Name: selection of transporter-targeted inhibitory nanobodies by solid-supported-membrane (ssm)-based electrophysiology
Uploaded: 2021-05-03T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Selection of Transporter-Targeted Inhibitory Nanobodies by Solid-Supported-Membrane SSM-Based Electrophysiology at JoVE.com

Vi tackar Cedric A. J. Hutter och Markus A. Seeger från Institute of Medical Microbiology vid Zürichs universitet och Gonzalo Cebrero från Biozentrum vid Universitetet i Basel för samarbete i generering av syntetiska nanokroppar (sybodies). Vi tackar Maria Barthmes och Andre Bazzone från NANION Technologies för tekniskt stöd. Detta arbete stöddes av Swiss National Science Foundation (SNSF) (PP00P3_170607 och NANION Research Grant Initiative till C.P.).

1. Rekonstitution av membranprotein
<ol><li>Blanda 3 ml E. coli polära lipider med 1 ml fosfatidylkolin i en rund bottenkolv under en ventilerad huva.</li>
	<li>Torka lipidblandningen i 20 minuter under vakuum med en roterande förångare och ett vattenbad vid 37 °C för att avlägsna kloroform. Torka vid behov ytterligare under kväve- eller argongas.</li>
	<li>Använda TS-buffert (20 mM Tris-HCl pH 8,0, 150 mM NaCl) innehållande 2 mM β-mercaptoethanol, återsuspend lipider till 25 mg/mL.</li>
	<li>Aliquo...

