Name: microinjection method for anopheles gambiae embryos
Uploaded: 2021-07-07T13:00:00
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Nous sommes reconnaissants à Drusilla Stillinger, Kiona Parker, Parrish Powell et Madeline Nottoli pour l’élevage des moustiques. Le financement a été fourni par l’Université de Californie, Irvine Malaria Initiative. AAJ est professeur Donald Bren à l’Université de Californie à Irvine.

1. Préparation des moustiques à la micro-injection
<ol><li>Ensemencez une cage13 (~5000 cm3)avec ~100 moustiques mâles et 200-300 femelles adultes de 1-2 jours après l’éclosion et laissez-les s’accoupler pendant 2 jours.</li>
	<li>Après la période d’accouplement, fournir aux moustiques un repas de sang en utilisant soit 2 mL de sang avec un dispositif d’alimentation artificielle, soit des animaux anesthésiés vivants selon les pratiques insectaires14<...

<ol>
	<li>Feramisco, J., Perona, R., Lacal, J. C., Lacal, J. C., Feramisco, J., Perona, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Needle+Microinjection:+A+Brief+History.">Needle Microinjection: A Brief History.</a> Microinjection. Methods and Tools in Biosciences and Medicine. , (1999).</li><li>Windbichler, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+synthetic+homing+endonuclease-based+gene+drive+system+in+the+human+malaria+mosquito.">A synthetic homing endonuclease-based gene drive system in the human malaria mosquito.</a> Nature. 473 (7346), 212-215 (2011).</li><li>Meredith, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specific+integration+and+expression+of+an+anti-malarial+gene+in+transgenic+Anopheles+gambiae+significantly+reduces+Plasmodium+infections.">Site-specific integration and expression of an anti-malarial gene in transgenic Anopheles gambiae significantly reduces Plasmodium infections.</a> PLoS One. 6 (1), 14587 (2011).</li><li>Hammond, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Cas9+gene+drive+system+targeting+female+reproduction+in+the+malaria+mosquito+vector+Anopheles+gambiae.">CRISPR-Cas9 gene drive system targeting female reproduction in the malaria mosquito vector Anopheles gambiae.</a> Nature Biotechnology. 34 (1), 78-83 (2016).</li><li>Carballar-Lejarazu, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next-generation+gene+drive+for+population+modification+of+the+malaria+vector+mosquito,+Anopheles+gambiae.">Next-generation gene drive for population modification of the malaria vector mosquito, Anopheles gambiae.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (37), 22805-22814 (2020).</li><li>Sim&#245;es, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Anopheles+FBN9+immune+factor+mediates+Plasmodium+species-specific+defense+through+transgenic+fat+body+expression.">The Anopheles FBN9 immune factor mediates Plasmodium species-specific defense through transgenic fat body expression.</a> Develomental &amp; Comparative Immunology. 67, 257-265 (2017).</li><li>Arik, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+Akt+signaling+in+the+mosquito+fat+body+increases+adult+survivorship.">Increased Akt signaling in the mosquito fat body increases adult survivorship.</a> FASEB Journal. 4, 1404-1413 (2015).</li><li>Riabinina, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+of+olfactory+centres+in+the+malaria+mosquito+Anopheles+gambiae.">Organization of olfactory centres in the malaria mosquito Anopheles gambiae.</a> Nature Communications. 7, 13010 (2016).</li><li>Kyrou, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+CRISPR-Cas9+gene+drive+targeting+doublesex+causes+complete+population+suppression+in+caged+Anopheles+gambiae+mosquitoes.">A CRISPR-Cas9 gene drive targeting doublesex causes complete population suppression in caged Anopheles gambiae mosquitoes.</a> Nature Biotechnology. 36 (11), 1062-1066 (2018).</li><li>Dong, Y., Sim&#245;es, M. L., Dimopoulos, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Versatile+transgenic+multistage+effector-gene+combinations+for+Plasmodium+falciparum+suppression+in+Anopheles.">Versatile transgenic multistage effector-gene combinations for Plasmodium falciparum suppression in Anopheles.</a> Science Advances. 6 (20), (2020).</li><li>Grossman, G. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germline+transformation+of+the+malaria+vector,+Anopheles+gambiae,+with+the+piggyBac+transposable+element.">Germline transformation of the malaria vector, Anopheles gambiae, with the piggyBac transposable element.</a> Insect Molecular Biology. 6, 597-604 (2001).</li><li>Benedict, M. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+in+Anopheles+research.+Chapter+3:+Specific+Anopheles+techniques.+3.1+Embryonic+Techniques.+3.1.1+Microinjection+methods+for+Anopheles+Embryos.">Methods in Anopheles research. Chapter 3: Specific Anopheles techniques. 3.1 Embryonic Techniques. 3.1.1 Microinjection methods for Anopheles Embryos.</a> BEI resources. , (2015).</li><li>Pham, T. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+population+modification+of+the+malaria+vector+mosquito,+Anopheles+stephensi.">Experimental population modification of the malaria vector mosquito, Anopheles stephensi.</a> PLoS Genetics. 15 (12), 1008440 (2019).</li><li>Benedict, M. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pragmatic+selection+of+larval+mosquito+diets+for+insectary+rearing+of+Anopheles+gambiae+and+Aedes+aegypti.">Pragmatic selection of larval mosquito diets for insectary rearing of Anopheles gambiae and Aedes aegypti.</a> PLoS One. 15 (3), 0221838 (2020).</li><li>Carballar-Lejaraz&#250;, R., James, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Population+modification+of+Anopheline+species+to+control+malaria+transmission.">Population modification of Anopheline species to control malaria transmission.</a> Pathogens and Global Health. 111 (8), 424-435 (2017).</li></ol>

