Name: basophil activation test for allergy diagnosis
Uploaded: 2021-05-31T14:00:00
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Nous remercions Claudia Corazza pour son précieux soutien en anglais. Ce travail a été soutenu par l’Institut de Santé ''Carlos III'' (ISCIII) du MINECO (subvention cofinancée par le FEDER: « Una manera de hacer Europa »; Subventions n° PI20/01715; PI18/00095; PI17/01410; PI17/01318; PI17/01237 et RETIC ARADYAL RD16/0006/0001; Ministère régional andalou de la Santé (subventions nos PI-0127-2020, PIO-0176-2018; PE-0172-2018; PE-0039-2018; PC-0098-2017; PI-0075-2017; PI-0241-2016). ID est chercheur clinique (B-0001-2017) et AA détient un contrat postdoctoral senior (RH-0099-2020), tous deux soutenus par le ministère régional de la Santé d’Andalousie (cofinancé par ESF: « Andalucía se mueve con Europa »).

L’exécution du protocole a été menée conformément aux principes de la Déclaration d’Helsinki et approuvée par le Comité d’éthique local (Comité de Ética para la Investigación Provincial de Málaga, Espagne). Tous les sujets ont été informés oralement de l’étude de recherche et ils ont signé le formulaire de consentement éclairé correspondant.
NOTE: Le présent protocole détaille la procédure MTD que les auteurs utilisent quotidiennement. Cependant, il ne s...

La MTD est un test de diagnostic in vitro complémentaire pour l’évaluation des réactions allergiques médiées par les IgE qui s’est avéré utile dans le diagnostic des réactions induites par différents déclencheurs tels que les médicaments, les aliments ou les inhalants, ainsi que dans certaines formes d’urticaire chronique. En général, la performance des MTD devrait être prise en compte si i) l’allergène/médicament produit des résultats faussement positifs dans le ST; ii) l’allergène o...

