Name: selection of transporter-targeted inhibitory nanobodies by solid-supported-membrane (ssm)-based electrophysiology
Uploaded: 2021-05-03T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Selection of Transporter-Targeted Inhibitory Nanobodies by Solid-Supported-Membrane SSM-Based Electrophysiology at JoVE.com

Мы благодарим Седрика А. Хуттера и Маркуса А. Сигера из Института медицинской микробиологии Цюрихского университета и Гонсало Чебреро из Biozentrum Базельского университета за сотрудничество в создании синтетических нанотел (сител). Мы благодарим Марию Бартмс и Андре Баззоне из NANION Technologies за техническую помощь. Эта работа была поддержана Швейцарским национальным научным фондом (SNSF) (PP00P3_170607 и NANION Research Grant Initiative to C.P.).

1. Восстановление мембранного белка
<ol><li>Смешайте 3 мл полярных липидов E. coli с 1 мл фосфатидилхолина в колбе с круглым дном под вентилируемым капюшоном.</li>
	<li>Высушите липидную смесь в течение 20 мин под вакуумом с помощью ротационного испарителя и водяной бани при 37 °C для удаления х?...

<ol>
	<li>Braden, B. C., Goldman, E. R., Mariuzza, R. A., Poljak, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomy+an+antibody+molecule:+structure,+kinetics,+thermodynamics,+and+mutational+studies+of+the+antilysozyme+antibody+D1.3.">Anatomy an antibody molecule: structure, kinetics, thermodynamics, and mutational studies of the antilysozyme antibody D1.3.</a> Immunology Reviews. 163, 45-57 (1998).</li><li>Hamers-Casterman, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Naturally+occurring+antibodies+devoid+of+light+chains.">Naturally occurring antibodies devoid of light chains.</a> Nature. 363, 446-448 (1993).</li><li>Perez, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+of+inhibition+of+lipid-linked+oligosaccharide+flippase+PglK+by+a+conformational+nanobody.">Structural basis of inhibition of lipid-linked oligosaccharide flippase PglK by a conformational nanobody.</a> Science Reports. 7, 46641 (2017).</li><li>Grahl, A., Abiko, L. A., Isogai, S., Sharpe, T., Grzesiek, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-resolution+description+of+beta1-adrenergic+receptor+functional+dynamics+and+allosteric+coupling+from+backbone+NMR.">A high-resolution description of beta1-adrenergic receptor functional dynamics and allosteric coupling from backbone NMR.</a> Nature Communication. 11, 2216 (2020).</li><li>Schenck, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+and+characterization+of+anti-VGLUT+nanobodies+acting+as+inhibitors+of+transport.">Generation and characterization of anti-VGLUT nanobodies acting as inhibitors of transport.</a> Biochemistry. 56, 3962-3971 (2017).</li><li>Mireku, S. A., Sauer, M. M., Glockshuber, R., Locher, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+of+nanobody-mediated+blocking+of+BtuF,+the+cognate+substrate-binding+protein+of+the+Escherichia+coli+vitamin+B12+transporter+BtuCD.">Structural basis of nanobody-mediated blocking of BtuF, the cognate substrate-binding protein of the Escherichia coli vitamin B12 transporter BtuCD.</a> Science Reports. 7, 14296 (2017).</li><li>Manglik, A., Kobilka, B. K., Steyaert, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanobodies+to+study+G+protein-coupled+receptor+structure+and+function.">Nanobodies to study G protein-coupled receptor structure and function.</a> Annual Reviews of Pharmacology Toxicology. 57, 19-37 (2017).</li><li>Rasmussen, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+a+nanobody-stabilized+active+state+of+the+beta(2)+adrenoceptor.">Structure of a nanobody-stabilized active state of the beta(2) adrenoceptor.</a> Nature. 469 (2), 175-180 (2011).</li><li>Jiang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+a+LacY-nanobody+complex+in+a+periplasmic-open+conformation.">Crystal structure of a LacY-nanobody complex in a periplasmic-open conformation.</a> Proceeding of the National Academy of Science U. S. A. 113, 12420-12425 (2016).</li><li>Geertsma, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+a+prokaryotic+fumarate+transporter+reveals+the+architecture+of+the+SLC26+family.">Structure of a prokaryotic fumarate transporter reveals the architecture of the SLC26 family.</a> Nature Structural Molecular Biology. 22, 803-808 (2015).