Name: basophil activation test for allergy diagnosis
Uploaded: 2021-05-31T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Basophil Activation Test for Allergy Diagnosis at JoVE.com

We bedanken Claudia Corazza voor haar onschatbare Engelse taalondersteuning. Dit werk werd ondersteund door het Instituut voor Gezondheid "Carlos III" (ISCIII) van het MINECO (subsidie medegefinancierd door het EFRO: "Una manera de hacer Europa"; Subsidies nrs. PI20/01715; PI18/00095; PI17/01410; PI17/01318; PI17/01237 en RETIC ARADYAL RD16/0006/0001; Andalusisch Regionaal Ministerie van Volksgezondheid (Subsidie nrs. PI-0127-2020, PIO-0176-2018; PE-0172-2018; PE-0039-2018; PC-0098-2017; PI-0075-2017; PI-0241-2016). ID is klinisch onderzoeker (B-0001-2017) en AA heeft een senior postdoctoraal contract (RH-0099-2020), beide ondersteund door het Andalusische regionale ministerie van Volksgezondheid (medegefinancierd door ESF: "Andalucía se mueve con Europa").

De uitvoering van het protocol werd uitgevoerd volgens de principes van de Verklaring van Helsinki en goedgekeurd door de lokale ethische commissie (Comité de Ética para la Investigación Provincial de Málaga, Spanje). Alle proefpersonen werden mondeling geïnformeerd over het onderzoek en ondertekenden het bijbehorende geïnformeerde toestemmingsformulier.
OPMERKING: Het huidige protocol beschrijft de BBT-procedure die de auteurs dagelijks gebruiken. Dit is echter geen gestandaard...

BBT is een aanvullende in vitro diagnostische test voor de evaluatie van IgE-gemedieerde allergische reacties die nuttig is gebleken bij de diagnose van reacties geïnduceerd door verschillende triggers zoals geneesmiddelen, voedsel of inhalatiemiddelen, evenals bij sommige vormen van chronische urticaria. In het algemeen moeten bbt-prestaties worden overwogen als i) het allergeen/geneesmiddel vals-positieve resultaten in ST oplevert; ii) het allergeen/geneesmiddel is niet beschikbaar om te worden gebruikt voor ...