Le diagnostic d’allergie médiée par les IgE est basé sur les antécédents cliniques, les tests cutanés (ST), la quantification des IgE spécifiques du sérum (IgE) et, si cela est nécessaire et indiqué, les tests de provocation contrôlée (ECC)1,2,3,4,5,6. Cependant, les antécédents cliniques peuvent être peu fiables car il peut y avoir un manque d’informations précises, et les ST et les ECC ne sont pas des procédures sans risque qui peuvent être contre-indiquées chez les sujets présentant des réactions graves mettant la vie en danger 1,2,3,4,5,6 . Ces problèmes, ainsi que le fait que la détermination des sIgE par des immunoessais immunozymatiques validés et commerciaux n’est disponible que pour quelques allergènes et médicaments, ont mis en évidence le rôle important d’autres tests fonctionnels in vitro tels que le test d’activation des basophiles (MTD).
Les basophiles sont des cellules effectrices clés impliquées dans les réactions allergiques médiées par les IgE qui sont activées lors de la réticulation des IgE adjacentes liées aux récepteurs de haute affinité (FcεRI) à la surface des cellules après une exposition à un allergène / médicament. L’activation des basophiles déclenche la dégranulation cellulaire et la libération de médiateurs inflammatoires préformés et nouveaux synthétisés contenus dans les granules de sécrétion intracytoplasmique 7,8,9. La MTD est une méthode in vitro qui tente d’imiter l’activation des basophiles en présence d’un stimulus (allergène ou médicament) et détermine les changements dans l’expression des marqueurs d’activation des basophiles par cytométriede flux 7,10. Il existe différentes stratégies pour identifier les basophiles (IgE+, CCR3+, CRTH2+, CD203c+) et pour mesurer l’activation cellulaire (principalement la régulation positive de CD63 et CD203c) à l’aide de combinaisons d’anticorps marqués au fluorochrome 7,10. CD63, le meilleur marqueur d’activationvalidé cliniquement 11,12,13,14, est une protéine membranaire ancrée aux granules sécrétoires contenant de l’histamine qui, après activation cellulaire et fusion des granules avec la membrane, est exprimée à la surface des basophiles 15,16,17,18,19,20,21 . CD203c est un marqueur de surface qui est exprimé de manière constitutive sur les basophiles et régulé à la hausse après stimulation FcεRI, qui a également montré des résultats fiables dans BAT 15,22,23,24,25. En outre, il semble co-exprimer avec CD6326.
Au cours des dernières décennies, la MTD s’est révélée utile dans le diagnostic des réactions allergiques médiées par les IgE induites par différents déclencheurs tels que les médicaments, les aliments ou les inhalants, ainsi que dans certaines formes d’urticaire chronique, comme décrit ci-dessous. Cependant, la position de cette technique dans les algorithmes de diagnostic est très variable et mal déterminée.
Hypersensibilité aux médicaments La MTD s’est révélée utile comme test complémentaire pour certains médicaments et patients, en particulier pour ceux qui présentent des réactions graves en raison du fait que la valeur diagnostique du ST n’est pas bien établie pour la plupart des médicaments, car elle est validée et normalisée pour un nombre limité de médicaments27,28,29,30. De plus, la quantification des IgE n’est disponible que pour un nombre limité de médicaments, avec une sensibilité inférieure à ST 27,28,29,30,31,32. Par conséquent, le diagnostic d’hypersensibilité aux médicaments repose généralement sur un test de provocation médicamenteuse, qui peut être contre-indiqué chez les sujets présentant des réactions graves mettant la vieen danger 33.
Des résultats prometteurs ont été rapportés pour l’utilisation de la MTD chez certains patients signalant des réactions d’hypersensibilité immédiate à différents médicaments tels que les bêtalactamines (BL)20,34,35,36,37,38,39, les agents bloquants neuromusculaires (AMNM)19,22,40,41,42, 43,44,45, fluoroquinolones (FQs)46,47,48,49, pyrazolones 50,51,52, produits de contraste radioactif (RCM)53,54,55,56 et composés du platine57,58,59 . On a signalé que la sensibilité et la spécificité des MTD se situaient entre 51,7 et 66,9 % et entre 89,2 et 97,8 %, respectivement; et les valeurs prédictives positives et négatives sont décrites comme variant entre 93,4 % et 66,3 %, respectivement27,31. De plus, la MTD a été proposée comme biomarqueur prédictif des réactions paroxystiques lors de la désensibilisation avec les composés du platine, car l’expression de CD203c est augmentée par rapport à CD63 chez les patients présentant un risque élevé d’effets indésirables lors de la désensibilisation au médicament57.
Il est à noter que la MTD n’est utile dans l’hypersensibilité aux médicaments que lorsque la réaction implique une dégranulation des basophiles; Par conséquent, il n’est pas utile dans les réactions résultant de l’inhibition enzymatique de la cyclooxygénase 142.
Allergie alimentaire La MTD est apparue comme un outil de diagnostic potentiel pour les allergies alimentaires parce que la détermination des IgE sériques dans l’extrait d’allergène entier ou dans un allergène unique est souvent ambiguë, nécessitant une provocation alimentaire orale pour confirmer le diagnostic, ce qui, à l’instar de l’hypersensibilité aux médicaments, est une procédure coûteuse et non sans risque60. Plusieurs études ont montré des résultats pertinents avec le lait de vache 61,62, l’œuf61,63, le blé 64,65,66,67,68, l’arachide 63,69,70,71,72, la noisette 73,74,75,76 ,77, crustacés78, pêches 79,80,81, pomme21, céleri et carotte82,83.
La principale valeur ajoutée des MTD dans le diagnostic des allergies alimentaires par rapport aux ST et aux IgE dans le sérum est qu’elles présentent une spécificité plus élevée et une sensibilité similaire. Ainsi, la MTD est un outil utile pour différencier les patients cliniquement allergiques des sujets sensibilisés, mais tolérants, qui ont à la fois une spécificité élevée (75-100%) et une sensibilité (77-98%)63,69,84. Les valeurs de sensibilité et de spécificité dépendent de l’allergène et d’autres facteurs comme les phénotypes (p. ex. syndrome d’allergie orale par rapport à l’anaphylaxie), l’âge et les profils de sensibilisation liés à la géographie63,85.
Les MTD utilisant des composants allergènes uniques peuvent potentiellement améliorer la précision diagnostique de certains allergènes alimentaires61,80. Des études utilisent des protéines d’entreposage des semences (p. ex. Ara h 1, Ara h 2, Ara h 3 et Ara h 6 de l’arachide)86; protéines de transfert lipidique (p. ex. Pru p 3 de la pêche et Ara h 9 de l’arachide)80,86; et les homologues Bet v 1 (par exemple, Ara h 8 de l’arachide)87. D’autres utilités potentielles sont liées à l’identification de l’allergène coupable dans les cas de syndrome d’allergie pollen-alimentaire 21,87,88, d’allergie à la viande rouge 89 ou d’anaphylaxie induite par l’exercice alimentaire66.
Fait intéressant, la MTD peut fournir des informations sur la gravité et le seuil des réactions allergiques puisque les patients présentant des réactions plus graves présentent une plus grande proportion de basophiles activés, comme l’ont observé des études sur des patients allergiques aux arachides et au lait de vache 84,90,91; et les patients réagissant à des traces de l’allergène montrent une plus grande sensibilité aux basophiles 84,90,92. Ces données suggèrent que la MTD pourrait être utile pour identifier les patients allergiques à haut risque qui nécessitent un suivi plus étroit et une éducation plus intensive93. En outre, il a été rapporté que les MTD peuvent prédire les réponses de provocation alimentaire 70,91,92,94 et les seuils de réactivité90,95 pour aider à déterminer quand les aliments peuvent être (ré)introduits en toute sécurité 84. Cependant, ces résultats sont controversés dans certaines études 63,96 et d’autres recherches sont nécessaires.
D’autre part, la MTD a été utilisée pour surveiller la résolution de l’allergie alimentaire, soit naturellement, soit sous traitement immunomodulateur, au fil du temps, qui jusqu’à présent n’a été évaluée que par provocation alimentaire orale, avec les risques et les coûts associés 84,97,98,99,100,101,102,103,104,105,106 ,107 108. De plus, il a également été utilisé pour surveiller l’effet de l’omalizumab dans les allergies alimentaires, car l’activation des basophiles diminue pendant le traitement par omalizumab, mais elle augmente après l’arrêt du traitement109.
Allergie aux inhalants La MTD est rarement bénéfique dans l’allergie aux inhalants, car le diagnostic peut être systématiquement établi par quantification des IgE et ST. Cependant, dans les cas de rhinite allergique locale (taux indétectables d’IgE et de ST négatifs avec tests de provocation nasale positifs), la MTD a permis le diagnostic dans 50% des cas110. Il a également été rapporté une corrélation entre la sensibilité basophile et la réponse aux tests de provocation nasale / bronchique, ainsi qu’entre la gravité de l’asthme et l’efficacité du traitement par omalizumab111,112.
La MTD a également été utilisée pour surveiller l’immunothérapie allergénique pour les acariens et les pollens, car la sensibilité aux basophiles diminue pendant l’immunothérapie, probablement en raison de l’interférence des anticorps IgGbloquants 113,114,115,116,117.
Allergie au venin d’hyménoptère Le diagnostic de l’allergie au venin d’hyménoptère est systématiquement basé sur les ST et les IgE sériques. La MTD a montré une sensibilité élevée (85-100%) et une spécificité (83-100%) et elle a été rapportée utile dans les cas qui donnent des résultats équivoques ou chez les patients ayant des antécédents cliniques suggestifs d’allergie au venin mais des IgE indétectables et ST118,119 négatives. Cependant, les MTD ne semblent pas être prédictives de la gravité de ces réactions 120 121.
Jusqu’à 60% des patients présentent des IgE à la fois au venin de guêpe et d’abeille, et l’identification de l’allergène dominant est cruciale pour un traitement immunothérapeutique adéquat. Dans ces cas, la MTD a été jugée utile dans l’identification de l’allergène dominant119 122 123 124. Bien que les sIgE aux principaux allergènes des venins d’abeilles et de guêpes puissent réduire l’utilité de la MTD chez les patients présentant une double positivité aux deux venins, elle fournit des informations utiles principalement chez les sujets présentant des résultats négatifs dans les déterminations d’IgE123.
Certaines études suggèrent que la MTD pourrait être utile comme biomarqueur prédictif des effets secondaires pendant la phase d’accumulation de l’immunothérapie au venin, car il a été rapporté que cette option de traitement diminuait la sensibilité aux basophiles. Cependant, la réactivité ne diminue pas et cette utilité BAT est aujourd’hui controversée13 120 125 126 127 128 129 130.
Urticaire et œdème de Quincke Un sous-ensemble de patients atteints d’urticaire chronique ont une physiopathologie auto-inmanne, due aux autoanticorps IgE dirigés contre les autoallergènes et aux autoanticorps IgG qui ciblent les complexes FcεRI ou IgE-FcεRI présents à la surface des mastocytes 131 132. En pratique clinique, le diagnostic de ce type d’urticaire chronique repose sur le ST autologue positif, qui présente un risque d’infection accidentelle. La MTD a été proposée comme test in vitro pour le diagnostic et le suivi des patients suspectés d’urticaire chronique. L’expression de CD63 et CD203c à la surface des basophiles a été signalée comme étant augmentée après stimulation avec des sérums de patients atteints d’urticaire chronique, montrant la détection d’autoanticorps actifs 133,134,135,136,137. Récemment, il a été rapporté que les patients atteints de MTD positive éprouvent souvent l’état pathologique le plus actif, évalué par le score d’activité de l’urticaire, et nécessitent des doses plus élevées d’antihistaminiques associés à des traitements de troisième intention (cyclosporine A ou omalizumab), par rapport à ceux ayant une MTD138 négative.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, without Cap, Nonsterile</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC anti-human CD193 (CCR3) Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>310708</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSCalibur Flow Cytometer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC anti-human CD63 Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>353006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES (1 M)</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>15630106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysing Solution 10x concentrated</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>349202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Formyl-Met-Leu-Phe</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F3506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE anti-human CD203c (E-NPP3) Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>324606</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purified Mouse Anti-Human IgE</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555857</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human IL-3</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>203-IL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sheath Fluid</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>342003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S3014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TUBE 9 mL LH Lithium Heparin</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>455084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1379</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