</li><li>Harmsen, M. M., De Haard, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Properties,+production,+and+applications+of+camelid+single-domain+antibody+fragments.">Properties, production, and applications of camelid single-domain antibody fragments.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 77, 13-22 (2007).</li><li>Pardon, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+general+protocol+for+the+generation+of+nanobodies+for+structural+biology.">A general protocol for the generation of nanobodies for structural biology.</a> Nature Protocols. 9, 674-693 (2014).</li><li>Nguyen, V. K., Desmyter, A., Muyldermans, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+heavy-chain+antibodies+in+Camelidae.">Functional heavy-chain antibodies in Camelidae.</a> Advances in Immunology. 79, 261-296 (2001).</li><li>Zimmermann, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+single+domain+antibodies+for+the+conformational+trapping+of+membrane+proteins.">Synthetic single domain antibodies for the conformational trapping of membrane proteins.</a> Elife. 7, 34317 (2018).</li><li>McMahon, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+surface+display+platform+for+rapid+discovery+of+conformationally+selective+nanobodies.">Yeast surface display platform for rapid discovery of conformationally selective nanobodies.</a> Nature Structural Molecular Biology. 25, 289-296 (2018).</li><li>Olichon, A., de Marco, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+a+naive+library+of+camelid+single+domain+antibodies.">Preparation of a naive library of camelid single domain antibodies.</a> Methods in Molecular Biology. 911, 65-78 (2012).</li><li>Moutel, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NaLi-H1:+A+universal+synthetic+library+of+humanized+nanobodies+providing+highly+functional+antibodies+and+intrabodies.">NaLi-H1: A universal synthetic library of humanized nanobodies providing highly functional antibodies and intrabodies.</a> Elife. 5, 16228 (2016).</li><li>Yan, J., Li, G., Hu, Y., Ou, W., Wan, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+of+a+synthetic+phage-displayed+nanobody+library+with+CDR3+regions+randomized+by+trinucleotide+cassettes+for+diagnostic+applications.">Construction of a synthetic phage-displayed nanobody library with CDR3 regions randomized by trinucleotide cassettes for diagnostic applications.</a> Journal of Translational Medicine. 12, 343 (2014).</li><li>Sabir, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+of+naive+camelids+VHH+repertoire+in+phage+display-based+library.">Construction of naive camelids VHH repertoire in phage display-based library.</a> Comptes Rendus Biologies. 337, 244-249 (2014).</li><li>Yau, K. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selection+of+hapten-specific+single-domain+antibodies+from+a+non-immunized+llama+ribosome+display+library.">Selection of hapten-specific single-domain antibodies from a non-immunized llama ribosome display library.</a> Journal of Immunology Methods. 281, 161-175 (2003).</li><li>vander Linden, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+physical+chemical+properties+of+llama+VHH+antibody+fragments+and+mouse+monoclonal+antibodies.">Comparison of physical chemical properties of llama VHH antibody fragments and mouse monoclonal antibodies.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1431, 37-46 (1999).</li><li>Dumoulin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-domain+antibody+fragments+with+high+conformational+stability.">Single-domain antibody fragments with high conformational stability.</a> Protein Science. 11, 500-515 (2002).</li><li>Iezzi, M. E., Policastro, L., Werbajh, S., Podhajcer, O., Canziani, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-domain+antibodies+and+the+promise+of+modular+targeting+in+cancer+imaging+and+treatment.">Single-domain antibodies and the promise of modular targeting in cancer imaging and treatment.</a> Frontiers in Immunology. 9, 273 (2018).</li><li>Yu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanobodies+derived+from+camelids+represent+versatile+biomolecules+for+biomedical+applications.">Nanobodies derived from camelids represent versatile biomolecules for biomedical applications.</a> Biomaterials Science. 8, 3559-3573 (2020).