De diagnose van IgE-gemedieerde allergie is gebaseerd op klinische geschiedenis, huidtests (ST's), kwantificering van serumspecifiek IgE (sIgE) en, indien vereist en geïndiceerd, gecontroleerde provocatietests (CCT's)1,2,3,4,5,6. De klinische geschiedenis kan echter onbetrouwbaar zijn, omdat er een gebrek aan nauwkeurige informatie kan zijn, en ST's en CCT's zijn geen risicovrije procedures die gecontra-indiceerd kunnen zijn bij proefpersonen die ernstige levensbedreigende reacties ervaren 1,2,3,4,5,6 . Deze kwesties, samen met het feit dat de bepaling van sIgE door gevalideerde en commerciële fluor-enzymimmunoassays slechts beschikbaar is voor enkele allergenen en geneesmiddelen, hebben de belangrijke rol van andere in vitro functionele assays zoals basofiele activeringstest (BBT) benadrukt.
Basofielen zijn belangrijke effectorcellen die betrokken zijn bij IgE-gemedieerde allergische reacties die worden geactiveerd bij cross-linking van aangrenzende sIgE gebonden aan hoge affiniteitsreceptoren (FcεRI) op het celoppervlak na blootstelling aan allergenen / geneesmiddelen. Basofiele activering veroorzaakt celdegranulatie en afgifte van voorgevormde en nieuwe gesynthetiseerde ontstekingsmediatoren in intracytoplasmatische secretiekorrels 7,8,9. BBT is een in vitro methode die de basofielactivatie probeert na te bootsen in aanwezigheid van een stimulus (allergeen of geneesmiddel) en veranderingen in de expressie van basofiele activeringsmarkers bepaalt door middel van flowcytometrie 7,10. Er zijn verschillende strategieën om basofielen te identificeren (IgE+, CCR3+, CRTH2+, CD203c+) en om celactivering te meten (voornamelijk upregulatie van CD63 en CD203c) met behulp van combinaties van fluorochroom-gelabelde antilichamen 7,10. CD63, de beste klinisch gevalideerde activeringsmarker 11,12,13,14, is een membraaneiwit verankerd in de secretoire korrels die histamine bevatten en dat, na celactivering en fusie van de korrels met het membraan, tot expressie komt op basofieloppervlak 15,16,17,18,19,20,21 . CD203c is een oppervlaktemarker die constitutief tot expressie komt op basofielen en wordt geupreguleerd na FcεRI-stimulatie, die ook betrouwbare resultaten heeft laten zien in BBT 15,22,23,24,25. Bovendien lijkt het samen te drukken met CD6326.
In de afgelopen decennia is aangetoond dat BBT nuttig is bij de diagnose van IgE-gemedieerde allergische reacties geïnduceerd door verschillende triggers zoals geneesmiddelen, voedsel of inhalatiemiddelen, evenals bij sommige vormen van chronische urticaria, zoals hieronder beschreven. De positie van deze techniek in de diagnostische algoritmen is echter zeer variabel en niet goed bepaald.
Overgevoeligheid voor geneesmiddelen BAT is nuttig gebleken als een aanvullende test voor geselecteerde geneesmiddelen en patiënten, met name voor degenen die ernstige reacties ervaren vanwege het feit dat de diagnostische waarde van ST niet goed is vastgesteld voor de meeste geneesmiddelen, omdat ze zijn gevalideerd en gestandaardiseerd voor een beperkt aantal geneesmiddelen 27,28,29,30. Bovendien is kwantificering van sIgE alleen beschikbaar voor een beperkt aantal geneesmiddelen, met een lagere gevoeligheid dan ST 27,28,29,30,31,32. Daarom is de diagnose van overgevoeligheid voor geneesmiddelen meestal afhankelijk van een provocatietest voor geneesmiddelen, die kan worden gecontra-indiceerd bij personen die ernstige levensbedreigende reacties ervaren33.
Veelbelovende resultaten zijn gemeld voor het gebruik van BBT bij geselecteerde patiënten die onmiddellijke overgevoeligheidsreacties op verschillende geneesmiddelen zoals betalactams (BLs)20,34,35,36,37,38,39, neuromusculaire blokkers (NMBAs)19,22,40,41,42, 43,44,45, fluoroquinolonen (FQ's)46,47,48,49, pyrazolonen 50,51,52, radiocontrast media (RCM)53,54,55,56, en platinaverbindingen 57,58,59 . Van BBT is gemeld dat het een sensitiviteit en specificiteit heeft tussen respectievelijk 51,7-66,9% en 89,2-97,8%; en positieve en negatieve voorspellende waarden worden beschreven tussen 93,4% en 66,3%, respectievelijk27,31. Bovendien is BAT voorgesteld als een voorspellende biomarker voor doorbraakreacties tijdens desensibilisatie met platinaverbindingen, aangezien de CD203c-expressie verhoogd is in vergelijking met CD63 bij patiënten met een hoog risico op bijwerkingen tijdens desensibilisatie van geneesmiddelen57.
Het is van belang dat BBT alleen nuttig is bij overgevoeligheid van geneesmiddelen wanneer de reactie basofiele degranulatie omvat; daarom is het niet nuttig bij reacties als gevolg van enzymatische remming van cyclooxygenase 142.
Voedselallergie BBT is naar voren gekomen als een potentieel diagnostisch instrument voor voedselallergie omdat de bepaling van serum-sIgE voor het gehele allergeenextract of afzonderlijke allergenen vaak dubbelzinnig is, waardoor orale voedseluitdaging nodig is om de diagnose te bevestigen, wat, net als overgevoeligheid van geneesmiddelen, een kostbare en niet risicovrije procedure is60. Verschillende studies hebben relevante resultaten aangetoond met koemelk61,62, ei61,63, tarwe 64,65,66,67,68, pinda 63,69,70,71,72, hazelnoot 73,74,75,76 ,77, schaaldieren78, perzik 79,80,81, appel 21, selderij en wortel82,83.
De belangrijkste toegevoegde waarde van BBT bij de diagnose van voedselallergie in vergelijking met ST's en sIgE in serum is dat het een hogere specificiteit en vergelijkbare gevoeligheid vertoont. BAT is dus een nuttig hulpmiddel om klinisch allergische patiënten te onderscheiden van gesensibiliseerde, maar tolerante proefpersonen met zowel een hoge specificiteit (75-100%) als gevoeligheid (77-98%)63,69,84. Gevoeligheids- en specificiteitswaarden zijn afhankelijk van het allergeen en andere factoren zoals fenotypen (bijv. Oraal allergiesyndroom versus anafylaxie), leeftijd en geografie-gerelateerde sensibilisatiepatronen63,85.
BBT met behulp van enkelvoudige allergeencomponenten kan mogelijk de diagnostische nauwkeurigheid voor sommige voedselallergenen verbeteren61,80. Er zijn studies met zaadopslageiwitten (bijv. Ara h 1, Ara h 2, Ara h 3 en Ara h 6 van pinda)86; lipide transfereiwitten (bv. Pru p 3 van perzik en Ara h 9 van pinda)80,86; en Bet v 1 homologen (bijv. Ara h 8 van pinda)87. Andere potentiële nutsvoorzieningen zijn gerelateerd aan de identificatie van het boosdoenerallergeen in gevallen van pollen-voedselallergiesyndroom 21,87,88, allergie voor rood vlees89 of voedselafhankelijke inspanningsgeïnduceerde anafylaxie66.