<ol>
	<li>Braden, B. C., Goldman, E. R., Mariuzza, R. A., Poljak, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomy+an+antibody+molecule:+structure,+kinetics,+thermodynamics,+and+mutational+studies+of+the+antilysozyme+antibody+D1.3.">Anatomy an antibody molecule: structure, kinetics, thermodynamics, and mutational studies of the antilysozyme antibody D1.3.</a> Immunology Reviews. 163, 45-57 (1998).</li><li>Hamers-Casterman, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Naturally+occurring+antibodies+devoid+of+light+chains.">Naturally occurring antibodies devoid of light chains.</a> Nature. 363, 446-448 (1993).</li><li>Perez, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+of+inhibition+of+lipid-linked+oligosaccharide+flippase+PglK+by+a+conformational+nanobody.">Structural basis of inhibition of lipid-linked oligosaccharide flippase PglK by a conformational nanobody.</a> Science Reports. 7, 46641 (2017).</li><li>Grahl, A., Abiko, L. A., Isogai, S., Sharpe, T., Grzesiek, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-resolution+description+of+beta1-adrenergic+receptor+functional+dynamics+and+allosteric+coupling+from+backbone+NMR.">A high-resolution description of beta1-adrenergic receptor functional dynamics and allosteric coupling from backbone NMR.</a> Nature Communication. 11, 2216 (2020).</li><li>Schenck, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+and+characterization+of+anti-VGLUT+nanobodies+acting+as+inhibitors+of+transport.">Generation and characterization of anti-VGLUT nanobodies acting as inhibitors of transport.</a> Biochemistry. 56, 3962-3971 (2017).</li><li>Mireku, S. A., Sauer, M. M., Glockshuber, R., Locher, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+of+nanobody-mediated+blocking+of+BtuF,+the+cognate+substrate-binding+protein+of+the+Escherichia+coli+vitamin+B12+transporter+BtuCD.">Structural basis of nanobody-mediated blocking of BtuF, the cognate substrate-binding protein of the Escherichia coli vitamin B12 transporter BtuCD.</a> Science Reports. 7, 14296 (2017).</li><li>Manglik, A., Kobilka, B. K., Steyaert, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanobodies+to+study+G+protein-coupled+receptor+structure+and+function.">Nanobodies to study G protein-coupled receptor structure and function.</a> Annual Reviews of Pharmacology Toxicology. 57, 19-37 (2017).</li><li>Rasmussen, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+a+nanobody-stabilized+active+state+of+the+beta(2)+adrenoceptor.">Structure of a nanobody-stabilized active state of the beta(2) adrenoceptor.</a> Nature. 469 (2), 175-180 (2011).</li><li>Jiang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+a+LacY-nanobody+complex+in+a+periplasmic-open+conformation.">Crystal structure of a LacY-nanobody complex in a periplasmic-open conformation.</a> Proceeding of the National Academy of Science U. S. A. 113, 12420-12425 (2016).</li><li>Geertsma, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+a+prokaryotic+fumarate+transporter+reveals+the+architecture+of+the+SLC26+family.">Structure of a prokaryotic fumarate transporter reveals the architecture of the SLC26 family.</a> Nature Structural Molecular Biology. 22, 803-808 (2015).</li><li>Harmsen, M. M., De Haard, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Properties,+production,+and+applications+of+camelid+single-domain+antibody+fragments.">Properties, production, and applications of camelid single-domain antibody fragments.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 77, 13-22 (2007).</li><li>Pardon, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+general+protocol+for+the+generation+of+nanobodies+for+structural+biology.">A general protocol for the generation of nanobodies for structural biology.</a> Nature Protocols. 9, 674-693 (2014).</li><li>Nguyen, V. K., Desmyter, A., Muyldermans, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+heavy-chain+antibodies+in+Camelidae.">Functional heavy-chain antibodies in Camelidae.</a> Advances in Immunology. 79, 261-296 (2001).</li><li>Zimmermann, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+single+domain+antibodies+for+the+conformational+trapping+of+membrane+proteins.">Synthetic single domain antibodies for the conformational trapping of membrane proteins.</a> Elife. 7, 34317 (2018).</li><li>McMahon, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+surface+display+platform+for+rapid+discovery+of+conformationally+selective+nanobodies.">Yeast surface display platform for rapid discovery of conformationally selective nanobodies.</a> Nature Structural Molecular Biology. 25, 289-296 (2018).</li><li>Olichon, A., de Marco, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+a+naive+library+of+camelid+single+domain+antibodies.">Preparation of a naive library of camelid single domain antibodies.</a> Methods in Molecular Biology. 911, 65-78 (2012).</li><li>Moutel, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NaLi-H1:+A+universal+synthetic+library+of+humanized+nanobodies+providing+highly+functional+antibodies+and+intrabodies.">NaLi-H1: A universal synthetic library of humanized nanobodies providing highly functional antibodies and intrabodies.</a> Elife. 5, 16228 (2016).</li><li>Yan, J., Li, G., Hu, Y., Ou, W., Wan, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+of+a+synthetic+phage-displayed+nanobody+library+with+CDR3+regions+randomized+by+trinucleotide+cassettes+for+diagnostic+applications.">Construction of a synthetic phage-displayed nanobody library with CDR3 regions randomized by trinucleotide cassettes for diagnostic applications.</a> Journal of Translational Medicine. 12, 343 (2014).</li><li>Sabir, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+of+naive+camelids+VHH+repertoire+in+phage+display-based+library.">Construction of naive camelids VHH repertoire in phage display-based library.</a> Comptes Rendus Biologies. 337, 244-249 (2014).</li><li>Yau, K. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selection+of+hapten-specific+single-domain+antibodies+from+a+non-immunized+llama+ribosome+display+library.">Selection of hapten-specific single-domain antibodies from a non-immunized llama ribosome display library.</a> Journal of Immunology Methods. 281, 161-175 (2003).</li><li>vander Linden, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+physical+chemical+properties+of+llama+VHH+antibody+fragments+and+mouse+monoclonal+antibodies.">Comparison of physical chemical properties of llama VHH antibody fragments and mouse monoclonal antibodies.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1431, 37-46 (1999).</li><li>Dumoulin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-domain+antibody+fragments+with+high+conformational+stability.">Single-domain antibody fragments with high conformational stability.</a> Protein Science. 11, 500-515 (2002).</li><li>Iezzi, M. E., Policastro, L., Werbajh, S., Podhajcer, O., Canziani, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-domain+antibodies+and+the+promise+of+modular+targeting+in+cancer+imaging+and+treatment.">Single-domain antibodies and the promise of modular targeting in cancer imaging and treatment.</a> Frontiers in Immunology. 9, 273 (2018).</li><li>Yu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanobodies+derived+from+camelids+represent+versatile+biomolecules+for+biomedical+applications.">Nanobodies derived from camelids represent versatile biomolecules for biomedical applications.</a> Biomaterials Science. 8, 3559-3573 (2020).</li><li>Jahnichen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CXCR4+nanobodies+(VHH-based+single+variable+domains)+potently+inhibit+chemotaxis+and+HIV-1+replication+and+mobilize+stem+cells.">CXCR4 nanobodies (VHH-based single variable domains) potently inhibit chemotaxis and HIV-1 replication and mobilize stem cells.</a> Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 107, 20565-20570 (2010).</li><li>Nguyen, V. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+type+VI+secretion+by+an+anti-TssM+llama+nanobody.">Inhibition of type VI secretion by an anti-TssM llama nanobody.</a> PLoS One. 10, 0122187 (2015).</li><li>Bazzone, A., Barthmes, M., Fendler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SSM-Based+Electrophysiology+for+Transporter+Research.">SSM-Based Electrophysiology for Transporter Research.</a> Methods in Enzymology. 594, 31-83 (2017).</li><li>Schulz, P., Garcia-Celma, J. J., Fendler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SSM-based+electrophysiology.">SSM-based electrophysiology.</a> Methods. 46, 97-103 (2008).</li><li>Barthmes, M., Liao, J., Jiang, Y., Bruggemann, A., Wahl-Schott, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophysiological+characterization+of+the+archaeal+transporter+NCX_Mj+using+solid+supported+membrane+technology.">Electrophysiological characterization of the archaeal transporter NCX_Mj using solid supported membrane technology.</a> Journal of General Physiology. 147, 485-496 (2016).</li><li>Watzke, N., Diekert, K., Obrdlik, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophysiology+of+respiratory+chain+complexes+and+the+ADP-ATP+exchanger+in+native+mitochondrial+membranes.">Electrophysiology of respiratory chain complexes and the ADP-ATP exchanger in native mitochondrial membranes.</a> Biochemistry. 49, 10308-10318 (2010).</li><li>Zuber, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetics+of+charge+translocation+in+the+passive+downhill+uptake+mode+of+the+Na+/H++antiporter+NhaA+of+Escherichia+coli.">Kinetics of charge translocation in the passive downhill uptake mode of the Na+/H+ antiporter NhaA of Escherichia coli.</a> Biochim Biophys Acta. 1709, 240-250 (2005).</li><li>Garcia-Celma, J. J., Smirnova, I. N., Kaback, H. R., Fendler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophysiological+characterization+of+LacY.">Electrophysiological characterization of LacY.</a> Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 106, 7373-7378 (2009).</li><li>Bazzone, A., Madej, M. G., Kaback, H. R., Fendler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=pH+regulation+of+electrogenic+sugar/H++symport+in+MFS+sugar+permeases.">pH regulation of electrogenic sugar/H+ symport in MFS sugar permeases.</a> PLoS One. 11, 0156392 (2016).</li><li>Williamson, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+two-lane+mechanism+for+selective+biological+ammonium+transport.">A two-lane mechanism for selective biological ammonium transport.</a> Elife. 9, 57183 (2020).</li><li>Mirandela, G. D., Tamburrino, G., Hoskisson, P. A., Zachariae, U., Javelle, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+lipid+environment+determines+the+activity+of+the+Escherichia+coli+ammonium+transporter+AmtB.">The lipid environment determines the activity of the Escherichia coli ammonium transporter AmtB.</a> FASEB Journal. 33, 1989-1999 (2019).</li><li>Kaplan, R. S., Pedersen, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+microgram+quantities+of+protein+in+the+presence+of+milligram+levels+of+lipid+with+amido+black+10B.">Determination of microgram quantities of protein in the presence of milligram levels of lipid with amido black 10B.</a> Annals of Biochemistry. 150, 97-104 (1985).</li><li>Kermani, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structural+basis+of+promiscuity+in+small+multidrug+resistance+transporters.">The structural basis of promiscuity in small multidrug resistance transporters.</a> Nature Communication. 11, 6064 (2020).</li><li>Weitz, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+and+structural+characterization+of+a+prokaryotic+peptide+transporter+with+features+similar+to+mammalian+PEPT1.">Functional and structural characterization of a prokaryotic peptide transporter with features similar to mammalian PEPT1.</a> Journal of Biological Chemistry. 282, 2832-2839 (2007).</li></ol>