</li><li>Jahnichen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CXCR4+nanobodies+(VHH-based+single+variable+domains)+potently+inhibit+chemotaxis+and+HIV-1+replication+and+mobilize+stem+cells.">CXCR4 nanobodies (VHH-based single variable domains) potently inhibit chemotaxis and HIV-1 replication and mobilize stem cells.</a> Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 107, 20565-20570 (2010).</li><li>Nguyen, V. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+type+VI+secretion+by+an+anti-TssM+llama+nanobody.">Inhibition of type VI secretion by an anti-TssM llama nanobody.</a> PLoS One. 10, 0122187 (2015).</li><li>Bazzone, A., Barthmes, M., Fendler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SSM-Based+Electrophysiology+for+Transporter+Research.">SSM-Based Electrophysiology for Transporter Research.</a> Methods in Enzymology. 594, 31-83 (2017).</li><li>Schulz, P., Garcia-Celma, J. J., Fendler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SSM-based+electrophysiology.">SSM-based electrophysiology.</a> Methods. 46, 97-103 (2008).</li><li>Barthmes, M., Liao, J., Jiang, Y., Bruggemann, A., Wahl-Schott, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophysiological+characterization+of+the+archaeal+transporter+NCX_Mj+using+solid+supported+membrane+technology.">Electrophysiological characterization of the archaeal transporter NCX_Mj using solid supported membrane technology.</a> Journal of General Physiology. 147, 485-496 (2016).</li><li>Watzke, N., Diekert, K., Obrdlik, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophysiology+of+respiratory+chain+complexes+and+the+ADP-ATP+exchanger+in+native+mitochondrial+membranes.">Electrophysiology of respiratory chain complexes and the ADP-ATP exchanger in native mitochondrial membranes.</a> Biochemistry. 49, 10308-10318 (2010).</li><li>Zuber, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetics+of+charge+translocation+in+the+passive+downhill+uptake+mode+of+the+Na+/H++antiporter+NhaA+of+Escherichia+coli.">Kinetics of charge translocation in the passive downhill uptake mode of the Na+/H+ antiporter NhaA of Escherichia coli.</a> Biochim Biophys Acta. 1709, 240-250 (2005).</li><li>Garcia-Celma, J. J., Smirnova, I. N., Kaback, H. R., Fendler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophysiological+characterization+of+LacY.">Electrophysiological characterization of LacY.</a> Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 106, 7373-7378 (2009).</li><li>Bazzone, A., Madej, M. G., Kaback, H. R., Fendler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=pH+regulation+of+electrogenic+sugar/H++symport+in+MFS+sugar+permeases.">pH regulation of electrogenic sugar/H+ symport in MFS sugar permeases.</a> PLoS One. 11, 0156392 (2016).</li><li>Williamson, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+two-lane+mechanism+for+selective+biological+ammonium+transport.">A two-lane mechanism for selective biological ammonium transport.</a> Elife. 9, 57183 (2020).</li><li>Mirandela, G. D., Tamburrino, G., Hoskisson, P. A., Zachariae, U., Javelle, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+lipid+environment+determines+the+activity+of+the+Escherichia+coli+ammonium+transporter+AmtB.">The lipid environment determines the activity of the Escherichia coli ammonium transporter AmtB.</a> FASEB Journal. 33, 1989-1999 (2019).</li><li>Kaplan, R. S., Pedersen, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+microgram+quantities+of+protein+in+the+presence+of+milligram+levels+of+lipid+with+amido+black+10B.">Determination of microgram quantities of protein in the presence of milligram levels of lipid with amido black 10B.</a> Annals of Biochemistry. 150, 97-104 (1985).</li><li>Kermani, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structural+basis+of+promiscuity+in+small+multidrug+resistance+transporters.">The structural basis of promiscuity in small multidrug resistance transporters.</a> Nature Communication. 11, 6064 (2020).</li><li>Weitz, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+and+structural+characterization+of+a+prokaryotic+peptide+transporter+with+features+similar+to+mammalian+PEPT1.">Functional and structural characterization of a prokaryotic peptide transporter with features similar to mammalian PEPT1.</a> Journal of Biological Chemistry. 282, 2832-2839 (2007).</li></ol>