basophil activation test for allergy diagnosis

Le test d’activation des basophiles (MTD) est un test diagnostique in vitro complémentaire qui peut être utilisé en plus des antécédents cliniques, du test cutané (ST) et de la détermination des IgE spécifiques (IgE) dans l’évaluation des réactions allergiques médiées par les IgE aux aliments, au venin d’insecte, aux médicaments, ainsi qu’à certaines formes d’urticaire chronique. Cependant, le rôle de cette technique dans les algorithmes de diagnostic est très variable et mal déterminé.
La MTD est basée sur la détermination de la réponse basophile à l’activation des IgE de réticulation allergène/médicament par la mesure de marqueurs d’activation (tels que CD63, CD203c) par cytométrie en flux. Ce test peut être un outil utile et complémentaire pour éviter les tests de provocation contrôlés afin de confirmer le diagnostic d’allergie, en particulier chez les sujets présentant des réactions graves mettant la vie en danger. En général, l’efficacité de la MTD doit être prise en compte si i) l’allergène/médicament produit des résultats faussement positifs dans le ST; ii) il n’y a pas de source d’allergène/médicament à utiliser pour la détermination des ST ou des IgE; iii) il existe une discordance entre les antécédents du patient et la détermination des ST ou des IgE; iv) les symptômes suggèrent que le ST peut entraîner une réponse systémique; v) avant d’envisager un ECC pour confirmer l’allergène ou le médicament coupable. Les principales limites du test sont liées à une sensibilité non optimale, en particulier en cas d’allergie médicamenteuse, à la nécessité d’effectuer le test au plus tard 24 heures après l’extraction de l’échantillon et au manque de normalisation entre les laboratoires en termes de procédures, de concentrations et de marqueurs cellulaires.