Interessant is dat BBT informatie kan geven over de ernst en de drempel van allergische reacties, aangezien patiënten met ernstigere reacties een groter aandeel geactiveerde basofielen vertonen, zoals waargenomen in studies met pinda- en koemelkallergische patiënten 84,90,91; en patiënten die reageren op sporenhoeveelheden van het allergeen vertonen een grotere basofielengevoeligheid 84,90,92. Deze gegevens suggereren dat BBT nuttig kan zijn om patiënten met een hoog risico op allergische aard te identificeren die nauwere follow-up en intensiever onderwijs nodig hebben93. Bovendien is gemeld dat BBT70,91,92,94 en drempelwaarden van reactiviteit90,95 kan voorspellen om te helpen bepalen wanneer voedsel veilig kan worden (her)geïntroduceerd84. Deze bevindingen zijn echter controversieel in sommige studies 63,96 en meer onderzoek is vereist.
Aan de andere kant is BBT gebruikt om de oplossing van voedselallergie te controleren, hetzij natuurlijk of onder immunomodulerende behandelingen, in de loop van de tijd, die tot nu toe alleen werd beoordeeld door orale voedseluitdaging, met de bijbehorende risico's en kosten 84,97,98,99,100,101,102,103,104,105,106 ,107.108. Bovendien is het ook gebruikt om het effect van omalizumab in voedselallergie te monitoren, aangezien basofiele activering afneemt tijdens de behandeling met omalizumab, maar het neemt toe na het staken van de behandeling109.
Inhalatieallergie BBT is zelden gunstig bij inhalatieallergie, omdat de diagnose routinematig kan worden vastgesteld door sIgE-kwantificering en ST. In gevallen van lokale allergische rhinitis (niet-detecteerbare niveaus van sIgE en negatieve ST's met positieve nasale provocatietests) heeft BAT echter in 50% van de gevallen de diagnose mogelijk gemaakt110. Er is verder een correlatie gemeld tussen basofiele gevoeligheid en respons op nasale / bronchiale provocatietests, evenals tussen de ernst van astma en de werkzaamheid van de behandeling met omalizumab111.112.
BBT is ook gebruikt om allergeenimmunotherapie voor huisstofmijt en pollen te controleren, aangezien de gevoeligheid voor basofielen afneemt tijdens immunotherapie, waarschijnlijk als gevolg van interferentie van blokkerende IgG-antilichamen 113.114.115.116.117.
Hymenopteragifallergie Diagnose van hymenoptera gifallergie is routinematig gebaseerd op ST en serum sIgE. BAT heeft een hoge sensitiviteit (85-100%) en specificiteit (83-100%) aangetoond en er is gemeld dat het nuttig is in gevallen die dubbelzinnige resultaten opleveren of bij patiënten met een suggestieve klinische geschiedenis van gifallergie maar niet-detecteerbare sIgE en negatieve ST118.119. BBT lijkt echter niet voorspellend te zijn voor de ernst van deze reacties120.121.
Tot 60% van de patiënten vertoont sIgE voor zowel wesp- als bijengif, en de identificatie van dominant allergeen is cruciaal voor een adequate immunotherapiebehandeling. In deze gevallen is gemeld dat BBT nuttig is bij de identificatie van het dominante allergeen 119.122.123.124. Hoewel sIgE voor de belangrijkste allergenen van bijen- en wespengif het nut van BBT kan verminderen bij patiënten met dubbele positiviteit voor beide gifstoffen, biedt het nuttige informatie, voornamelijk bij proefpersonen met negatieve resultaten in sIgE-bepalingen123.
Sommige studies suggereren dat BBT nuttig kan zijn als een voorspellende biomarker voor bijwerkingen tijdens de opbouwfase van gifimmunotherapie, omdat van deze behandelingsoptie is gemeld dat het de basofiele gevoeligheid vermindert. De reactiviteit neemt echter niet af en dit BAT-hulpprogramma is tegenwoordig controversieel 13.120.125.126.127.128.129.130.
Urticaria en angio-oedeem Een subgroep van chronische urticariapatiënten heeft een auto-immuun pathofysiologie, als gevolg van IgE-autoantilichamen voor autoallergenen en IgG-autoantilichamen die zich richten op FcεRI- of IgE-FcεRI-complexen die aanwezig zijn op het mestceloppervlak131.132. In de klinische praktijk is de diagnose van dit type chronische urticaria gebaseerd op positief autoloog serum ST, dat het risico op accidentele infectie heeft. BAT is voorgesteld als een in vitro test voor het diagnosticeren en monitoren van patiënten met vermoedelijke chronische urticaria. Zowel CD63- als CD203c-expressie op het oppervlak van basofielen is gemeld dat ze verhoogd zijn na stimulatie met sera van chronische urticariapatiënten, wat de detectie van actieve auto-antilichamen 133.134.135.136.137 aantoont. Onlangs is gemeld dat patiënten met een positieve BAT vaak de meest actieve ziektetoestand ervaren, beoordeeld op basis van de urticaria-activiteitsscore, en hogere doses antihistaminica nodig hebben samen met derdelijnsbehandelingen (ciclosporine A of omalizumab), vergeleken met die met negatieve BBT138.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, without Cap, Nonsterile</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC anti-human CD193 (CCR3) Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>310708</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSCalibur Flow Cytometer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC anti-human CD63 Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>353006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES (1 M)</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>15630106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysing Solution 10x concentrated</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>349202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Formyl-Met-Leu-Phe</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F3506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE anti-human CD203c (E-NPP3) Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>324606</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purified Mouse Anti-Human IgE</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555857</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human IL-3</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>203-IL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sheath Fluid</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>342003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S3014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TUBE 9 mL LH Lithium Heparin</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>455084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1379</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