Метод, представленный здесь, классифицирует нанотела с ингибирующими и неингибирующими свойствами, нацеленными на электрогенные транспортеры. Оценка переноса субстрата возможна за счет обнаружения движения зарядов через транспортер, встроенный в мембрану протеолипосом. Некоторые и...

Антитела состоят из двух одинаковых тяжелых цепей и двух легких цепей, которые отвечают за связывание антигена. Верблюды имеют только тяжелоцепочечные антитела, которые проявляют аналогичное сродство к их родственному антигену по сравнению с обычными антителами1,2. Однопеременный домен (VHH) антител только с тяжелой цепью сохраняет полный антигенсвязывающий потенциал и, как было показано, очень стабилен1,2. Эти изолированные молекулы VHH или «нанотела» были реализованы в исследованиях, связанных с биохимией мембранных белков, в качестве инструментов для стабилизации конформаций3,4,в качестве ингибиторов5,6,в качестве стабилизирующих агентов7и в качестве устройств для определения структуры8,9,10 . Нанотела могут быть получены путем иммунизации верблюдов для предварительного обогащения В-клеток, кодирующих целевые нанотела, и последующей изоляции В-клеток с последующим клонированием библиотеки нанотел и отбором фагового дисплея11,12,13. Альтернативный способ генерации нанотел основан на методах отбора in vitro, которые основаны на построении библиотек и выборе с помощью фагового дисплея, рибосомного дисплея или дрожжевого дисплея14,15,16,17,18,19,20. Эти методы in vitro требуют больших размеров библиотек, но выигрывают от избегания иммунизации животных и способствуют отбору нанотел, нацеленных на белки с относительно низкой стабильностью.
Небольшие размеры нанотел, их высокая стабильность и растворимость, сильное сродство антигенов, низкая иммуногенность и относительно легкая продукция, делают их сильными кандидатами для разработкитерапии 21,22,23. В частности, нанотела, ингибирующие активность множественных мембранных белков, являются потенциальными активами для клинических применений5,24,25,26. В случае мембранных транспортеров, чтобы оценить, обладает ли нанотело ингибирующей активностью, необходимо разработать анализ, который позволяет обнаруживать транспортируемые субстраты и/или сопутствующие субстраты. Такие анализы обычно включают меченые молекулы или разработку методов обнаружения, специфичных для субстрата, которые могут не иметь универсального применения. Кроме того, идентификация ингибирующих нанотел обычно требует скрининга большого количества связующих веществ. Таким образом, метод, который может быть использован в режиме высокой пропускной способности и который не полагается на меченые подложки, имеет важное значение для этого выбора.
Электрофизиология на основе SSM является чрезвычайно чувствительным методом с высоким временным разрешением, который позволяет обнаруживать движение зарядов по мембранам (например, связывание/перенос ионов)27,28. Данная методика была применена для характеристики электрогенных транспортеров, которые трудно изучить с помощью других методов электрофизиологии из-за относительно низкого оборота этих белков29,30,31,32,33,34,35. Электрофизиология SSM не требует использования меченых подложек, она подходит для высокопроизводительного скрининга, и могут использоваться либо протеолипосомы, либо мембранные везикулы, содержащие интересующий транспортер. Здесь мы демонстрируем, что электрофизиология на основе SSM может быть использована для классификации нанотел, нацеленных на транспортер, с ингибирующими и неингибирующими свойствами. В качестве доказательства принципа мы описываем восстановление бактериального холинового транспортера в липосомы с последующими подробными шагами по иммобилизации протеолипосом на датчиках SSM. Далее мы опишем, как выполнить электрофизиологические измерения переноса холина на основе SSM и как определить полумаксимальную эффективную концентрацию (EC50). Затем мы покажем, как использовать электрофизиологию на основе SSM для скрининга нескольких нанотел и идентификации ингибиторов транспорта холина. Наконец, мы описываем, как определить половину максимальных ингибирующих концентраций (IC50)выбранных ингибирующих нанотел.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1-octadecanethiol solution</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>O1858-25ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2-diphytanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850356C-25mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-Beads SM-2 Adsorbent (Polystyrene adsorbent beads)</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>#152-3920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PD 10 Desalting Columns</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>GE17-0851-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter 200 nm membrane</td>
			<td>Whatman Nucleopore</td>
			<td>WHA800282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Propanol</td>
			<td>Merck</td>
			<td>33539-1L-R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Decane</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>8034051000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-dodecyl-&#223;-D-maltoside (DDM)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850520P-25g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>131659.1211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(SSM setup) SURFE2R N1</td>
			<td>Nanion</td>
			<td>-----</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SURFE2R N1 Single Sensor Chips</td>
			<td>Nanion</td>
			<td># 161001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma Base</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T1503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli Polar Lipid Extract</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>100600C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Egg PC L-&#945;-phosphatidylcholine </td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>840051C</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