Tekniken som presenteras här klassificerar nanokroppar med hämmande och icke-hämmande egenskaper riktade mot elektrogena transportörer. Bedömning av substrattransporten är möjlig på grund av detektion av laddningar genom transportören inbäddad i membranet av proteoliposomer. Några av de kritiska stegen under installationen av ett experiment är rekonstitution av aktivt protein i liposomer, beredning av stabila monoskikt på SSM-chips och återhämtning av initiala förhållanden efter appliceringen av tvättpr...

Antikroppar består av två identiska tunga kedjor och två lätta kedjor som är ansvariga för antigenbindningen. Camelider har endast tunga antikroppar som uppvisar liknande affinitet för deras kognateantigen jämfört med konventionella antikroppar1,2. Det enda variabeldomänen (VHH) för antikroppar med endast tung kedja behåller den fulla antigenbindande potentialen och har visat sig vara mycket stabil1,2. Dessa isolerade VHH-molekyler eller "nanokroppar" har implementerats i studier relaterade till membranproteiner biokemi som verktyg för att stabilisera konformationerna3,4, som inhibitorer5,6, som stabiliseringsmedel7, och som prylar för strukturbestämning8,9,10 . Nanokroppar kan genereras genom immunisering av camelider för förberikning av B-celler som kodar målspecifika nanokroppar och efterföljande isolering av B-celler, följt av kloning av nanokroppsbiblioteket och val av fagdisplay11,12,13. Ett alternativt sätt att generera nanokroppar är baserat på in vitro-urvalsmetoder som förlitar sig på byggandet av bibliotek och val genom fagdisplay, ribosomdisplay eller jästdisplay14,15,16,17,18,19,20. Dessa in vitro-metoder kräver stora biblioteksstorlekar men drar nytta av att undvika djurimmunisering och gynnar valet av nanokroppar som riktar sig mot proteiner med relativt låg stabilitet.
Den lilla storleken på nanokroppar, deras höga stabilitet och löslighet, stark antigen affinitet, låg immunogenicitet och relativt enkel produktion, gör dem starka kandidater för utveckling av terapier21,22,23. I synnerhet är nanokroppar som hämmar aktiviteten hos flera membranproteiner potentiella tillgångar för kliniska tillämpningar5,24,25,26. När det gäller membrantransportörer, för att utvärdera om en nanokropp har hämmande aktivitet, är det nödvändigt att utveckla en analys som gör det möjligt att upptäcka transporterade substrat och/eller samsubstrat. Sådana analyser involverar vanligtvis märkta molekyler eller utformningen av substratspecifika detektionsmetoder, som kan sakna en universell tillämpning. Dessutom kräver identifiering av hämmande nanokroppar i allmänhet screening av ett stort antal bindemedel. Således är en metod som kan användas i ett höggenomströmningsläge och som inte förlitar sig på märkta substrat avgörande för detta val.
SSM-baserad elektrofysiologi är en extremt känslig, mycket tidsupplöst teknik som gör det möjligt att upptäcka förflyttning av laddningar över membran (t.ex. jonbindning/transport)27,28. Denna teknik har tillämpats för att karakterisera elektrogena transportörer, som är svåra att studera med andra elektrofysiologiska tekniker på grund av den relativa låga omsättningen av dessa proteiner29,30,31,32,33,34,35. SSM elektrofysiologi kräver inte användning av märkta substrat, det är lämpligt för screening med hög genomströmning, och antingen proteoliposomer eller membranblåsor som innehåller den transportör av intresse kan användas. Här visar vi att SSM-baserad elektrofysiologi kan användas för att klassificera transportörmålade nanokroppar med hämmande och icke-hämmande egenskaper. Som ett bevis på principer beskriver vi rekonstitution av en bakteriell kolin transportör i liposomer, följt av detaljerade steg för immobilisering av proteoliposomer på SSM sensorer. Vi beskriver därefter hur man utför SSM-baserade elektrofysiologiska mätningar av kolintransport och hur man bestämmer den halv maximala effektiva koncentrationen (EC50). Vi visar sedan hur man använder SSM-baserad elektrofysiologi för att screena flera nanokroppar och för att identifiera hämmare av kolintransport. Slutligen beskriver vi hur man bestämmer hälften maximala hämmande koncentrationer (IC50) av utvalda hämmande nanokroppar.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1-octadecanethiol solution</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>O1858-25ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2-diphytanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850356C-25mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-Beads SM-2 Adsorbent (Polystyrene adsorbent beads)</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>#152-3920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PD 10 Desalting Columns</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>GE17-0851-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter 200 nm membrane</td>
			<td>Whatman Nucleopore</td>
			<td>WHA800282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Propanol</td>
			<td>Merck</td>
			<td>33539-1L-R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Decane</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>8034051000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-dodecyl-&#223;-D-maltoside (DDM)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850520P-25g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>131659.1211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(SSM setup) SURFE2R N1</td>
			<td>Nanion</td>
			<td>-----</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SURFE2R N1 Single Sensor Chips</td>
			<td>Nanion</td>
			<td># 161001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma Base</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T1503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli Polar Lipid Extract</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>100600C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Egg PC L-&#945;-phosphatidylcholine </td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>840051C</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