basophil activation test for allergy diagnosis

De basofiele activeringstest (BAT) is een aanvullende in vitro diagnostische test die kan worden gebruikt naast klinische geschiedenis, huidtest (ST) en specifieke IgE (sIgE) bepaling bij de evaluatie van IgE-gemedieerde allergische reacties op voedsel, insectengif, geneesmiddelen en sommige vormen van chronische urticaria. De rol van deze techniek in de diagnostische algoritmen is echter zeer variabel en niet goed bepaald.
Bbt is gebaseerd op de bepaling van basofiele respons op allergeen/geneesmiddel cross-linking IgE-activering door de meting van activeringsmarkers (zoals CD63, CD203c) door middel van flowcytometrie. Deze test kan een nuttig en complementair hulpmiddel zijn om gecontroleerde provocatietests te vermijden om de diagnose allergie te bevestigen, vooral bij proefpersonen die ernstige levensbedreigende reacties ervaren. In het algemeen moet de prestatie van BBT worden overwogen als i) het allergeen/geneesmiddel vals-positieve resultaten in ST oplevert; ii) er is geen allergeen-/geneesmiddelbron om te gebruiken voor ST- of sIgE-bepaling; iii) er is discrepantie tussen de geschiedenis van de patiënt en ST- of sIgE-bepaling; iv) symptomen suggereren dat ST kan leiden tot systemische respons; v) voordat u een CCT overweegt om het boosdoener allergeen / medicijn te bevestigen. De belangrijkste beperkingen van de test houden verband met niet-optimale gevoeligheid, vooral bij medicijnallergie, de noodzaak om de test niet langer dan 24 uur na monsterextractie uit te voeren en het gebrek aan standaardisatie tussen laboratoria in termen van procedures, concentraties en celmarkers.

BBT uitgevoerd met allergenen of geneesmiddelen maakt onderzoek van IgE-afhankelijke overgevoeligheidsreacties mogelijk. Basofiele reactiviteit moet worden gemeten in ten minste twee optimale concentraties om de beste resultaten te verkrijgen34 en activering wordt gevisualiseerd door de upregulatie van CD63 op het celoppervlak. In het geval van allergenen moet bovendien, om de basofiele reactiviteit te bevestigen, de basofiele gevoeligheid worden geanalyseerd door de reactiviteit te meten bij meer...

Watch this Scientific Journal Video about Basophil Activation Test for Allergy Diagnosis at JoVE.com

Basophil Activation Test for Allergy Diagnosis

De basofiele activeringstest is een aanvullende in vitro diagnostische test voor de evaluatie van IgE-gemedieerde allergische reacties op basis van de detectie van basofiele activering in aanwezigheid van een specifieke stimulus door de meting van activeringsmarkers door flowcytometrie.

Basofiele activeringstest voor allergiediagnose

The basophil activation test (BAT) is a complementary in vitro diagnostic test that can be used in addition to clinical history, skin test (ST), and ...

De basofiele activeringstest is een aanvullende in vitro diagnostische test voor de evaluatie van IgE-gemedieerde allergische reacties die nuttig zijn gebleken voor reacties geïnduceerd door geneesmiddelen, voedsel of inhalatiemiddelen, evenals in sommige vormen van chronische urticaria. Deze test is gebaseerd op het bepalen van basofiele respons op een allergeen of geneesmiddel dat IgE-activering kruislings koppelt door de meting van activeringsmarkers door flowcytometrie. De basofiele activeringstest kan een nuttig en gratis hulpmiddel zijn om gecontroleerde provocatietests te vermijden om de allergiediagnose te bevestigen, vooral bij proefpersonen die ernstige levensbedreigende reacties ervaren.Bovendien heeft deze test het voordeel dat het de respons tegen elk medicijn of allergeen kan analyseren in vergelijking met andere in vitro methoden die alleen beschikbaar zijn voor een paar geneesmiddelen en allergenen. De belangrijkste beperkingen van de test zijn gerelateerd aan niet-optimale gevoeligheid, vooral bij medicijnallergie. De noodzaak om de test niet langer dan 24 uur na monsterextractie uit te voeren en het gebrek aan standaardisatie tussen laboratoria en diagnostische algoritmen.Begin met het verzamelen van perifeer bloed in negen milliliter gehepariniseerde buizen en plaats de monsters in een rotor om ze op kamertemperatuur te houden totdat ze nodig zijn voor het experimentele protocol. Label twee cytometerbuizen van vijf milliliter elk voor negatieve controle en positieve controle. Label ook elk één buis voor de verschillende allergenen- of medicijnconcentraties die worden getest.Plaats de buizen vervolgens in een rek zodat de buizen perfect passen zonder uit te glijden. Bereid voor de eerste positieve controle een vier micromolaire oplossing van N-Formylmethionyl-leucyl-fenylalanine of fMLP in 0,05% PBS-T Om de kwaliteit van basofielen te bevestigen. Voor de tweede positieve controle, bereid een 0,05 milligram per milliliter anti-IgE-oplossing met behulp van PBS-T.Bereid de kleuringsmix voor door één microliter ccr3-apc-, cd203c-pe- en cd63-fitc-antilichamen toe te voegen per 20 microliter van de stimulatiebuffer. Voeg vervolgens 23 microliter van deze kleuringsmix toe aan elke tube. Voeg 100 microliter PBS-T toe aan de negatieve controlebuizen.Voeg 100 microliter fMLP toe aan een van de positieve controlebuizen en voeg 100 microliter anti-IgE E toe aan de andere aan de rest van de buizen. Voeg 100 microliter van de verschillende allergenen- of medicijnconcentraties toe en incubeer gedurende 10 minuten bij 37 graden Celsius. Voeg na incubatie voorzichtig 100 microliter bloed toe aan elke buis om hemolyse te voorkomen.Draai vervolgens de buizen voorzichtig vortex en incubeer ze gedurende 25 minuten bij 37 graden Celsius in het thermostatische bad met gemiddelde agitatie. Houd de buisjes minstens vijf minuten op vier graden Celsius om de degranulatie te stoppen. Voeg aan elke buis twee milliliter lysingbuffer toe om de erytrocyten te lyseren.Vortex elke buis en incubeer vervolgens de buizen gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur. Centrifugeer de buizen bij 300 g bij vier graden Celsius gedurende vijf minuten. Gooi vervolgens het rek in de gootsteen om het supernatant te decanteren terwijl de cellen aan de onderkant van de buizen blijven.Voeg drie milliliter PBS-T toe aan elke buis om de cellen te wassen en de buizen te vortexen. Voer een tweede centrifugatieronde uit met dezelfde set parameters en decanteer het supernatant door het rek in de gootsteen te kantelen. Houd de monsters vervolgens op vier graden Celsius beschermd tegen licht tot flowcytometrie.Sluit de flowcytometer aan op de computersoftware en wacht tot de cytometer klaar is. Laad de sjabloon- en instrumentinstellingen zoals beschreven in het tekstmanuscript. Start het proces van monsterverwerving.Om geactiveerde basofielen te selecteren, moet u eerst de lymfocyten van de Side Scatter-Forward Scatter-plot afzetten. Vervolgens poort de basofielen uit de lymfocytenpopulatie als CCR3 + CD203c + cellen en verwerven ten minste 500 basofielen per buis. Stel de CD63-drempel in op ongeveer 2,5% met behulp van de negatieve controlebuizen en analyseer de monsters.IgE-afhankelijke overgevoeligheidsreacties werden onderzocht door een basofiele activeringstest of BAT uit te voeren met allergenen en geneesmiddelen. Basofiele gevoeligheid werd geanalyseerd door de reactiviteit te meten bij meerdere afnemende allergeenconcentraties die helpen bij het bepalen van de allergische concentratie die de respons van 50% basofielen of EC50 induceert. Eerst werden lymfocyten afgesloten van de zijverstrooiings-voorwaartse spreidingsgrafiek.Vervolgens werden basofielen uit de lymfocytenpopulatie verwijderd als CCR3 + CD203c + -cellen. Vervolgens werd een CCR3-CD63-plot gebruikt om basofiele activering te analyseren met behulp van CD63 als activeringsmarker voor twee geneesmiddelen en verschillende concentraties van een allergeen. De test wordt uitgevoerd met vers volbloed en mag niet langer dan 24 uur na bloedextractie worden uitgevoerd.De stimulus die in de test wordt gebruikt, mag geen hulpstoffen bevatten en de chemische kenmerken van de geneesmiddelen moeten worden overwogen. Andere aanvullende in vitro methoden voor de diagnose van IgE-gemedieerde allergische reacties, of de bepaling van sIgE, of de histamineafgiftetest.