selection of transporter-targeted inhibitory nanobodies by solid-supported-membrane (ssm)-based electrophysiology

Однодоменные антитела (нанотела) широко используются в механистических и структурных исследованиях белков, и они представляют собой огромный потенциал в качестве инструментов для разработки клинических методов лечения, многие из которых зависят от ингибирования мембранных белков, таких как транспортеры. Однако большинство методов, используемых для определения ингибирования транспортной активности, трудно выполнить в процедурах с высокой пропускной способностью и зависят от наличия меченых подложек, что усложняет скрининг больших библиотек нанотел. Электрофизиология твердой мембраны (SSM) является высокопроизводительным методом, используемым для характеристики электрогенных транспортеров и измерения их кинетики транспорта и ингибирования. Здесь мы показываем реализацию электрофизиологии на основе SSM для выбора ингибирующих и неингибирующих нанотел, нацеленных на электрогенный вторичный транспортер, и для расчета ингибирующих констант нанотел. Этот метод может быть особенно полезен для выбора ингибирующих нанотел, нацеленных на транспортеры, для которых меченые субстраты недоступны.

Электрофизиология на основе SSM широко используется для характеристики электрогенных транспортеров. В протоколе, представленном здесь, мы показываем, как использовать электрофизиологию на основе SSM для классификации нанотел, нацеленных на вторичный транспортер (здесь бактериальный с?...

Watch this Scientific Journal Video about Selection of Transporter-Targeted Inhibitory Nanobodies by Solid-Supported-Membrane SSM-Based Electrophysiology at JoVE.com

Selection of Transporter-Targeted Inhibitory Nanobodies by Solid-Supported-Membrane SSM-Based Electrophysiology

Нанотела являются важными инструментами в структурной биологии и представляют большой потенциал для развития методов лечения. Однако выбор нанотел с ингибирующими свойствами может быть сложным. Здесь мы демонстрируем использование электрофизиологии на основе твердой поддерживаемой мембраны (SSM) для классификации ингибирующих и неингибирующих нанотел, нацеленных на электрогенные мембранные транспортеры.

