Name: basophil activation test for allergy diagnosis
Uploaded: 2021-05-31T14:00:00
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Wir danken Claudia Corazza für ihre unschätzbare Unterstützung in englischer Sprache. Diese Arbeit wurde vom Institute of Health ''Carlos III'' (ISCIII) des MINECO unterstützt (Zuschuss kofinanziert durch EFRE: "Una manera de hacer Europa"; Fördernummern PI20/01715; PI18/00095; PI17/01410; PI17/01318; PI17/01237 und RETIC ARADYAL RD16/0006/0001; Andalusisches Regionalministerium für Gesundheit (Förder-Nr. PI-0127-2020, PIO-0176-2018; PE-0172-2018; PE-0039-2018; PC-0098-2017; PI-0075-2017; PI-0241-2016). ID ist ein klinischer Prüfarzt (B-0001-2017) und AA hat einen Senior Postdoc-Vertrag (RH-0099-2020), beide unterstützt vom andalusischen Regionalgesundheitsministerium (kofinanziert durch ESF: "Andalucía se mueve con Europa").

Die Protokolldurchführung wurde gemäß den Prinzipien der Deklaration von Helsinki durchgeführt und von der lokalen Ethikkommission (Comité de Ética para la Investigación Provincial de Málaga, Spanien) genehmigt. Alle Probanden wurden mündlich über die Forschungsstudie informiert und unterschrieben die entsprechende Einwilligungserklärung.
HINWEIS: Das vorliegende Protokoll beschreibt das BAT-Verfahren, das die Autoren täglich anwenden. Dies ist jedoch keine standardisierte...

BAT ist ein ergänzender in-vitro-diagnostischer Test zur Beurteilung von IgE-vermittelten allergischen Reaktionen, der sich bei der Diagnose von Reaktionen, die durch verschiedene Auslöser wie Medikamente, Lebensmittel oder Inhalationsmittel ausgelöst werden, sowie bei einigen Formen chronischer Urtikaria als nützlich erwiesen hat. Im Allgemeinen sollte die BAT-Leistung in Betracht gezogen werden, wenn i) das Allergen/Arzneimittel falsch positive Ergebnisse bei ST liefert; ii) das Allergen/Arzneimittel steht...