La MTD réalisée avec des allergènes ou des médicaments permet d’étudier les réactions d’hypersensibilité dépendantes des IgE. La réactivité basophile doit être mesurée à au moins deux concentrations optimales afin d’obtenir les meilleurs résultats34 et l’activation est visualisée par la régulation positive de CD63 à la surface de la cellule. Dans le cas des allergènes, de plus, pour confirmer la réactivité des basophiles, la sensibilité des basophiles doit être analys...

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Basophil Activation Test for Allergy Diagnosis

Le test d’activation des basophiles est un test de diagnostic in vitro complémentaire pour l’évaluation des réactions allergiques médiées par les IgE basé sur la détection de l’activation des basophiles en présence d’un stimulus spécifique par la mesure des marqueurs d’activation par cytométrie en flux.

Test d’activation basophile pour le diagnostic des allergies

The basophil activation test (BAT) is a complementary in vitro diagnostic test that can be used in addition to clinical history, skin test (ST), and ...

Le test d’activation des basophiles est un test de diagnostic in vitro complémentaire pour l’évaluation des réactions allergiques médiées par les IgE qui se sont révélées utiles pour les réactions induites par des médicaments, des aliments ou des inhalants, ainsi que dans certaines formes d’urticaire chronique. Ce test est basé sur la détermination de la réponse basophile à un allergène ou à un médicament réticulant l’activation des IgE par la mesure des marqueurs d’activation par cytométrie de flux. Le test d’activation des basophiles peut être un outil utile et complémentaire pour éviter les tests de provocation contrôlés afin de confirmer le diagnostic d’allergie, en particulier chez les sujets présentant des réactions graves mettant la vie en danger.De plus, ce test a l’avantage de pouvoir analyser la réponse contre n’importe quel médicament ou allergène par rapport à d’autres méthodes in vitro qui ne sont disponibles que pour quelques médicaments et allergènes. Les principales limites du test sont liées à une sensibilité non optimale, en particulier dans l’allergie médicamenteuse. La nécessité d’effectuer le test au plus tard 24 heures après l’extraction de l’échantillon et le manque de normalisation entre les laboratoires et les algorithmes de diagnostic.Commencez par recueillir le sang périphérique dans des tubes héparinisés de neuf millilitres et placez les échantillons dans un rotor pour les maintenir à température ambiante jusqu’à ce qu’ils soient requis pour le protocole expérimental. Étiquetez deux tubes de cytomètre de cinq millilitres chacun pour le contrôle négatif et le contrôle positif. Étiquetez également un tube chacun pour les différentes concentrations d’allergènes ou de médicaments testés.Placez ensuite les tubes dans une grille afin qu’ils s’adaptent parfaitement sans glisser. Pour le premier contrôle positif, préparer une solution à quatre micromolaires de N-Formylméthionyl-leucyl-phénylalanine ou fMLP dans 0,05% PBS-T Pour confirmer la qualité des basophiles. Pour le deuxième témoin positif, préparer une solution anti-IgE de 0,05 milligramme par millilitre en utilisant PBS-T.Préparez le mélange de coloration en ajoutant un microlitre chacun d’anticorps CCR3-APC, CD203c-PE et CD63-FITC par 20 microlitres du tampon de stimulation. Ajoutez ensuite 23 microlitres de ce mélange de coloration à chaque tube. Ajouter 100 microlitres de PBS-T aux tubes de contrôle négatif.Ajouter 100 microlitres de fMLP à l’un des tubes de contrôle positif et ajouter 100 microlitres d’anti-IgE E à l’autre au reste des tubes. Ajouter 100 microlitres des différentes concentrations d’allergènes ou de médicaments et incuber à 37 degrés Celsius pendant 10 minutes. Après l’incubation, ajoutez doucement 100 microlitres de sang dans chaque tube pour éviter l’hémolyse.Ensuite, tourbillonnez doucement les tubes et incuberez-les pendant 25 minutes à 37 degrés Celsius dans le bain thermostatique à agitation moyenne. Gardez les tubes à quatre degrés Celsius pendant au moins cinq minutes pour arrêter la dégranulation. À chaque tube, ajoutez deux millilitres de tampon de lyse pour lyser les érythrocytes.Vortex chaque tube, puis incuber les tubes pendant cinq minutes à température ambiante. Centrifuger les tubes à 300 g à quatre degrés Celsius pendant cinq minutes. Ensuite, renversez le rack dans l’évier pour décanter le surnageant pendant que les cellules restent au fond des tubes.Ajoutez trois millilitres de PBS-T à chaque tube pour laver les cellules et vortex les tubes. Effectuez un deuxième cycle de centrifugation en utilisant le même ensemble de paramètres et décantez le surnageant en renversant le rack dans l’évier. Ensuite, conservez les échantillons à quatre degrés Celsius à l’abri de la lumière jusqu’à la cytométrie en flux.Connectez le cytomètre en flux au logiciel informatique et attendez que le cytomètre soit prêt. Chargez les paramètres du modèle et de l’instrument comme décrit dans le manuscrit texte. Démarrez le processus d’acquisition d’échantillons.Pour sélectionner les basophiles activés, commencez par ouvrir les lymphocytes à partir du diagramme de diffusion latérale. Ensuite, les basophiles de la population lymphocytaire sont des cellules CCR3 + CD203c + et acquièrent au moins 500 basophiles par tube. Régler le seuil CD63 à environ 2,5 % à l’aide des tubes témoins négatifs et analyser les échantillons.Les réactions d’hypersensibilité dépendantes des IgE ont été étudiées en effectuant un test d’activation des basophiles, ou MTD, à l’aide d’allergènes et de médicaments. La sensibilité aux basophiles a été analysée en mesurant la réactivité à plusieurs concentrations décroissantes d’allergènes qui aident à déterminer la concentration allergique qui induit la réponse de 50% de basophiles ou de CE50. Tout d’abord, les lymphocytes ont été fermés à partir du diagramme de dispersion latérale vers l’avant.Ensuite, les basophiles ont été exclus de la population lymphocytaire sous forme de cellules CCR3 + CD203c +. Ensuite, un diagramme CCR3-CD63 a été utilisé pour analyser l’activation basophile en utilisant CD63 comme marqueur d’activation pour deux médicaments et différentes concentrations d’un allergène. Le test est effectué avec du sang total frais et doit être effectué au plus tard 24 heures après l’extraction du sang.Le stimulus utilisé dans le test ne doit pas inclure d’excipients et les caractéristiques chimiques des médicaments doivent être prises en compte. Autres méthodes in vitro supplémentaires pour le diagnostic des réactions allergiques médiées par les IgE, ou la détermination des IgE, ou le test de libération d’histamine.