basophil-activation-test-for-allergy-diagnosis

Research

JoVE Journal

Medicine

FISH for Pre-implantation Genetic Diagnosis

Pre-implantation genetic diagnosis (PGD) is an established alternative to pre-natal diagnosis, and involves selecting pre-implantation embryos from a cohort generated by assisted reproduction technology (ART). This selection may be required because of familial monogenic disease (e.g. cystic fibrosis), or because one partner carries a chromosome rearrangement (e.g. a two-way reciprocal translocation). PGD is available for couples who have had previous affected children, and/or in the case of chromosome rearrangements, recurrent miscarriages, or infertility. Oocytes aspirated following ovarian stimulation are fertilized by in vitro immersion in semen (IVF) or by intracytoplasmic injection of an individual spermatozoon (ICSI). Pre-implantation cleavage-stage embryos are biopsied, usually by the removal of a single cell on day 3 post-fertilization, and the biopsied cell is tested to establish the genetic status of the embryo. Fluorescence in situ hybridization (FISH) on the fixed nuclei of biopsied cells with target-specific DNA probes is the technique of choice to detect chromosome imbalance associated with chromosome rearrangements, and to select female embryos in families with X-linked disease for which there is no mutation-specific test. FISH has also been used to screen embryos for spontaneous chromosome aneuploidy (also known as PGS or PGD-AS) in order to try and improve the efficiency of assisted reproduction; however, the predictive value of this test using the spreading and FISH technique described here is likely to be unacceptably low in most people's hands and it is not recommended for routine clinical use. We describe the selection of suitable probes for single-cell FISH, spreading techniques for blastomere nuclei, and in situ hybridization and signal scoring, applied to PGD in a clinical setting.

This article describes the selection of suitable probes for single-cell FISH, spreading techniques for blastomere nuclei, and in situ hybridization and signal scoring, applied to pre-implantation genetic diagnosis (PGD) in a clinical setting.

FISH voor Pre-implantatie genetische diagnostiek

Pre-implantation genetic diagnosis (PGD) is an established alternative to pre-natal diagnosis, and involves selecting pre-implantation embryos from a ...