Grâce à la disponibilité accrue de technologies de génie génétique précises et flexibles telles que CRISPR/Cas9, les organismes transgéniques peuvent être développés de manière plus simple et plus stable qu’auparavant. Ces outils ont permis aux chercheurs de créer des souches transgéniques de moustiques vecteurs qui sont très proches d’atteindre les propriétés souhaitées de réfractaire aux agents pathogènes (modification de la population) ou de stérilité héréditaire (suppression de la populati...

Les techniques de micro-injection sont utilisées pour manipuler expérimentalement des organismes depuis le début des années 19001. La microinjection a été utilisée pour étudier à la fois les fonctions biologiques de base et / ou introduire des changements importants dans la biologie d’un organisme désiré. La technique de micro-injection a été d’un intérêt particulier pour les biologistes vecteurs et a été largement utilisée pour manipuler les génomes vectoriels2-11. Les expériences de transgénèse chez les vecteurs arthropodes visent souvent à rendre les vecteurs moins efficaces pour transmettre les agents pathogènes en adoptant des changements qui diminuent la capacité physique d’un vecteur ou augmentent la réfractaireté des agents pathogènes qu’ils transmettent. Les moustiques transmettent une variété d’agents pathogènes humains et ont un impact significatif sur la morbidité et la mortalité dans le monde entier. Le genre de moustiques Anopheles transmet les agents pathogènes parasites du paludisme humain, Plasmodium spp. Les expériences de génie génétique avec les anophèles ont visé à mieux comprendre la biologie et à réduire la capacité vectorielle de ces moustiques dans le but de développer de nouvelles stratégies d’élimination du paludisme.
Les moustiques vecteurs qui contribuent le plus au nombre d’infections palustres dans le monde se trouvent dans le complexe d’espèces Anopheles gambiae. Cependant, la majorité des expériences de transgénèse réussies ont été réalisées sur le vecteur du paludisme du sous-continent indien, Anopheles stephensi. Bien qu’il existe de nombreuses souches d’Anopheles gambiae adaptées en laboratoire, le nombre de lignées transgéniques d’Anopheles gambiae spp. rapportées dans la littérature ne se compare pas à celui d’Anopheles stephensi. On pense que l’embryon d’Anophèle gambie est plus difficile à injecter et à réussir la transgénèse que Anopheles stephensi,bien que les raisons de ces différences soient inconnues. Ce protocole décrit une méthode qui s’est avérée toujours efficace pour réaliser la transgénèse des embryons d’Anophèles gambiae par micro-injection. Le protocole est basé sur une méthode précédemment développée par Hervé Bossin et Mark Benedict12 avec quelques détails et modifications supplémentaires qui ont été trouvés pour augmenter l’efficacité de la transgénèse.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >10x Microinjection Buffer</td>
			<td >-</td>
			<td >-</td>
			<td >1 mM NaHPO4 buffer, pH 6.8, 50 mM KCl</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Blotting membrane (Zeta-Probe GT Genomic Tested Blotting Membrane)</td>
			<td >Bio-Rad</td>
			<td ></td>
			<td >Neatly and straightly cut into 2x1 cm piece</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Conical tubes 50 ml (disposable centrifuge tube, polypropylene)</td>
			<td >Fisher Brand</td>
			<td ></td>
			<td >Ends cut</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >De-ionized or double-distilled water (ddH20)&#160;</td>