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Research

JoVE Journal

Medicine

FISH for Pre-implantation Genetic Diagnosis

Pre-implantation genetic diagnosis (PGD) is an established alternative to pre-natal diagnosis, and involves selecting pre-implantation embryos from a cohort generated by assisted reproduction technology (ART). This selection may be required because of familial monogenic disease (e.g. cystic fibrosis), or because one partner carries a chromosome rearrangement (e.g. a two-way reciprocal translocation). PGD is available for couples who have had previous affected children, and/or in the case of chromosome rearrangements, recurrent miscarriages, or infertility. Oocytes aspirated following ovarian stimulation are fertilized by in vitro immersion in semen (IVF) or by intracytoplasmic injection of an individual spermatozoon (ICSI). Pre-implantation cleavage-stage embryos are biopsied, usually by the removal of a single cell on day 3 post-fertilization, and the biopsied cell is tested to establish the genetic status of the embryo. Fluorescence in situ hybridization (FISH) on the fixed nuclei of biopsied cells with target-specific DNA probes is the technique of choice to detect chromosome imbalance associated with chromosome rearrangements, and to select female embryos in families with X-linked disease for which there is no mutation-specific test. FISH has also been used to screen embryos for spontaneous chromosome aneuploidy (also known as PGS or PGD-AS) in order to try and improve the efficiency of assisted reproduction; however, the predictive value of this test using the spreading and FISH technique described here is likely to be unacceptably low in most people's hands and it is not recommended for routine clinical use. We describe the selection of suitable probes for single-cell FISH, spreading techniques for blastomere nuclei, and in situ hybridization and signal scoring, applied to PGD in a clinical setting.

This article describes the selection of suitable probes for single-cell FISH, spreading techniques for blastomere nuclei, and in situ hybridization and signal scoring, applied to pre-implantation genetic diagnosis (PGD) in a clinical setting.

FISH pour le diagnostic préimplantatoire génétique

Pre-implantation genetic diagnosis (PGD) is an established alternative to pre-natal diagnosis, and involves selecting pre-implantation embryos from a ...

Recherche

Médecine

The Trier Social Stress Test Protocol for Inducing Psychological Stress

This article demonstrates a psychological stress protocol for use in a laboratory setting. Protocols that allow researchers to study the biological pathways of the stress response in health and disease are fundamental to the progress of research in stress and anxiety.1 Although numerous protocols exist for inducing stress response in the laboratory, many neglect to provide a naturalistic context or to incorporate aspects of social and psychological stress. Of psychological stress protocols, meta-analysis suggests that the Trier Social Stress Test (TSST) is the most useful and appropriate standardized protocol for studies of stress hormone reactivity.2 In the original description of the TSST, researchers sought to design and evaluate a procedure capable of inducing a reliable stress response in the majority of healthy volunteers.3 These researchers found elevations in heart rate, blood pressure and several endocrine stress markers in response to the TSST (a psychological stressor) compared to a saline injection (a physical stressor).3 Although the TSST has been modified to meet the needs of various research groups, it generally consists of a waiting period upon arrival, anticipatory speech preparation, speech performance, and verbal arithmetic performance periods, followed by one or more recovery periods. The TSST requires participants to prepare and deliver a speech, and verbally respond to a challenging arithmetic problem in the presence of a socially evaluative audience.3 Social evaluation and uncontrollability have been identified as key components of stress induction by the TSST.4 In use for over a decade, the goal of the TSST is to systematically induce a stress response in order to measure differences in reactivity, anxiety and activation of the hypothalamic-pituitary-adrenal (HPA) or sympathetic-adrenal-medullary (SAM) axis during the task.1 Researchers generally assess changes in self-reported anxiety, physiological measures (e.g. heart rate), and/or neuroendocrine indices (e.g. the stress hormone cortisol) in response to the TSST. Many investigators have adopted salivary sampling for stress markers such as cortisol and alpha-amylase (a marker of autonomic nervous system activation) as an alternative to blood sampling to reduce the confounding stress of blood-collection techniques. In addition to changes experienced by an individual completing the TSST, researchers can compare changes between different treatment groups (e.g. clinical versus healthy control samples) or the effectiveness of stress-reducing interventions.1