The Trier Social Stress Test Protocol for Inducing Psychological Stress

This article demonstrates a psychological stress protocol for use in a laboratory setting. Protocols that allow researchers to study the biological pathways of the stress response in health and disease are fundamental to the progress of research in stress and anxiety.1 Although numerous protocols exist for inducing stress response in the laboratory, many neglect to provide a naturalistic context or to incorporate aspects of social and psychological stress. Of psychological stress protocols, meta-analysis suggests that the Trier Social Stress Test (TSST) is the most useful and appropriate standardized protocol for studies of stress hormone reactivity.2 In the original description of the TSST, researchers sought to design and evaluate a procedure capable of inducing a reliable stress response in the majority of healthy volunteers.3 These researchers found elevations in heart rate, blood pressure and several endocrine stress markers in response to the TSST (a psychological stressor) compared to a saline injection (a physical stressor).3 Although the TSST has been modified to meet the needs of various research groups, it generally consists of a waiting period upon arrival, anticipatory speech preparation, speech performance, and verbal arithmetic performance periods, followed by one or more recovery periods. The TSST requires participants to prepare and deliver a speech, and verbally respond to a challenging arithmetic problem in the presence of a socially evaluative audience.3 Social evaluation and uncontrollability have been identified as key components of stress induction by the TSST.4 In use for over a decade, the goal of the TSST is to systematically induce a stress response in order to measure differences in reactivity, anxiety and activation of the hypothalamic-pituitary-adrenal (HPA) or sympathetic-adrenal-medullary (SAM) axis during the task.1 Researchers generally assess changes in self-reported anxiety, physiological measures (e.g. heart rate), and/or neuroendocrine indices (e.g. the stress hormone cortisol) in response to the TSST. Many investigators have adopted salivary sampling for stress markers such as cortisol and alpha-amylase (a marker of autonomic nervous system activation) as an alternative to blood sampling to reduce the confounding stress of blood-collection techniques. In addition to changes experienced by an individual completing the TSST, researchers can compare changes between different treatment groups (e.g. clinical versus healthy control samples) or the effectiveness of stress-reducing interventions.1

This article describes a protocol for inducing psychological stress in participants, which enables researchers to measure psychological, physiological and neuroendocrine responses to stress within single participants or between groups.

De Trier Social Stress Test Protocol voor het induceren van psychologische stress

This article demonstrates a psychological stress protocol for use in a laboratory setting.  Protocols that allow researchers to study the biological ...

Transabdominal Ultrasound for Pregnancy Diagnosis in Reeves' Muntjac Deer

Reeves' muntjac deer (Muntiacus reevesi) are a small cervid species native to southeast Asia, and are currently being investigated as a potential model of prion disease transmission and pathogenesis. Vertical transmission is an area of interest among researchers studying infectious diseases, including prion disease, and these investigations require efficient methods for evaluating the effects of maternal infection on reproductive performance. Ultrasonographic examination is a well-established tool for diagnosing pregnancy and assessing fetal health in many animal species1-7, including several species of farmed cervids8-19, however this technique has not been described in Reeves' muntjac deer. Here we describe the application of transabdominal ultrasound to detect pregnancy in muntjac does and to evaluate fetal growth and development throughout the gestational period. Using this procedure, pregnant animals were identified as early as 35 days following doe-buck pairing and this was an effective means to safely monitor the pregnancy at regular intervals. Future goals of this work will include establishing normal fetal measurement references for estimation of gestational age, determining sensitivity and specificity of the technique for diagnosing pregnancy at various stages of gestation, and identifying variations in fetal growth and development under different experimental conditions.

Transabdominal Ultrasound for Pregnancy Diagnosis in Reeves&#039; Muntjac Deer

Transabdominal ultrasound is described as an effective, noninvasive means for assessing reproductive status in Reeves' muntjac deer. These methods can be used to achieve early pregnancy diagnosis and to evaluate fetal viability. Future applications of this technique include estimation of gestational age and effects of maternal disease on fetal development.

Transabdominale echografie voor zwangerschapsdiagnose bij Reeves' Muntjac Deer

Reeves' muntjac deer (Muntiacus reevesi) are a small cervid species native to southeast Asia, and are currently being investigated as a potential model of ...

Diagnosis of Musculus Gastrocnemius Tightness - Key Factors for the Clinical Examination

Common foot and ankle pathologies have been linked to isolated Musculus gastrocnemius tightness (MGT). Various examination techniques have been described to assess MGT. Still, a standardized examination procedure is missing. Literature argues for weightbearing examination but the degree of knee flexion needed to eliminate the restraining effect of the M. gastrocnemius on ankle dorsiflexion (ADF) is unknown. This manuscript investigates the effect of knee flexion on ankle dorsiflexion and provides a detailed description of a standardized examination protocol. Examination on 20 healthy individuals revealed, that 20&#176; of knee flexion is sufficient to fully eliminate the influence of the M. gastrocnemius on ADF. This builds the prerequisite for a standardized examination for MGT. Non-weightbearing and weightbearing examination of ADF has to be conducted with the knee fully extended and at least 20&#176; flexed. Two investigators should conduct non-weightbearing testing with the subject in supine position. In order to obtain reliable results, the axis of the fibula should be marked. One examiner can conduct weightbearing examination with the subject in lunge stance. Isolated MGT is present if ADF is impaired with the knee fully extended and knee flexion results in a significant ADF increase. The herein presented standardized examination is the prerequisite for future studies aiming at establishing norm values.

Diagnosis of Musculus Gastrocnemius Tightness - Key Factors for the Clinical Examination

Isolated Musculus gastrocnemius tightness is a common cause for foot and ankle pathologies. Currently no standardized examination procedure exists. This manuscript demonstrates that 20 degree of knee flexion eliminates the restraining effect of the M. gastrocnemius on ankle dorsiflexion and presents a video description of a standardized examination protocol.

diagnose van<em&gt; Musculus Gastrocnemius</em&gt; Dichtheid - Belangrijke factoren voor het klinisch onderzoek

Common foot and ankle pathologies have been linked to isolated Musculus gastrocnemius tightness (MGT). Various examination techniques have been described ...