selection of transporter-targeted inhibitory nanobodies by solid-supported-membrane (ssm)-based electrophysiology

Endomänsantikroppar (nanokroppar) har använts i stor utsträckning i mekanistiska och strukturella studier av proteiner och de utgör en enorm potential som verktyg för att utveckla kliniska terapier, varav många är beroende av hämning av membranproteiner som transportörer. De flesta metoder som används för att bestämma hämningen av transportaktiviteten är dock svåra att utföra i höggenomströmningsrutiner och är beroende av märkta substrattillgänglighet och komplicerar därmed screeningen av stora nanokroppsbibliotek. SSM-elektrofysiologi (Solid-supported membrane) är en metod med hög genomströmning som används för att karakterisera elektrogena transportörer och mäta deras transportkinetik och hämning. Här visar vi implementeringen av SSM-baserad elektrofysiologi för att välja hämmande och icke-hämmande nanokroppar riktade mot en elektrogen sekundär transportör och för att beräkna nanokroppar hämmande konstanter. Denna teknik kan vara särskilt användbar för att välja hämmande nanokroppar riktade mot transportörer för vilka märkta substrat inte är tillgängliga.

SSM-baserad elektrofysiologi har använts i stor utsträckning för karakterisering av elektrogena transportörer. I protokollet som presenteras här visar vi hur man använder SSM-baserad elektrofysiologi för att klassificera nanokroppar som riktar sig mot en sekundär transportör (här en bakteriell kolin symportör) baserat på deras hämmande och icke-hämmande egenskaper. En av de mest användbara funktionerna i denna teknik är att den möjliggör screening med hög genomströmning av flera buffertvillkor. Denna ...

Watch this Scientific Journal Video about Selection of Transporter-Targeted Inhibitory Nanobodies by Solid-Supported-Membrane SSM-Based Electrophysiology at JoVE.com

Selection of Transporter-Targeted Inhibitory Nanobodies by Solid-Supported-Membrane SSM-Based Electrophysiology

Nanokroppar är viktiga verktyg inom strukturbiologi och utgör en stor potential för utveckling av terapier. Valet av nanokroppar med hämmande egenskaper kan dock vara utmanande. Här demonstrerar vi användningen av SSM-baserad elektrofysiologi (Solid-supported-membranet) för klassificering av hämmande och icke-hämmande nanokroppar riktade mot elektrogena membrantransportörer.

