Tecnologias de omics em larga escala estão sendo utilizadas cada vez mais em estudos focados na obesidade. A epigenética pode ser uma ligação entre a exposição e os desfechos de saúde. Esse tipo de estudo gera uma enorme quantidade de dados.
Diante disso, é importante padronizar os protocolos para tornar os dados tecnicamente comparáveis. Neste estudo, vamos propor um pipeline para obter e analisar dados de metilação de DNA. O mesmo protocolo pode ser aplicado para versões 400K e épicas.
Primeiro dia: tratamento de bisulfito. Comece desnaturando DNA genômico e adicione os reagentes de conversão. É necessário seguir as recomendações do kit.
E tratar o DNA desnaturação com bisfosfato. Em seguida, incubar as amostras em um cicloviário térmico. Realize as etapas de lavagem usando o tampão de lavagem.
Segundo dia: Amplificação seguindo o ensaio de metilação, protocolo manual. Pré-aqueça o forno de hibridização a 37 graus Celsius e permita que a temperatura se equilibre. Disperse 20 microlitres de MA1 nos poços da placa.
Transfira quatro microliters do DNA para os poços correspondentes na placa. Disperse quatro microliters de solução de hidróxido de sódio nos poços da placa. Sele a placa com um selo plástico.
Vórtice a placa para misturar os reagentes com amostras. Incubar por 10 minutos em temperatura ambiente. Disperse 68 microliters de RPM em cada poço e, em seguida, 75 microliters de MSM sem remover a solução anteriormente.
Use um novo selo para cobrir a placa. Vórtice a placa por um minuto. Incubar no forno de hibridização por 20 a 24 horas a 37 graus Celsius.
Terceiro dia: Hibridização seguindo o ensaio de metilação, protocolo manual. Pré-aqueça o bloco inserindo a placa a 37 graus Celsius. Remova cuidadosamente a placa do forno de hibridização.
Pulsar a placa. Retire o selo da placa. Adicione 50 microliters de FMS a cada recipiente de amostra.
Vórtice a placa por um minuto. Centrifugar as necessidades da placa. Em seguida, coloque a placa selada no bloco de aquecimento a 37 graus Celsius durante uma hora.
Adicione 100 microliters de PM1 a cada poço contendo amostras. Sele a placa de novo. Vórtice a placa por um minuto.
Incubar a 37 graus Celsius por cinco minutos. Em seguida, pulso na centrífuga por um minuto, em seguida, adicione 300 microlitros de 100%2-propanol a cada poço com amostra. Sele a placa de novo.
Misture todo o conteúdo invertendo a placa pelo menos 10 vezes. Incubar a quatro graus Celsius por 30 minutos, e depois centrífugas a quatro graus Celsius por 20 minutos. Retire o selo da placa.
Inverta rapidamente a placa em um lugar apropriado, descartando o supernatante. Toque firmemente várias vezes até que você tenha notado que todos os poços estão livres de líquido. À temperatura ambiente, deixe a placa de cabeça para baixo e descoberto por uma hora.
Depois de secar todo o líquido, é necessário ver paletes azuis na parte inferior dos poços. Em seguida, adicione 46 microliters de RA1 a cada poço. Aplique o selo de calor na placa.
Segure firme para realizar a vedação uniformemente. Coloque a placa no forno de hibridização a 48 graus Celsius por uma hora, depois vórtice por um minuto. Pulso na centrífuga, e aqueça a placa a 95 graus Celsius por uma hora.
Preparem as Câmaras de Hyb BeadChip juntas. Nesta próxima etapa, disperse 400 microlitros de PB2 nos reservatórios das Câmaras hyb. Depois de encher os reservatórios da Câmara de Hyb com PB2, coloque a tampa imediatamente.
Carregue cuidadosamente cada amostra da placa na entrada da amostra da microarray. Carregue as pastilhas da Câmara de Hyb contendo as microarrays na Câmara de Hyb. Feche a Câmara de Hyb transversalmente para evitar uma possível mudança da Câmara de Hyb.
Quarto dia:Coloração após o ensaio de metilação, protocolo manual. Após a incubação noturna, remova todas as microarrays das pastilhas. E lave as microarrays lentamente e levemente, um total de 10 vezes, para cima e para baixo.