Hydra, a Computer-Based Platform for Aiding Clinicians in Cardiovascular Analysis and Diagnosis

Cardiovascular diseases (CVDs) are the leading cause of death throughout the world. The total risk of developing CVD is determined by the combined effect of different cardiovascular risk factors (e.g., diabetes, raised blood pressure, unhealthy diet, tobacco use, stress, etc.) that commonly coexist and act multiplicatively. Most CVDs can be prevented by an early identification of the highest risk factors and an appropriate treatment. The stratification of cardiovascular risk factors involves a wide range of parameters and tests that specialists use in their clinical practice. In addition to cardiovascular (CV) risk stratification, ambulatory blood pressure monitoring (ABPM) also provides relevant information for diagnostic and treatment purposes. This work presents a list of protocols based on the Hydra platform, a web-based system for clinical decision support which incorporates a set of functionalities and services that are required for complete cardiovascular analysis, risk assessment, early diagnosis, treatment and monitoring of patients over time. The program includes tools for inputting and managing comprehensive patient data, organized into different checkups to track the evolution over time. It also has a risk stratification tool to compute a CV risk factor based upon several risk stratification tables of reference. Additionally, the program includes a tool that incorporates ABPM analysis and allows the extraction of valuable information by monitoring blood pressure over a specific period of time. Finally, the reporting service summarizes the most relevant information in a set of reports that aid clinicians in their clinical decision-making process.

This article presents a protocol based on Hydra &#8212; a web-based system for clinical decision support that integrates a full and detailed set of functionalities and services required by physicians for complete cardiovascular analysis, risk assessment, early diagnosis, treatment, and monitoring over time.

Hydra, een Computer-Based Platform voor medeplichtigheid van clinici in cardiovasculaire analyse en diagnose

Cardiovascular diseases (CVDs) are the leading cause of death throughout the world. The total risk of developing CVD is determined by the combined effect ...

International Expert Consensus and Recommendations for Neonatal Pneumothorax Ultrasound Diagnosis and Ultrasound-guided Thoracentesis Procedure

Pneumothorax (PTX) represents accumulation of the air in the pleural space. A large or tension pneumothorax can collapse the lung and cause hemodynamic compromise, a life-threatening disorder. Traditionally, neonatal pneumothorax diagnosis has been based on clinical images, auscultation, transillumination, and chest X-ray findings. This approach may potentially lead to a delay in both diagnosis and treatment. The use of lung US in diagnosis of PTX together with US-guided thoracentesis results in earlier and more precise management. The recommendations presented in this publication are aimed at improving the application of lung US in guiding neonatal PTX diagnosis and management.

Pneumothorax is a common emergency and critical disease in newborn infants that needs rapid, clear diagnosis and timely treatment. Diagnosis and treatment based on chest X-rays are associated with delayed management and radiation damage. Lung ultrasound (US) provides useful guidance for rapid, accurate diagnosis and the precise thoracentesis of pneumothorax.

Internationale expert consensus en aanbevelingen voor neonatale Pneumothorax Echografie Diagnose en echografie-geleide Thoracentese Procedure

Pneumothorax (PTX) represents accumulation of the air in the pleural space. A large or tension pneumothorax can collapse the lung and cause hemodynamic ...

Diagnosis and Surgical Treatment of Human Brucellar Spondylodiscitis

Brucellar spondylodiscitis (BS) is the most prevalent and significant osteoarticular presentation of human Brucellosis, which is commonly manifested in pastoral communities. It is difficult to differentially diagnose and usually leads to irreversible neurologic deficits and spinal deformities. The initial diagnosis of BS is based on clinical findings and radiographic assessments, and the confirmed diagnosis should be established by the isolation of Brucella species from the blood and/or the standard tube agglutination test. Differential diagnosis of multifocal BS from either degenerative disc diseases or tuberculosis is especially highlighted. The surgical approach, either endoscopic or open, is demonstrated in detail, accompanied by radiographic evidence of structural compression or severe instability. Further, the crucial surgical steps, including single-stage transforaminal decompression, debridement, interbody fusion, and internal fixation, are explained. Moreover, perioperative care and postoperative rehabilitation are also addressed. Taken together, this clinical algorithm presents a practical guide that has yielded substantially satisfactory outcomes in the past decades, which can also be introduced for large-scale application to manage human BS, especially in endemic regions.

We describe a clinical algorithm, based on decades of front-line experience of diagnosis and surgical treatment of human Brucellar spondylodiscitis in the largest medical center of the China's Xinjiang Pastoral Area.

Diagnose en chirurgische behandeling van menselijke Brucellar Spondylodiscitis

Brucellar spondylodiscitis (BS) is the most prevalent and significant osteoarticular presentation of human Brucellosis, which is commonly manifested in ...

Testing Acetylcholine Followed by Adenosine for Invasive Diagnosis of Coronary Vasomotor Disorders

More than 50% of patients with signs and symptoms of myocardial ischemia undergoing coronary angiography have unobstructed coronary arteries. Coronary vasomotor disorders (impaired vasodilatation and/or enhanced vasoconstriction/spasm) represent important functional causes for such a clinical presentation. Although impaired vasodilatation may be assessed with non-invasive techniques such as positron emission tomography or cardiac magnetic resonance imaging, there is currently no reliable non-invasive technique for the diagnosis of coronary spasm available. Thus, invasive diagnostic procedures (IDP) have been developed for the diagnosis of coronary vasomotor disorders including spasm testing as well as assessment of coronary vasodilatation. The identification of the underlying type of disorder (so called endotype) allows the initiation of targeted pharmacological treatments. Despite the fact that such an approach is recommended by the current European Society of Cardiology guidelines for the management of chronic coronary syndromes based on the CorMicA study, comparability of results as well as multicenter trials are currently hampered by major differences in institutional protocols for coronary functional testing. This article describes a comprehensive IDP protocol including intracoronary acetylcholine provocation testing for diagnosis of epicardial/microvascular spasm, followed by Doppler wire-based assessment of coronary flow reserve (CFR) and hyperemic microvascular resistance (HMR) in search of coronary vasodilatory impairment.