Val av transportörriktad hämmande nanokroppar av SSM-baserad elektrofysiologi (Solid-Supported-Membrane)

Single domain antibodies (nanobodies) have been extensively used in mechanistic and structural studies of proteins and they pose an enormous potential as ...

Det presenterade protokollet används för screening med hög genomströmning och identifiering av hämmande och icke-hämmande nanokroppar riktade mot elektrogena transportörer som rekonstituerats i proteoliposomer eller förekommer i membranblåsor. Att utforma överföringsanalyser kan vara svårt i flera fall, särskilt om märkta substrat inte finns tillgängliga. Om samma elektrofysiologi tillåter studier av nanokroppars effekt på transport för praktiskt taget alla elektrogena transportörer, eftersom SSM elektrofysiologi inte kräver märkta substrat.Nanokroppar har undersökts för deras användning i medicinska tillämpningar. Denna teknik kan hjälpa till att screena potentiella hämmare som riktar sig till specifika elektrogena transportörer av människor eller mänskliga patogener. Till att börja med, ta 10 rena rör och överför 10 milliliter av det icke-inaktiverade fasta membranet, eller SSM, buffert till varje rör.För att förbereda de aktiverande SSM-buffertarna, tillsätt substratet i rören med hjälp av en serie koncentrationer runt den förväntade halv maximala koncentrationen. Starta SSM-programvaran och låt maskinen initieras automatiskt. Ange sparsökvägen för data.Bekräfta genom att trycka på OK-knappen. Välj det ursprungliga standardprotokollet för rengöring i arbetsflödesalternativen och klicka på Kör. Montera sedan det proteoliposomebelagda chipet på uttaget.Flytta armen för att låsa chippet. Omslut det monterade chipet med locket. Välj programmet CapCom i arbetsflödet och låt det köras för att bestämma konduktivitet och kapacitans.Bekräfta att konduktiviteten är under fem nanosiemens och kapacitansen är mellan 15 och 35 nanofarad innan den används för mätningen. Överför de aktiverande lösningarna till injektionsflaskan och placera buffertarna i sondprovtagaren. Överför den icke-aktiva bufferten till en behållare och placera den bredvid spånhållaren vid behållarens läge till höger.Skapa ett protokoll för arbetsflödet med hjälp av en sekvens av icke-aktiv, aktiverande och icke-aktiv lösningssekvens eller en BAB-sekvens i en slinga som utför tre mätningar och flyttas till nästa aktiverande buffert för alla 10 buffertar. Använd standardflödeshastigheten på 200 mikroliter per sekund med en sekund, en sekund, en sekunds flödes tider för BAB-sekvensen och klicka på spela för att starta mätningen. Spara protokollet och låt arbetsflödet köras genom att klicka på uppspelningsknappen.Utför sedan samma experiment med proteinfria liposomer. Använd valfri programvara för dataanalys för att rita den uppmätta strömmen kontra tiden och använda funktionen för uppskattning av topphöjd i intervallet för tillägget av den aktiverande bufferten. Plotta toppströmmen mot substratkoncentrationen för att bestämma den halv maximala effekten av koncentrationen, eller EC50, av substratet via icke-linjär regression.Överför 50 milliliter av den icke-inaktiverade SSM-bufferten till ett rent rör. Tillsätt substratet kolin till en slutlig koncentration av fem millimolar och använd detta för en positiv kontrollmätning. Överför 10 milliliter av den icke-aktiverande SSM-bufferten till ett rent rör.Tillsätt substrat kolin till fem millimolar och nanokropp till 500 nanomolar slutlig koncentration. Upprepa steget för varje nanokropp för att förbereda de aktiverande lösningarna enligt vad som demonstreras. Starta SSM-maskinen och mät kapacitansen och konduktiviteten hos det proteoliposombelagda chipet, vilket visats tidigare.