Выбор ингибирующих нанотел, нацеленных на транспортер, с помощью электрофизиологии на основе твердой мембраны (SSM)

Single domain antibodies (nanobodies) have been extensively used in mechanistic and structural studies of proteins and they pose an enormous potential as ...

Представленный протокол используется для высокопроизводительного скрининга и идентификации ингибирующих и неингибирующих нанотел, нацеленных на электрогенные транспортеры, восстановленные в протеолипосомах или присутствующие в мембранных везикулах. Проектирование анализов переноса может быть затруднено в нескольких случаях, особенно если маркированные субстраты недоступны. Если та же электрофизиология позволяет изучать влияние нанотел на транспорт практически для любого электрогенного транспортера, то электрофизиология SSM не требует меченых подложек.Нанотела были исследованы для их использования в медицинских приложениях. Этот метод может помочь экранировать потенциальные ингибиторы, нацеленные на конкретные электрогенные транспортеры людей или патогены человека. Для начала возьмите 10 чистых трубок и переложите 10 миллилитров неактивирующей твердой мембраны, или SSM, буфера в каждую трубку.Чтобы подготовить активирующие буферы SSM, добавьте подложку в пробирки, используя ряд концентраций вокруг ожидаемой половинной максимальной концентрации. Запустите программное обеспечение SSM и позвольте машине инициализироваться автоматически. Задайте путь сохранения данных.Подтвердите, нажав кнопку OK. Выберите стандартный протокол начальной очистки в параметрах рабочего процесса и нажмите кнопку Выполнить. Затем установите чип с протеолипосомным покрытием на гнездо.Переместите руку, чтобы заблокировать чип. Заключите смонтированный чип в колпачок. Выберите программу CapCom в рабочем процессе, и дайте ей запуститься для определения проводимости и емкости.Подтвердите, что проводимость ниже пяти наносименов, а емкость составляет от 15 до 35 нанофарад, прежде чем использовать ее для измерения. Переложите активирующие растворы во флаконы и поместите буферы в пробоотборник. Переместите неактивирующийся буфер в резервуар и поместите его рядом с держателем чипа в положении резервуара справа.Создайте протокол для рабочего процесса, используя последовательность неактивирующих, активирующих и неактивирующихся последовательностей решений или последовательность BAB в цикле, который выполняет три измерения и переходит к следующему активирующему буферу для всех 10 буферов. Используйте скорость потока по умолчанию 200 микролитров в секунду с одной секундой, одной секундой, одной секундой и одной секундой для последовательности BAB и нажмите кнопку воспроизведения, чтобы начать измерение. Сохраните протокол и позвольте рабочему процессу запуститься, нажав на кнопку воспроизведения.Затем выполните тот же эксперимент с использованием безбелковых липосом. Используйте любое предпочтительное программное обеспечение для анализа данных для построения измеренного тока в сравнении со временем и используйте функцию для оценки пиковой высоты в диапазоне добавления активирующего буфера. Постройте график пикового тока против концентрации субстрата, чтобы определить половинный максимальный эффект концентрации, или EC50, субстрата с помощью нелинейной регрессии.Перенесите 50 миллилитров неактивирующего буфера SSM в чистую трубку. Добавьте подложку холина к конечной концентрации в пять миллимоляров и используйте ее для положительного контрольного измерения. Перенесите 10 миллилитров неактивирующего буфера SSM в чистую трубку.Добавьте подложку холина к пяти миллимолярам и нанотелу до конечной концентрации 500 наномоляров. Повторите шаг для каждого нанотела, чтобы подготовить активирующие растворы, как показано на рисунке. Запустите машину SSM и измерьте емкость и проводимость чипа, покрытого протеолипосомой, как показано ранее.Переложите активирующий раствор без нанотела во флакон и поместите буфер в пробоотборник зонда. Перенесите неактивирующий буфер без нанотела в резервуар и поместите его в пробоотборник зонда. Затем повторите этот процесс для всех растворов, содержащих нанотела с активирующим и неактивирующим раствором.