			<td >Mili-Q</td>
			<td ></td>
			<td >In a wash bottle&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dissecting microscope&#160;</td>
			<td >Leica&#160;</td>
			<td >Leica MZ12</td>
			<td >For embryo alignment</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Forceps&#160;</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td >No. 5 size&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Glass container&#160;</td>
			<td >Pyrex</td>
			<td >No. 3140</td>
			<td >125 x 65</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Glass slide&#160;</td>
			<td >Fisher Brand</td>
			<td >No. 12-549-3</td>
			<td >75x26 mm</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Incubator</td>
			<td >Barnsted Lab-line</td>
			<td >Model No. 150</td>
			<td >28 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >KCl</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td >50 mM</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Latex dental film&#160;</td>
			<td >Crosstex International</td>
			<td >No. 19302</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Microinjector</td>
			<td >Sutter Instrument</td>
			<td ></td>
			<td >XenoWorks Digital Microinjector</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Microloader Pipette tips&#160;</td>
			<td >Eppendorf&#160;</td>
			<td ></td>
			<td >20 &#181;L microloader epT.I.P.S.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Micromanipulator</td>
			<td >Sutter Instrument</td>
			<td ></td>
			<td >XenoWorks Micromanipulator</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Micropipette&#160;</td>
			<td >Rainin&#160;</td>
			<td ></td>
			<td >20 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Micropipette puller&#160;</td>
			<td >Sutter Instrument</td>
			<td >Sutter P-2000 micropipette puller</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Microscope&#160;</td>
			<td >Leica</td>
			<td >DM 1000 LED or M165 FC</td>
			<td >For microinjection</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Minimum fiber filter paper&#160;</td>
			<td >Fisher Brand</td>
			<td >No. 05-714-4</td>
			<td >Chromatography Paper, Thick&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Mosquitoes&#160;</td>
			<td >MR4, BEI Resources</td>
			<td ></td>
			<td >Anopheles gambiae, mated adult females, blood-fed 4-5 days post-eclosion</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >NaHPO4 buffer&#160;</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td >1 mM, ph 6.8</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Nylon mesh</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Paint brush</td>
			<td >Blick</td>
			<td >No. 05831-7040</td>
			<td >Fine, size 4/0</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Petri dish</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td >Plastic, (60x15 mm, 90x15 mm)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sodium acetate</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td >&#160;3M</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Quartz glass capillaries&#160;</td>
			<td >Sutter Instrument</td>
			<td >No. QF100-70-10</td>
			<td >With filament, 1 mm OD,&#160; ID 0.7 10 cm length</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Water PCR grade&#160;</td>
			<td >Roche</td>
			<td >No. 03315843001</td>
			<td ></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microinjection method for anopheles gambiae embryos