Överför aktiveringslösningen utan nanokropp till en flaska och placera bufferten i sondens provtagare. Överför den icke-inaktiverande bufferten utan en nanokropp till en behållare och placera den i sondprovtagaren. Upprepa sedan denna process för alla lösningar som innehåller nanokroppar med aktiverande och icke-aktiv lösning.Skapa ett protokoll för arbetsflödet Med hjälp av en BAB-sekvens. Skapa en slinga som utför tre mätningar av BAB-sekvensen med hjälp av buffertar utan nanokroppar, två mätningar av BAB-sekvensen med buffertar som innehåller en nanokropp, 120 sekunders fördröjningstidinkubation med nanokroppen och tre mätningar av BAB-sekvensen med buffertar som innehåller nanokroppen. Spara arbetsflödet och låt det köras genom att klicka på uppspelningsknappen.Skapa sedan ett nytt protokoll för arbetsflödet med hjälp av en BAB-sekvens och en slinga med fem mätningar för att tvätta bort den reversibelt bundna nanokroppen. Spara arbetsflödet och låt det köras genom att klicka på uppspelningsknappen. Jämför mätningarnas senaste toppström med den första mätningen av enbart substrat.Om toppströmmen når det ursprungliga värdet har nanokroppen framgångsrikt tvättats ut och de ursprungliga förhållandena har återupprättats. Annars upprepar du arbetsflödet eller byter till ett nytt chip. Upprepa denna process med enskilda chips för varje nanokroppsskärm, eller upprepa med flera nanokroppar med samma chip.Använd valfri programvara för dataanalys för att rita den uppmätta strömmen kontra tiden. Sedan väljer programvaran automatiskt funktionen för topphöjdsuppskattning i intervallet för tillägget av aktiveringsbufferten. Normalisera toppströmmen och närvaron av nanokroppen baserat på den fortsatta substratmätningen.Plotta toppströmmarna i histogrammet och jämför toppströmmarna för substratmätningarna med toppströmmarna mätta i närvaro av nanokroppar för att identifiera hämmande nanokroppar. Överför 50 milliliter av den icke-inaktiverande SSM-bufferten till ett rent rör och tillsätt substratet kolin till en slutlig koncentration av fem millimolar, och använd detta som aktiveringslösning för positiv kontroll. Tillsätt fem milliliter av den icke-aktiva lösningen till åtta rena rör och tillsätt sedan substrat kolin och hämmande nanokropp till rören i koncentrationer i det förväntade IC50-området.Tillsätt 10 milliliter av den icke-aktiva lösningen till de åtta rören och tillsätt hämmande nanokropp till varje rör som motsvarar icke-aktiveringsbufferten. Starta SSM-installationen och mät kapacitansen och konduktiviteten hos det proteoliposombelagda chipet. Överför aktiveringslösningen utan nanokropp till en flaska och placera den i sondens provtagare.Överför sedan den icke-aktiva bufferten utan nanokropp till en behållare och placera den i reservoarens läge bredvid spånhållaren till höger. Överför de aktiverande och icke-aktiva lösningarna som innehåller nanokroppar till injektionsflaska och placera buffertarna i sondprovtagaren. Skapa ett protokoll för arbetsflödet med en BAB-sekvens.Inkludera en slinga för att mäta varje koncentration två gånger, inkubera i 120 sekunder och mät ytterligare tre gånger. Använd valfri programvara för dataanalys för att rita den uppmätta strömmen kontra tiden och välja funktionen för topphöjdsuppskattningen i intervallet för tillägget av aktiveringsbufferten. Plotta toppströmmarna mot nanokroppskoncentrationen för att bestämma IC50 via icke-linjär regression.Vid bestämning av den substratkoncentration som ska användas vid en screening av nanokroppar mättes elektrogen transport under olika substratkoncentrationer för att bestämma EC50. En substratkoncentration motsvarande mättande förhållanden, fem millimolar, valdes ut och hölls konstant i alla aktiverande buffertar. Effekten av hämmande nanokroppar på elektrogena transporter visualiserades från minskningen av toppströmmars amplituder.Efter att ha kört tvättprotokollet för att tillåta nanokropp unbinding, observerades en återhämtning av 80 till 95% av den ursprungliga toppströmmen amplitude. Vid byte från icke-aktiv till aktiverande förhållanden introducerades inga signifikanta artefaktströmmar av nanokroppar som finns i dessa buffertar. Efter att ha valt nanokroppar med hämmande egenskaper fastställdes IC50-värdena för enskilda nanokroppar.Det är viktigt att ge tillräckligt med tid för kalibrering av proteoliposomerna på chipet med bufferten som innehåller nanokroppen. Eftersom bindningen är reversibel måste nanokroppen finnas i både aktiverande och icke-aktiva buffertar.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Selection of Transporter-Targeted Inhibitory Nanobodies by Solid-Supported-Membrane (SSM)-Based Electrophysiology