Создайте протокол для рабочего процесса С помощью последовательности BAB. Создайте петлю, которая выполняет три измерения последовательности BAB с использованием буферов без нанотел, два измерения последовательности BAB с буферами, содержащими нанотело, 120-секундную инкубацию времени задержки с нанотелом и три измерения последовательности BAB с буферами, содержащими нанотело. Сохраните рабочий процесс и запустите его, нажав кнопку воспроизведения.Затем создайте новый протокол для рабочего процесса, используя последовательность BAB и цикл из пяти измерений, чтобы вымыть обратимо связанное нанотело. Сохраните рабочий процесс и запустите его, нажав кнопку воспроизведения. Сравните последний пиковый ток измерений с первоначальным измерением только подложки.Если пиковый ток достигает начального значения, нанотело успешно вымывается и исходные условия восстанавливаются. В противном случае повторите рабочий процесс или перейдите на новый чип. Повторите этот процесс с использованием отдельных чипов для каждого экрана нанотел или повторите с несколькими нанотелами, используя один и тот же чип.Используйте любое предпочтительное программное обеспечение для анализа данных, чтобы построить измеренный ток по отношению ко времени. Затем программа автоматически выбирает функцию для оценки пиковой высоты в диапазоне добавления буфера активации. Нормализуйте пиковый ток и присутствие нанотела на основе продолжающегося измерения только подложки.Постройте график пиковых токов в гистограмме и сравните пиковые токи измерений только подложки с пиковыми токами, измеренными в присутствии нанотел, чтобы идентифицировать тормозные нанотела. Переместите 50 миллилитров неактивирующего буфера SSM в чистую трубку и добавьте холин подложки до конечной концентрации пяти миллимоляров и используйте его в качестве активирующего раствора для положительного контроля. Добавляют пять миллилитров неактивирующего раствора в восемь чистых пробирок, затем добавляют в пробирки субстрат холина и ингибирующее нанотело в концентрациях в ожидаемом диапазоне IC50.Добавьте 10 миллилитров неактивирующего раствора в восемь пробирок и добавьте ингибирующее нанотело к каждой трубке, соответствующей неактивационному буферу. Запустите настройку SSM и измерьте емкость и проводимость чипа, покрытого протеолипосомой. Переложите активирующий раствор без нанотела во флакон и поместите его в пробоотборник зонда.Затем перенесите неактивирующий буфер без нанотела в резервуар и расположите его в положении резервуара рядом с держателем чипа справа. Переложите активирующие и неактивирующие растворы, содержащие нанотела, во флаконы и расположите буферы в пробоотборнике зонда. Создайте протокол для рабочего процесса с помощью последовательности BAB.Включите петлю для измерения каждой концентрации дважды, инкубируйте в течение 120 секунд и измеряйте еще три раза. Используйте любое предпочтительное программное обеспечение для анализа данных, чтобы построить измеренный ток в сравнении со временем и выбрать функцию для оценки пиковой высоты в диапазоне добавления буфера активации. Построение пиковых токов против концентрации нанотела для определения IC50 с помощью нелинейной регрессии.Для определения концентрации субстрата, которая будет использоваться во время скрининга нанотел, электрогенный транспорт измеряли при различных концентрациях подложки для определения EC50. Была выбрана концентрация субстрата, соответствующая условиям насыщения, пять миллимоляров, которая поддерживалась постоянной во всех активирующих буферах. Влияние ингибирующих нанотел на электрогенный транспорт визуализировали по снижению амплитуд пиковых токов.После запуска протокола промывки, позволяющего развязывать нанотела, наблюдалось восстановление от 80 до 95% от начальной амплитуды пикового тока. При переходе от неактивирующих к активирующим условиям нанотела, присутствующие в этих буферах, не вводили значимых токов артефактов. После отбора нанотел с ингибирующими свойствами определяли значения IC50 для отдельных нанотел.Крайне важно дать достаточно времени для калибровки протеолипосом на чипе с буфером, содержащим нанотело. Поскольку связывание обратимо, нанотело должно присутствовать как в активирующих, так и в неактивирующих буферах.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Selection of Transporter-Targeted Inhibitory Nanobodies by Solid-Supported-Membrane (SSM)-Based Electrophysiology