This article describes a protocol for inducing psychological stress in participants, which enables researchers to measure psychological, physiological and neuroendocrine responses to stress within single participants or between groups.

Le protocole social Trèves Stress Test pour induire un stress psychologique

This article demonstrates a psychological stress protocol for use in a laboratory setting.  Protocols that allow researchers to study the biological ...

Transabdominal Ultrasound for Pregnancy Diagnosis in Reeves' Muntjac Deer

Reeves' muntjac deer (Muntiacus reevesi) are a small cervid species native to southeast Asia, and are currently being investigated as a potential model of prion disease transmission and pathogenesis. Vertical transmission is an area of interest among researchers studying infectious diseases, including prion disease, and these investigations require efficient methods for evaluating the effects of maternal infection on reproductive performance. Ultrasonographic examination is a well-established tool for diagnosing pregnancy and assessing fetal health in many animal species1-7, including several species of farmed cervids8-19, however this technique has not been described in Reeves' muntjac deer. Here we describe the application of transabdominal ultrasound to detect pregnancy in muntjac does and to evaluate fetal growth and development throughout the gestational period. Using this procedure, pregnant animals were identified as early as 35 days following doe-buck pairing and this was an effective means to safely monitor the pregnancy at regular intervals. Future goals of this work will include establishing normal fetal measurement references for estimation of gestational age, determining sensitivity and specificity of the technique for diagnosing pregnancy at various stages of gestation, and identifying variations in fetal growth and development under different experimental conditions.

Transabdominal Ultrasound for Pregnancy Diagnosis in Reeves&#039; Muntjac Deer

Transabdominal ultrasound is described as an effective, noninvasive means for assessing reproductive status in Reeves' muntjac deer. These methods can be used to achieve early pregnancy diagnosis and to evaluate fetal viability. Future applications of this technique include estimation of gestational age and effects of maternal disease on fetal development.

Échographie transabdominale pour le diagnostic de grossesse chez le cerf muntjac de Reeves

Reeves' muntjac deer (Muntiacus reevesi) are a small cervid species native to southeast Asia, and are currently being investigated as a potential model of ...

Diagnosis of Musculus Gastrocnemius Tightness - Key Factors for the Clinical Examination

Common foot and ankle pathologies have been linked to isolated Musculus gastrocnemius tightness (MGT). Various examination techniques have been described to assess MGT. Still, a standardized examination procedure is missing. Literature argues for weightbearing examination but the degree of knee flexion needed to eliminate the restraining effect of the M. gastrocnemius on ankle dorsiflexion (ADF) is unknown. This manuscript investigates the effect of knee flexion on ankle dorsiflexion and provides a detailed description of a standardized examination protocol. Examination on 20 healthy individuals revealed, that 20&#176; of knee flexion is sufficient to fully eliminate the influence of the M. gastrocnemius on ADF. This builds the prerequisite for a standardized examination for MGT. Non-weightbearing and weightbearing examination of ADF has to be conducted with the knee fully extended and at least 20&#176; flexed. Two investigators should conduct non-weightbearing testing with the subject in supine position. In order to obtain reliable results, the axis of the fibula should be marked. One examiner can conduct weightbearing examination with the subject in lunge stance. Isolated MGT is present if ADF is impaired with the knee fully extended and knee flexion results in a significant ADF increase. The herein presented standardized examination is the prerequisite for future studies aiming at establishing norm values.

Diagnosis of Musculus Gastrocnemius Tightness - Key Factors for the Clinical Examination

Isolated Musculus gastrocnemius tightness is a common cause for foot and ankle pathologies. Currently no standardized examination procedure exists. This manuscript demonstrates that 20 degree of knee flexion eliminates the restraining effect of the M. gastrocnemius on ankle dorsiflexion and presents a video description of a standardized examination protocol.

Le diagnostic de la<em&gt; Musculus Gastrocnemius</em&gt; Étanchéité - facteurs clés pour l&#39;examen clinique

Common foot and ankle pathologies have been linked to isolated Musculus gastrocnemius tightness (MGT). Various examination techniques have been described ...