Les techniques de micro-injection embryonnaire sont essentielles pour de nombreuses études moléculaires et génétiques d’espèces d’insectes. Ils fournissent un moyen d’introduire des fragments d’ADN exogènes codant pour des gènes d’intérêt ainsi que des traits favorables dans la lignée germinale de l’insecte de manière stable et héréditaire. Les souches transgéniques résultantes peuvent être étudiées pour les changements phénotypiques résultant de l’expression de l’ADN intégré pour répondre à des questions de base ou utilisées dans des applications pratiques. Bien que la technologie soit simple, elle exige de l’enquêteur de la patience et de la pratique pour atteindre un niveau de compétence qui maximise l’efficacité. On voit ici une méthode de micro-injection d’embryons du moustique africain du paludisme, Anopheles gambiae. L’objectif est de délivrer par microinjection de l’ADN exogène à l’embryon afin qu’il puisse être absorbé dans les cellules germinales (pôles) en développement. L’expression à partir de l’ADN injecté de transposases, d’intégrases, de recombinases ou d’autres nucléases (par exemple les protéines associées à CRISPR, Cas) peut déclencher des événements qui conduisent à son insertion covalente dans les chromosomes. L’An. gambiae transgénique généré à partir de ces technologies a été utilisé pour des études de base des composants du système immunitaire, des gènes impliqués dans l’alimentation sanguine et des éléments du système olfactif. En outre, ces techniques ont été utilisées pour produire des souches d’An. gambiae avec des caractéristiques qui peuvent aider à contrôler la transmission des parasites du paludisme.

Un exemple représentatif de l’application du protocole de microinjection décrit peut être trouvé dans Carballar-Lejarazú et al5. L’intention ici était d’insérer un système de forçage génétique autonome dans la lignée germinale d’une souche de laboratoire, G3, d’An. gambiae. Le système a été conçu pour cibler le locus orthologue cardinal (Agcd)sur le troisième chromosome de cette espèce, qui code une peroxydase hémique qui catalyse la conversi...

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Microinjection Method for Anopheles gambiae Embryos

Les techniques de micro-injection sont essentielles pour introduire des gènes exogènes dans les génomes des moustiques. Ce protocole explique une méthode utilisée par le laboratoire James pour microinjecter des constructions d’ADN dans des embryons d’Anophèles gambiens afin de générer des moustiques transformés.

Méthode de micro-injection pour les embryons d’anophèles gambiens

Embryo microinjection techniques are essential for many molecular and genetic studies of insect species. They provide a means to introduce exogenous DNA ...