Mova as microarrays para o contêiner PB1 número dois e repita 10 vezes, para cima e para baixo. Coloque os quadros da Câmara de Fluxo na posição correta e, em seguida, cada microarray. Use um espaçador transparente na parte superior de cada um.
A barra de alinhamento precisa ser posicionada no acessório de alinhamento. Uma placa traseira de vidro precisa ser colocada em cima do espaçador. Em seguida, conecte os grampos metálicos às Câmaras de Fluxo.
Use uma tesoura para aparar as extremidades dos espaçadores da Câmara de Fluxo. Coloque a Câmara de Fluxo com a microarray no rack da câmara. Pipeta 150 microliters de RA1.
Incubar por 30 minutos e repetir cinco vezes. Pipeta 450 microliters de XC1, e incubar por 10 minutos. Pipeta 450 microliters de XC2 e incubar por 10 minutos.
Pipeta 200 microliters de TEM. Incubar por 15 minutos. Pipeta 450 microliters de 95% de formamida.
Incubar por um minuto, repetindo duas vezes. Incubar por cinco minutos. Pipeta 450 microliters de XC3.
Incubar por um minuto e repetir. Nesta etapa, serão dispensados os seguintes reagentes, 250 microlitres de STM, 450 microlitres de XC3 e 250 microlitres de CAIXA ELETRÔNICO. Faça o seguinte esquema de repetição.
Depois de todas as repetições e incubações, coloque as microarrays em um rack de pé e mergulhe-as no recipiente de lavagem. Movendo-se lentamente e levemente com movimentos para cima e para baixo, 10 vezes. Seque as microarrays usando o desiccador de vácuo por 50 a 55 minutos.
Uma vez que as microarrays são secas, proceda à imagem da microarray com o scan. Nesta imagem, podemos ver todos os protocolos utilizados, desde a escolha dos participantes até o processamento dos arquivos IDAT obtidos no último dia do experimento de metilação. Os arquivos foram transferidos para o computador onde a análise bioinformática foi realizada.
A análise foi processada utilizando o R Studio e o pacote Bioconductor ChAMP. Certifique-se de ter pelo menos oito gigabytes de RAM no computador. Outras análises bioinformáticas, como o enriquecimento genético, foram realizadas para melhor apresentar os dados ao leitor.
Nesta tabela, observa-se os dois grupos utilizados neste estudo, obesos e não obesos. Houve diferença entre grupos para variáveis, índice de massa corporal, circunferência abdominal, massa gorda em quilogramas e massa gorda em porcentagem. Observando o esquema apresentado nesta figura, pudemos entender que o protocolo proposto era adequado para nossos dados.
E após a análise bioinformática, um total de 409.887 sondas foram apresentadas após a realização do filtro. O enredo de densidade revelou que todas as amostras tinham densidades semelhantes de distribuição beta. Nenhuma amostra foi excluída com base nessas análises.
A análise singular de decomposição de valor dos dados normalizados revelou que o IMC, o duplo C e a FM influenciaram significativamente a variabilidade dos dados de metilação do DNA. A estimativa do tipo celular revelou que ambas as células assassinas naturais, células NK e B eram mais elevadas em mulheres obesas. Os níveis de metilação de DNA entre mulheres obesas e não obesas foram diferentes antes e depois da correção do tipo celular.
Antes da correção, foram observadas 43.463 diferentes posições de metilação. E depois disso, 3.329 CPGs permaneceram significativamente. Um total de 162 CPGs foram hipometilados, e 576 foram hipermetilados em obesos em comparação com os não obesos.
Os dados estão disponíveis no banco de dados GEO sob o código de registro GSE166611. Apresentamos os locais de CPG associados às características específicas dos participantes observados em SVD. Para massa gorda, foram encontrados 13.222 locais de CPG.
Havia 6.159 CPGs relacionados à massa gorda na região promotora. 470 hipometilados e 94 hipermetilados. Os respectivos genes dos locais associados foram enriquecidos e agora são mostrados.
Observamos que o protocolo proposto é capaz de identificar dentro de seus padrões de metilação, e é certo se relacionar dentro de suas metilações. Nosso resultado confirma que um estilo de vida obesogênico pode promover mudanças epigenéticas no DNA humano.
