כל מסך nanobody, או חזור עם nanobodies מרובים באמצעות אותו שבב.השתמש בכל תוכנה מועדפת לניתוח נתונים כדי להתוות את הזרם הנמדד לעומת הזמן. לאחר מכן התוכנה בוחרת באופן אוטומטי את הפונקציה להערכת גובה שיא בטווח של התוספת של מאגר ההפעלה. לנרמל את זרם השיא ואת נוכחותו של nanobody בהתבסס על המדידה מצע ההליך בלבד.התווה את זרמי השיא בהיסטוגרמה והשווה את זרמי השיא של מדידות המצע בלבד לזרמי השיא הנמדדים בנוכחות ננו-בוז כדי לזהות ננו-בומניות מעכבות. העבר 50 מיליליטר של חוצץ SSM nonactivating לתוך צינור נקי ולהוסיף את כולין המצע לריכוז הסופי של חמישה מילימולרים, ולהשתמש בזה כפתרון ההפעלה לשליטה חיובית. הוסף חמישה מיליליטר של הפתרון הלא מעשי לשמונה צינורות נקיים, ולאחר מכן להוסיף כולין מצע ו nanobody מעכב לצינורות בריכוזים בטווח IC50 הצפוי.הוסף 10 מיליליטר של הפתרון הלא מעשי לשמונה הצינורות והוסף ננו-גוף מעכב לכל צינור המתאים למאגר אי-הפעילות. התחל את הגדרת SSM ומדוד את הקיבול והמוליכות של השבב מצופה פרוטאוליפוזום. העבר את פתרון ההפעלה ללא גוף ננו לתוך נביון ומניחים אותו בסמפלר הבדיקה.לאחר מכן העבר את המאגר הלא-הפעלה ללא גוף ננו למאגר והצב אותו בעמדת המאגר ליד מחזיק השבב מימין. העבר את פתרונות ההפעלה והלא-הפעלה המכילים ננו-בונים לבקבוקונים ומיקם את המאגרים בסמפלר הבדיקה. צור פרוטוקול עבור זרימת העבודה באמצעות רצף BAB.כלול לולאה כדי למדוד כל ריכוז פעמיים, דגירה במשך 120 שניות ולמדוד שלוש פעמים נוספות. השתמש בכל תוכנה מועדפת לניתוח נתונים כדי להתוות את הזרם הנמדד לעומת הזמן ולבחור את הפונקציה להערכת גובה השיא בטווח התוספת של מאגר ההפעלה. התווה את זרמי השיא נגד ריכוז nanobody כדי לקבוע את IC50 באמצעות רגרסיה לא ליניארית.לקביעת ריכוז המצע שישמש במהלך הקרנה של ננו-ביגודיות, הובלה אלקטרוגנית נמדדה בריכוזים מצע שונים כדי לקבוע EC50. ריכוז מצע המתאים לתנאי רוויה, חמישה מילימולר, נבחר ונשמר קבוע בכל המאגרים המפעילים. ההשפעה של ננו-בומני מעכבות על הובלה אלקטרוגנית הוצגה מהירידה במשרעת של זרמי השיא.לאחר הפעלת פרוטוקול הכביסה כדי לאפשר ננו-גוף unbinding, התאוששות של 80 עד 95% של משרעת זרם השיא הראשוני נצפתה. בעת מעבר מתנאים לא פעילות להפעלת, לא זרמי חפץ משמעותיים הוצגו על ידי ננו-בודיות הקיימות במאגרים אלה. לאחר בחירת ננו-בודיות עם תכונות מעכבות, נקבעו ערכי IC50 עבור ננו-בודיות בודדות.זה חיוני כדי לתת מספיק זמן לכיול של proteoliposomes על השבב עם המאגר המכיל את nanobody. מאז הכריכה היא הפיכה, nanobody צריך להיות נוכח הן הפעלה ולא הפעלת מאגרים.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Selection of Transporter-Targeted Inhibitory Nanobodies by Solid-Supported-Membrane (SSM)-Based Electrophysiology

Real-time Tracking of DNA Fragment Separation by Smartphone

מעקב בזמן אמת של הפרדת ה- DNA הפרדה על ידי הטלפון החכם

Slab gel electrophoresis (SGE) is the most common method for the separation of DNA fragments; thus, it is broadly applied to the field of biology and ...

Single-molecule Manipulation of G-quadruplexes by Magnetic Tweezers

מולקולה בודדת מניפולציה של G-quadruplexes על ידי פינצטה מגנטי

Non-canonical nucleic acid secondary structure G-quadruplexes (G4) are involved in diverse cellular processes, such as DNA replication, transcription, RNA ...

Genome-wide Quantification of Translation in Budding Yeast by Ribosome Profiling

הגנום כולו כימות של תרגום ניצני שמרים על-ידי יצירת פרופיל ריבוזום

Translation of mRNA into proteins is a complex process involving several layers of regulation. It is often assumed that changes in mRNA transcription ...

Formation of Covalent DNA Adducts by Enzymatically Activated Carcinogens and Drugs In Vitro and Their Determination by 32P-postlabeling

Formation of Covalent DNA Adducts by Enzymatically Activated Carcinogens and Drugs In Vitro and Their Determination by 32P-postlabeling

היווצרות קשרי ערכיות דנ א Adducts על ידי חומרים מסרטנים Enzymatically מופעל, סמים במבחנה ונחישות שלהם על ידי 32P-postlabeling

Covalent DNA adducts formed by chemicals or drugs with carcinogenic potency are judged as one of the most important factors in the initiation phase of ...

Analysis of Endocytic Uptake and Retrograde Transport to the Trans-Golgi Network Using Functionalized Nanobodies in Cultured Cells

ניתוח של ספיגת Endocytic ותעבורה רטרוגרדית לרשת הטרנס-גולג'י באמצעות Functionalized Nanobodies בתאים בתרבית

Transport of proteins and membranes from the cell surface to the Golgi and beyond is essential for homeostasis, organelle identity and physiology. To ...

Imaging of Extracellular Vesicles by Atomic Force Microscopy

הדמיה של שלפוחיות ומסחטות על ידי מיקרוסקופ כוח אטומי

Exosomes and other extracellular vesicles (EVs) are molecular complexes consisting of a lipid membrane vesicle, its surface decoration by membrane ...

Nitropeptide Profiling and Identification Illustrated by Angiotensin II

ניטרופפטיד פרופיל וזיהוי מאויר על ידי אנגיוטנסין השני

Protein nitration is one of the most important post-translational modifications (PTM) on tyrosine residues and it can be induced by chemical actions of ...

Interactions with and Membrane Permeabilization of Brain Mitochondria by Amyloid Fibrils

אינטראקציות עם חדירות ממברנה של המיטותית המוח על ידי עמילואיד Fibrils

A growing body of evidence indicates that membrane permeabilization, including internal membranes such as mitochondria, is a common feature and primary ...

Creating Highly Specific Chemically Induced Protein Dimerization Systems by Stepwise Phage Selection of a Combinatorial Single-Domain Antibody Library

יצירת חלבון מאוד ספציפי הנגרמת כימית מערכות דימריזציה על ידי בחירת בחירה באמצעות מבחר של קומבינטורית מתחם יחיד בספריית הנוגדן

Protein dimerization events that occur only in the presence of a small-molecule ligand enable the development of small-molecule biosensors for the ...

Rapid Determination of Antibody-Antigen Affinity by Mass Photometry

נחישות מהירה של זיקה נוגדנים אנטיגן על ידי פוטומטריה המונית

Measurements of the specificity and affinity of antigen-antibody interactions are critically important for medical and research applications. In this ...