Coronary vasomotion disorders represent frequent functional causes of angina in patients with unobstructed coronaries. The underlying mechanism of angina (endotype) in these patients can be determined by a comprehensive invasive diagnostic procedure based on acetylcholine provocation testing followed by Doppler-derived assessment of the coronary flow reserve and microvascular resistance.

Testen van acetylcholine gevolgd door adenosine voor invasieve diagnose van coronaire vasomotorische stoornissen

More than 50% of patients with signs and symptoms of myocardial ischemia undergoing coronary angiography have unobstructed coronary arteries. Coronary ...

Measurement of Myocardial Lactate Production for Diagnosis of Coronary Microvascular Spasm

In about a quarter of patients with angina and non-obstructive coronary arteries, no epicardial spasm is noted on coronary arteriography during an angina attack. Since the pressure-rate product is almost identical at rest and the onset of attack in those patients, the decrease in coronary blood flow rather than increased myocardial oxygen consumption is likely to explain myocardial ischemia, indicating a substantial involvement with coronary microvascular spasm (MVS). Myocardial lactate production, which could be defined as a negative myocardial lactate extraction ratio (ratio of the coronary arterial-venous difference in lactate concentration to arterial concentration), is considered indicative of objective evidence to support the emerging myocardial ischemia. Thus, monitoring of the myocardial lactate production and the emergence of chest pain and ischemic electrocardiographic changes during acetylcholine (ACh) provocation testing is of significant value for detecting the entity of MVS. Practically, 1 min after incremental doses of ACh (20, 50, and 100 &#956;g) are administered into the left coronary artery (LCA), paired samples of 1 mL of blood are collected from the LCA ostium and coronary sinus for measurement of lactate concentration by a calibrated automatic lactate analyzer. Then, the development of MVS could be confirmed by negative myocardial lactate extraction ratio despite the absence of angiographically demonstrable epicardial coronary spasm or before its occurrence throughout ACh provocation testing. In conclusion, assessment of myocardial lactate production is essential and valuable for the diagnosis of MVS.

Myocardial lactate production (coronary arterial-venous difference in serum lactate level) during coronary spasm provocation testing is considered as a highly sensitive marker that reflects acetylcholine-induced myocardial ischemia due to microvascular spasm. This article presents the procedures to assess myocardial lactate production for the diagnosis of coronary microvascular spasm.

Meting van myocardiale lactaatproductie voor diagnose van coronaire microvasculaire spasmen

In about a quarter of patients with angina and non-obstructive coronary arteries, no epicardial spasm is noted on coronary arteriography during an angina ...

High-speed Video Microscopy Analysis for First-line Diagnosis of Primary Ciliary Dyskinesia

Primary ciliary dyskinesia (PCD) is a congenital disorder predominantly inherited in an autosomal recessive trait. The disorder causes disturbance in the motion of cilia, leading to severe impairment of mucociliary clearance (MCC). If undiagnosed or diagnosed too late, the condition leads to the development of bronchiectasis and serious damage to the lungs in later life. Most of the methods for diagnosing PCD are time-consuming and demand extensive economic resources to establish them. High-speed video microscopy analysis (HSVMA) is the only diagnostic tool to visualize and analyze living respiratory cells with beating cilia in vitro. It is fast, cost-effective, and, in experienced hands, very reliable as a diagnostic tool for PCD. In addition, classical diagnostic measures such as transmission electron microscopy (TEM) are not applicable for some mutations as morphological changes are absent. 
This paper describes the process of collecting respiratory epithelial cells, the further preparation of the specimen, and the process of HSVMA. We also describe how brushed cells can be successfully kept unharmed and beating by keeping them in a nourishing medium for storage and transport to the investigation site in cases where a clinic does not possess the equipment to perform HSVMA. Also shown are videos with pathologic beating patterns from patients with a mutation in the dynein arm heavy chain 11 gene (DNAH11), which cannot be diagnosed with TEM; the result of an inconclusive HSVMA due to infection of the upper airways, as well as an unsuccessful brushing with superimposition of red blood cells. With this article, we would like to encourage every unit dealing with pulmonology patients and rare lung diseases to perform HSVMA as part of their daily routine diagnostics for PCD or send the specimens over to a center specializing in performing HSVMA.

High-speed video microscopy analysis is a relatively easy-to-perform, fast, cost-effective, and, in experienced hands, a considerably reliable tool for first-line diagnostics of primary ciliary dyskinesia, which should be available in every center involved in diagnostics and the treatment of severe lung diseases.

High-speed videomicroscopie-analyse voor eerstelijnsdiagnose van primaire ciliaire dyskinesie

Primary ciliary dyskinesia (PCD) is a congenital disorder predominantly inherited in an autosomal recessive trait. The disorder causes disturbance in the ...