Modification and Functionalization of the Guanidine Group by Tailor-made Precursors

Модификация и Функционализация гуанидина группы, изготовленные на предвестников

The guanidine group is one of the most important pharmacophoric groups in medicinal chemistry. The only amino acid carrying a guanidine group is arginine. ...

Real-time Tracking of DNA Fragment Separation by Smartphone

В режиме реального времени отслеживание разделения фрагментов ДНК с помощью смартфона

Slab gel electrophoresis (SGE) is the most common method for the separation of DNA fragments; thus, it is broadly applied to the field of biology and ...

Single-molecule Manipulation of G-quadruplexes by Magnetic Tweezers

Одноместный молекула манипуляции G-quadruplexes, Магнитные пинцеты

Non-canonical nucleic acid secondary structure G-quadruplexes (G4) are involved in diverse cellular processes, such as DNA replication, transcription, RNA ...

Genome-wide Quantification of Translation in Budding Yeast by Ribosome Profiling

Геном широкий количественная оценка перевода в многообещающий дрожжей рибосома профилирования

Translation of mRNA into proteins is a complex process involving several layers of regulation. It is often assumed that changes in mRNA transcription ...

Formation of Covalent DNA Adducts by Enzymatically Activated Carcinogens and Drugs In Vitro and Their Determination by 32P-postlabeling

Formation of Covalent DNA Adducts by Enzymatically Activated Carcinogens and Drugs In Vitro and Their Determination by 32P-postlabeling

Образования ковалентной ДНК аддукты ферментативно активированные канцерогенов и наркотиков в пробирке и их решимость по 32P-postlabeling

Covalent DNA adducts formed by chemicals or drugs with carcinogenic potency are judged as one of the most important factors in the initiation phase of ...

Analysis of Endocytic Uptake and Retrograde Transport to the Trans-Golgi Network Using Functionalized Nanobodies in Cultured Cells

Анализ Endocytic поглощения и ретроградным транспорта Trans Гольджи сеть с помощью функционализированных Nanobodies в культивируемых клеток

Transport of proteins and membranes from the cell surface to the Golgi and beyond is essential for homeostasis, organelle identity and physiology. To ...

Imaging of Extracellular Vesicles by Atomic Force Microscopy

Изображение внеклеточных пузырьков с помощью атомной микроскопии силы

Exosomes and other extracellular vesicles (EVs) are molecular complexes consisting of a lipid membrane vesicle, its surface decoration by membrane ...

Interactions with and Membrane Permeabilization of Brain Mitochondria by Amyloid Fibrils

Взаимодействие с и Мембрана Пермябилизация митохондрий мозга амилоида Фибрилс

A growing body of evidence indicates that membrane permeabilization, including internal membranes such as mitochondria, is a common feature and primary ...

Creating Highly Specific Chemically Induced Protein Dimerization Systems by Stepwise Phage Selection of a Combinatorial Single-Domain Antibody Library

Создание высокоспецифических химически индуцированных систем димеризации белка по шагу Phage Выбор комбинаторных однодоменных антител библиотеки

Protein dimerization events that occur only in the presence of a small-molecule ligand enable the development of small-molecule biosensors for the ...

Single Cell Analysis Of Transcriptionally Active Alleles By Single Molecule FISH

Одноклеточный анализ транскрипционно активных аллелей одной молекулой FISH

Gene transcription is an essential process in cell biology, and allows cells to interpret and respond to internal and external cues. Traditional bulk ...