Ce protocole est important car il fournit une méthode de micro-injection spécifique pour un Anopheles gambiae, qui a été historiquement difficile à transformer en utilisant des techniques de génie génétique courantes. Le principal avantage de cette technique est qu’elle crée de manière fiable des anophèles gambiens transgéniques. Les applications de cette technique s’étendent à de nouvelles stratégies d’élimination du paludisme en facilitant la création de moustiques adaptés à la suppression ou à la modification des populations d’Anopheles gambiae de type sauvage.Cette méthodologie peut être facilement adaptée à différentes espèces de moustiques. Notre technologie de micro-injection demande de la patience et de la pratique. Il y a une courbe d’apprentissage.Pour commencer, utilisez un aspirateur pour placer 20 à 30 femelles dans un tube conique transparent de 50 millilitres. Assurez-vous que le tube est ouvert aux deux extrémités et recouvert d’un film dentaire en latex à une extrémité et d’un filet de nylon et de papier filtre à l’autre, où les moustiques pondront leurs œufs. Placez le tube rempli de moustiques dans une petite boîte de Pétri remplie d’eau double distillée, puis placez le tube et la boîte dans un incubateur à 28 degrés Celsius pendant 45 minutes.Retirez le tube de l’incubateur et insérez-le dans une cage vide. Tapotez doucement le tube pour permettre aux moustiques de s’envoler. Retirez le tube de la cage une fois que tous les moustiques se sont envolés.Lorsque le tube est exempt de moustiques, dévissez l’anneau inférieur, retirez le nylon et utilisez une pince pour retirer soigneusement le papier filtre avec les œufs du tube. Placez le papier filtre chargé d’œufs dans une boîte de Petri en plastique contenant une couche de papier filtre humidifiée avec de l’eau. Placez une membrane sur une lame de verre propre et utilisez des pinces propres pour recouvrir la membrane d’un morceau de papier filtre, laissant environ un millimètre du filtre à membrane découvert.Mouillez le papier filtre avec de l’eau désionisée, puis utilisez la brosse pour transférer doucement 30 à 50 embryons sur le bord de la membrane et aligner les œufs verticalement le long de la membrane. Orientez les œufs dans la même direction de sorte que lorsque les œufs sont observés au microscope à microinjection, l’extrémité postérieure est en position descendante et forme un angle de 15 degrés avec l’aiguille. Tapisser tout le bord de la membrane avec des œufs.Utilisez une pointe de microchargeur pour remplir les aiguilles avec deux microlitres de mélange d’ADN. Insérez l’aiguille dans le porte-aiguille et connectez le tube de pompe à pression automatisé. Alignez l’aiguille de manière à ce qu’elle fasse un angle de 15 degrés avec le plan de la diapositive.Ouvrez la pointe de l’aiguille en touchant soigneusement le premier œuf, puis insérez la pointe de l’aiguille à environ 10 micromètres dans le pôle postérieur. Une injection réussie entraînera un petit mouvement du cytoplasme dans l’œuf. Utilisez les commandes de l’étape coaxiale du microscope pour passer à l’œuf suivant afin de poursuivre l’injection.Pour vous assurer que la pointe de l’aiguille reste ouverte et n’a pas été bouchée, appuyez sur le bouton Injecter avant d’entrer dans un autre embryon et visualisez la petite gouttelette à l’ouverture de l’aiguille. Si l’aiguille est bouchée, appuyez sur le bouton Effacer pour effacer l’aiguille et répétez le test de visualisation des gouttelettes. Ajustez la pression au besoin si l’ouverture de la pointe de l’aiguille devient légèrement plus grande pour vous assurer que la taille des gouttelettes reste petite.Injecter environ 40 à 50 œufs avec une aiguille. Une fois les injections terminées, rincez les œufs dans un récipient en verre tapissé de papier filtre et rempli de 50 millilitres d’eau désionisée. En utilisant ce protocole, un système autonome piloté par des gènes a été inséré dans la lignée germinale d’une souche de laboratoire G3 d’Anopheles gambiae.Le système a été conçu pour cibler l’orthologue cardinal, ou Agcd, sur le troisième chromosome de cette espèce. Le plasmide pCO37 est montré. Il contient Streptococcus pyogenes Cas9 endonucléase sous contrôle des éléments régulateurs de l’orthologue du gène nanos.De plus, il dispose d’un ARN guide sous le contrôle d’un promoteur du gène U6 et de la cassette de marqueur dominant CFP 3XP3 exprimant la protéine fluorescente cyan. Les approches moléculaires ont vérifié l’insertion précise d’environ 10 kilos de paires de bases d’ADN, qui a été désigné comme AgNosCd-1. Des analyses de suivi approfondies ont montré que l’AgNosCd-1 était très efficace à l’entraînement, créait peu d’allèles résistants et n’avait pas de charge génétique majeure en raison de l’intégration et de l’expression du système de forçage génétique.Le forçage génétique homozygote contenant des moustiques était des mutants en perte de fonction, les larves, les nymphes et les adultes nouvellement apparus ayant un phénotype des yeux rouges. Lorsque vous essayez ce protocole, il est crucial de rester à 88 pour une bonne éclosion aux œufs gris clair et éviter les œufs blancs.

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