Hydra, a Computer-Based Platform for Aiding Clinicians in Cardiovascular Analysis and Diagnosis

Cardiovascular diseases (CVDs) are the leading cause of death throughout the world. The total risk of developing CVD is determined by the combined effect of different cardiovascular risk factors (e.g., diabetes, raised blood pressure, unhealthy diet, tobacco use, stress, etc.) that commonly coexist and act multiplicatively. Most CVDs can be prevented by an early identification of the highest risk factors and an appropriate treatment. The stratification of cardiovascular risk factors involves a wide range of parameters and tests that specialists use in their clinical practice. In addition to cardiovascular (CV) risk stratification, ambulatory blood pressure monitoring (ABPM) also provides relevant information for diagnostic and treatment purposes. This work presents a list of protocols based on the Hydra platform, a web-based system for clinical decision support which incorporates a set of functionalities and services that are required for complete cardiovascular analysis, risk assessment, early diagnosis, treatment and monitoring of patients over time. The program includes tools for inputting and managing comprehensive patient data, organized into different checkups to track the evolution over time. It also has a risk stratification tool to compute a CV risk factor based upon several risk stratification tables of reference. Additionally, the program includes a tool that incorporates ABPM analysis and allows the extraction of valuable information by monitoring blood pressure over a specific period of time. Finally, the reporting service summarizes the most relevant information in a set of reports that aid clinicians in their clinical decision-making process.

This article presents a protocol based on Hydra &#8212; a web-based system for clinical decision support that integrates a full and detailed set of functionalities and services required by physicians for complete cardiovascular analysis, risk assessment, early diagnosis, treatment, and monitoring over time.

Hydra, une plateforme informatique pour aider les cliniciens dans le diagnostic et d’analyse cardiovasculaire

Cardiovascular diseases (CVDs) are the leading cause of death throughout the world. The total risk of developing CVD is determined by the combined effect ...

International Expert Consensus and Recommendations for Neonatal Pneumothorax Ultrasound Diagnosis and Ultrasound-guided Thoracentesis Procedure

Pneumothorax (PTX) represents accumulation of the air in the pleural space. A large or tension pneumothorax can collapse the lung and cause hemodynamic compromise, a life-threatening disorder. Traditionally, neonatal pneumothorax diagnosis has been based on clinical images, auscultation, transillumination, and chest X-ray findings. This approach may potentially lead to a delay in both diagnosis and treatment. The use of lung US in diagnosis of PTX together with US-guided thoracentesis results in earlier and more precise management. The recommendations presented in this publication are aimed at improving the application of lung US in guiding neonatal PTX diagnosis and management.

Pneumothorax is a common emergency and critical disease in newborn infants that needs rapid, clear diagnosis and timely treatment. Diagnosis and treatment based on chest X-rays are associated with delayed management and radiation damage. Lung ultrasound (US) provides useful guidance for rapid, accurate diagnosis and the precise thoracentesis of pneumothorax.

Consensus d’experts internationaux et recommandations pour le diagnostic d’échographie de pneumothorax néonatal et la procédure de thoracentesis à ultrasons

Pneumothorax (PTX) represents accumulation of the air in the pleural space. A large or tension pneumothorax can collapse the lung and cause hemodynamic ...

Diagnosis and Surgical Treatment of Human Brucellar Spondylodiscitis

Brucellar spondylodiscitis (BS) is the most prevalent and significant osteoarticular presentation of human Brucellosis, which is commonly manifested in pastoral communities. It is difficult to differentially diagnose and usually leads to irreversible neurologic deficits and spinal deformities. The initial diagnosis of BS is based on clinical findings and radiographic assessments, and the confirmed diagnosis should be established by the isolation of Brucella species from the blood and/or the standard tube agglutination test. Differential diagnosis of multifocal BS from either degenerative disc diseases or tuberculosis is especially highlighted. The surgical approach, either endoscopic or open, is demonstrated in detail, accompanied by radiographic evidence of structural compression or severe instability. Further, the crucial surgical steps, including single-stage transforaminal decompression, debridement, interbody fusion, and internal fixation, are explained. Moreover, perioperative care and postoperative rehabilitation are also addressed. Taken together, this clinical algorithm presents a practical guide that has yielded substantially satisfactory outcomes in the past decades, which can also be introduced for large-scale application to manage human BS, especially in endemic regions.

We describe a clinical algorithm, based on decades of front-line experience of diagnosis and surgical treatment of human Brucellar spondylodiscitis in the largest medical center of the China's Xinjiang Pastoral Area.

Diagnostic et traitement chirurgical de la spondylodiscite humaine de Brucellar

Brucellar spondylodiscitis (BS) is the most prevalent and significant osteoarticular presentation of human Brucellosis, which is commonly manifested in ...

Testing Acetylcholine Followed by Adenosine for Invasive Diagnosis of Coronary Vasomotor Disorders

More than 50% of patients with signs and symptoms of myocardial ischemia undergoing coronary angiography have unobstructed coronary arteries. Coronary vasomotor disorders (impaired vasodilatation and/or enhanced vasoconstriction/spasm) represent important functional causes for such a clinical presentation. Although impaired vasodilatation may be assessed with non-invasive techniques such as positron emission tomography or cardiac magnetic resonance imaging, there is currently no reliable non-invasive technique for the diagnosis of coronary spasm available. Thus, invasive diagnostic procedures (IDP) have been developed for the diagnosis of coronary vasomotor disorders including spasm testing as well as assessment of coronary vasodilatation. The identification of the underlying type of disorder (so called endotype) allows the initiation of targeted pharmacological treatments. Despite the fact that such an approach is recommended by the current European Society of Cardiology guidelines for the management of chronic coronary syndromes based on the CorMicA study, comparability of results as well as multicenter trials are currently hampered by major differences in institutional protocols for coronary functional testing. This article describes a comprehensive IDP protocol including intracoronary acetylcholine provocation testing for diagnosis of epicardial/microvascular spasm, followed by Doppler wire-based assessment of coronary flow reserve (CFR) and hyperemic microvascular resistance (HMR) in search of coronary vasodilatory impairment.