Real-time Tracking of DNA Fragment Separation by Smartphone

Spårning i realtid av DNA-fragment separering av smartphone

Slab gel electrophoresis (SGE) is the most common method for the separation of DNA fragments; thus, it is broadly applied to the field of biology and ...

Single-molecule Manipulation of G-quadruplexes by Magnetic Tweezers

Singel-molekyl Manipulation av G-quadruplexes av magnetisk pincett

Non-canonical nucleic acid secondary structure G-quadruplexes (G4) are involved in diverse cellular processes, such as DNA replication, transcription, RNA ...

Genome-wide Quantification of Translation in Budding Yeast by Ribosome Profiling

Genome-wide kvantifiering av översättning i spirande jäst av Ribosomen profilering

Translation of mRNA into proteins is a complex process involving several layers of regulation. It is often assumed that changes in mRNA transcription ...

Formation of Covalent DNA Adducts by Enzymatically Activated Carcinogens and Drugs In Vitro and Their Determination by 32P-postlabeling

Formation of Covalent DNA Adducts by Enzymatically Activated Carcinogens and Drugs In Vitro and Their Determination by 32P-postlabeling

Bildandet av kovalent DNA addukter av enzymatiskt aktiverade carcinogener och droger In Vitro och deras beslutsamhet av 32P-postlabeling

Covalent DNA adducts formed by chemicals or drugs with carcinogenic potency are judged as one of the most important factors in the initiation phase of ...

Analysis of Endocytic Uptake and Retrograde Transport to the Trans-Golgi Network Using Functionalized Nanobodies in Cultured Cells

Analys av Endocytic upptag och retrograd Transport till Trans-Golgi nätverket med Functionalized Nanobodies i odlade celler

Transport of proteins and membranes from the cell surface to the Golgi and beyond is essential for homeostasis, organelle identity and physiology. To ...

Imaging of Extracellular Vesicles by Atomic Force Microscopy

Avbildning av extracellulära blåsor med atomkraft mikroskopi

Exosomes and other extracellular vesicles (EVs) are molecular complexes consisting of a lipid membrane vesicle, its surface decoration by membrane ...

Nitropeptide Profiling and Identification Illustrated by Angiotensin II

Nitropeptid profilering och identifiering illustrerad av angiotensin II

Protein nitration is one of the most important post-translational modifications (PTM) on tyrosine residues and it can be induced by chemical actions of ...

Interactions with and Membrane Permeabilization of Brain Mitochondria by Amyloid Fibrils

Interaktioner med och membran permeabilisering av hjärnans Mitokona av amyloid fibriller

A growing body of evidence indicates that membrane permeabilization, including internal membranes such as mitochondria, is a common feature and primary ...

Creating Highly Specific Chemically Induced Protein Dimerization Systems by Stepwise Phage Selection of a Combinatorial Single-Domain Antibody Library

Att skapa mycket specifika kemiskt inducerad Proteindimeriseringssystem genom stegvis val av ett kombinatoriskt Endomänsantikroppsbibliotek

Protein dimerization events that occur only in the presence of a small-molecule ligand enable the development of small-molecule biosensors for the ...

Rapid Determination of Antibody-Antigen Affinity by Mass Photometry

Snabb bestämning av antikropp-antigen affinitet genom Mass Photometry

Measurements of the specificity and affinity of antigen-antibody interactions are critically important for medical and research applications. In this ...