Coronary vasomotion disorders represent frequent functional causes of angina in patients with unobstructed coronaries. The underlying mechanism of angina (endotype) in these patients can be determined by a comprehensive invasive diagnostic procedure based on acetylcholine provocation testing followed by Doppler-derived assessment of the coronary flow reserve and microvascular resistance.

Test de l’acétylcholine suivie d’une adénosine pour le diagnostic invasif des troubles vasomoteurs coronariens

More than 50% of patients with signs and symptoms of myocardial ischemia undergoing coronary angiography have unobstructed coronary arteries. Coronary ...

Measurement of Myocardial Lactate Production for Diagnosis of Coronary Microvascular Spasm

In about a quarter of patients with angina and non-obstructive coronary arteries, no epicardial spasm is noted on coronary arteriography during an angina attack. Since the pressure-rate product is almost identical at rest and the onset of attack in those patients, the decrease in coronary blood flow rather than increased myocardial oxygen consumption is likely to explain myocardial ischemia, indicating a substantial involvement with coronary microvascular spasm (MVS). Myocardial lactate production, which could be defined as a negative myocardial lactate extraction ratio (ratio of the coronary arterial-venous difference in lactate concentration to arterial concentration), is considered indicative of objective evidence to support the emerging myocardial ischemia. Thus, monitoring of the myocardial lactate production and the emergence of chest pain and ischemic electrocardiographic changes during acetylcholine (ACh) provocation testing is of significant value for detecting the entity of MVS. Practically, 1 min after incremental doses of ACh (20, 50, and 100 &#956;g) are administered into the left coronary artery (LCA), paired samples of 1 mL of blood are collected from the LCA ostium and coronary sinus for measurement of lactate concentration by a calibrated automatic lactate analyzer. Then, the development of MVS could be confirmed by negative myocardial lactate extraction ratio despite the absence of angiographically demonstrable epicardial coronary spasm or before its occurrence throughout ACh provocation testing. In conclusion, assessment of myocardial lactate production is essential and valuable for the diagnosis of MVS.

Myocardial lactate production (coronary arterial-venous difference in serum lactate level) during coronary spasm provocation testing is considered as a highly sensitive marker that reflects acetylcholine-induced myocardial ischemia due to microvascular spasm. This article presents the procedures to assess myocardial lactate production for the diagnosis of coronary microvascular spasm.

Mesure de la production de lactate myocardique pour le diagnostic des spasmes microvasculaires coronaires

In about a quarter of patients with angina and non-obstructive coronary arteries, no epicardial spasm is noted on coronary arteriography during an angina ...

High-speed Video Microscopy Analysis for First-line Diagnosis of Primary Ciliary Dyskinesia

Primary ciliary dyskinesia (PCD) is a congenital disorder predominantly inherited in an autosomal recessive trait. The disorder causes disturbance in the motion of cilia, leading to severe impairment of mucociliary clearance (MCC). If undiagnosed or diagnosed too late, the condition leads to the development of bronchiectasis and serious damage to the lungs in later life. Most of the methods for diagnosing PCD are time-consuming and demand extensive economic resources to establish them. High-speed video microscopy analysis (HSVMA) is the only diagnostic tool to visualize and analyze living respiratory cells with beating cilia in vitro. It is fast, cost-effective, and, in experienced hands, very reliable as a diagnostic tool for PCD. In addition, classical diagnostic measures such as transmission electron microscopy (TEM) are not applicable for some mutations as morphological changes are absent. 
This paper describes the process of collecting respiratory epithelial cells, the further preparation of the specimen, and the process of HSVMA. We also describe how brushed cells can be successfully kept unharmed and beating by keeping them in a nourishing medium for storage and transport to the investigation site in cases where a clinic does not possess the equipment to perform HSVMA. Also shown are videos with pathologic beating patterns from patients with a mutation in the dynein arm heavy chain 11 gene (DNAH11), which cannot be diagnosed with TEM; the result of an inconclusive HSVMA due to infection of the upper airways, as well as an unsuccessful brushing with superimposition of red blood cells. With this article, we would like to encourage every unit dealing with pulmonology patients and rare lung diseases to perform HSVMA as part of their daily routine diagnostics for PCD or send the specimens over to a center specializing in performing HSVMA.

High-speed video microscopy analysis is a relatively easy-to-perform, fast, cost-effective, and, in experienced hands, a considerably reliable tool for first-line diagnostics of primary ciliary dyskinesia, which should be available in every center involved in diagnostics and the treatment of severe lung diseases.

Analyse par microscopie vidéo à grande vitesse pour le diagnostic de première ligne de la dyskinésie ciliaire primaire

Primary ciliary dyskinesia (PCD) is a congenital disorder predominantly inherited in an autosomal recessive trait. The disorder causes disturbance in the ...