Die IgE-vermittelte Allergiediagnose basiert auf der klinischen Anamnese, Hauttests (STs), der Quantifizierung von serumspezifischen IgE (sIgE) und, falls erforderlich und indiziert, kontrollierten Provokationstests (CCTs)1,2,3,4,5,6. Die klinische Anamnese kann jedoch unzuverlässig sein, da es an genauen Informationen mangeln kann und STs und CCTs keine risikofreien Verfahren sind, die bei Patienten mit schweren lebensbedrohlichen Reaktionen kontraindiziert werden können 1,2,3,4,5,6 . Diese Probleme, zusammen mit der Tatsache, dass die Bestimmung von sIgE durch validierte und kommerzielle Fluorenzym-Immunoassays nur für wenige Allergene und Medikamente verfügbar ist, haben die wichtige Rolle anderer funktioneller In-vitro-Assays wie dem Basophilenaktivierungstest (BAT) hervorgehoben.
Basophile sind wichtige Effektorzellen, die an IgE-vermittelten allergischen Reaktionen beteiligt sind, die bei Vernetzung benachbarter sIgE, die an hochaffine Rezeptoren (FcεRI) auf der Zelloberfläche gebunden sind, nach Allergen- / Arzneimittelexposition aktiviert werden. Die basophile Aktivierung löst die Zelldegranulation und Freisetzung von vorgeformten und neu synthetisierten Entzündungsmediatoren aus, die in intrazytoplasmatischen Sekretionsgranula 7,8,9 enthalten sind. BAT ist eine In-vitro-Methode, die versucht, die basophile Aktivierung in Gegenwart eines Stimulus (Allergen oder Arzneimittel) nachzuahmen und Veränderungen in der Expression basophiler Aktivierungsmarker durch Durchflusszytometrie 7,10 zu bestimmen. Es gibt verschiedene Strategien zur Identifizierung von Basophilen (IgE+, CCR3+, CRTH2+, CD203c+) und zur Messung der Zellaktivierung (hauptsächlich Hochregulierung von CD63 und CD203c) mit Kombinationen von fluorochrommarkierten Antikörpern 7,10. CD63, der beste klinisch validierte Aktivierungsmarker 11,12,13,14, ist ein Membranprotein, das an den sekretorischen Granula verankert ist, die Histamin enthalten, das nach Zellaktivierung und Fusion des Granulats mit der Membran auf der basophilen Oberfläche exprimiert wird 15,16,17,18,19,20,21 . CD203c ist ein Oberflächenmarker, der konstitutiv auf Basophilen exprimiert und nach FcεRI-Stimulation hochreguliert wird, was auch zuverlässige Ergebnisse in BAT 15,22,23,24,25 gezeigt hat. Außerdem scheint es mit CD6326 zu koexprimieren.
In den letzten Jahrzehnten hat sich BVT als nützlich bei der Diagnose von IgE-vermittelten allergischen Reaktionen erwiesen, die durch verschiedene Auslöser wie Medikamente, Nahrungsmittel oder Inhalationsmittel induziert werden, sowie bei einigen Formen der chronischen Urtikaria, wie unten beschrieben. Die Position dieser Technik in den Diagnosealgorithmen ist jedoch sehr variabel und nicht gut bestimmt.
Überempfindlichkeit gegen Medikamente BAT hat sich als ergänzender Test für ausgewählte Arzneimittel und Patienten als nützlich erwiesen, insbesondere für diejenigen, bei denen schwere Reaktionen auftreten, da der diagnostische Wert von ST für die meisten Arzneimittel nicht gut etabliert ist, da sie für eine begrenzte Anzahl von Arzneimitteln validiert und standardisiert sind27,28,29,30. Darüber hinaus ist die Quantifizierung von sIgE nur für eine begrenzte Anzahl von Arzneimitteln verfügbar, mit geringerer Empfindlichkeit als ST 27,28,29,30,31,32. Daher beruht die Diagnose einer Arzneimittelüberempfindlichkeit in der Regel auf einem Drogenprovokationstest, der bei Probanden mit schweren lebensbedrohlichen Reaktionen kontraindiziert sein kann33.
Vielversprechende Ergebnisse wurden für die Anwendung von BAT bei ausgewählten Patienten berichtet, die über sofortige Überempfindlichkeitsreaktionen auf verschiedene Arzneimittel wie Betalactame (BLs)20,34,35,36,37,38,39, neuromuskuläre Blocker (NMBAs)19,22,40,41,42, 43,44,45, Fluorchinolone (FQs)46,47,48,49, Pyrazolone 50,51,52, Radiokontrastmittel (RCM)53,54,55,56 und Platinverbindungen57,58,59 . Es wurde berichtet, dass BAT eine Sensitivität und Spezifität zwischen 51,7-66,9 % bzw. 89,2-97,8 % aufweist; und positive und negative prädiktive Werte werden zwischen 93,4% und 66,3% bzw.27,31 beschrieben. Darüber hinaus wurde BAT als prädiktiver Biomarker für Durchbruchreaktionen während der Desensibilisierung mit Platinverbindungen vorgeschlagen, da die CD203c-Expression im Vergleich zu CD63 bei Patienten mit hohem Risiko für Nebenwirkungen während der Desensibilisierung von Arzneimitteln erhöht ist57.
Es ist anzumerken, dass BVT bei Arzneimittelüberempfindlichkeit nur dann nützlich ist, wenn die Reaktion eine basophile Degranulation beinhaltet; Daher ist es nicht nützlich bei Reaktionen, die aus einer enzymatischen Hemmung der Cyclooxygenase 142 resultieren.
Lebensmittelallergie BVT hat sich als potenzielles Diagnoseinstrument für Nahrungsmittelallergien herausgestellt, da die Bestimmung von Serum-sIgE für den gesamten Allergenextrakt oder einzelne Allergene oft mehrdeutig ist und eine orale Nahrungsprovokation zur Bestätigung der Diagnose erfordert, was ähnlich wie bei der Arzneimittelüberempfindlichkeit ein kostspieliges und nicht risikofreies Verfahren ist60. Mehrere Studien haben relevante Ergebnisse mit Kuhmilch 61,62, Ei 61,63, Weizen 64,65,66,67,68, Erdnuss 63,69,70,71,72, Haselnuss 73,74,75,76 gezeigt ,77, Schalentiere78, Pfirsich 79,80,81, Apfel21, Sellerie und Karotte82,83.
Der Hauptmehrwert von BAT bei der Diagnose von Nahrungsmittelallergien im Vergleich zu STs und sIgE im Serum besteht darin, dass es eine höhere Spezifität und ähnliche Sensitivität aufweist. Daher ist BAT ein nützliches Instrument, um klinisch allergische Patienten von sensibilisierten, aber toleranten Probanden zu unterscheiden, die sowohl eine hohe Spezifität (75-100%) als auch eine hohe Sensitivität (77-98%) aufweisen63,69,84. Sensitivitäts- und Spezifitätswerte hängen vom Allergen und anderen Faktoren wie Phänotypen (z. B. orales Allergiesyndrom versus Anaphylaxie), Alter und geografisch bedingten Sensibilisierungsmustern ab63,85.
BVT unter Verwendung einzelner Allergenkomponenten kann möglicherweise die diagnostische Genauigkeit für einige Lebensmittelallergeneverbessern 61,80. Es gibt Studien mit Samenspeicherproteinen (z. B. Ara h 1, Ara h 2, Ara h 3 und Ara h 6 aus Erdnüssen)86; Lipidtransferproteine (z.B. Pru p 3 aus Pfirsich und Ara h 9 aus Erdnüssen)80,86; und Bet v 1 Homologe (z. B. Ara h 8 aus Erdnuss)87. Andere mögliche Nutzen beziehen sich auf die Identifizierung des Täterallergens in Fällen von Pollen-Nahrungsmittel-Allergie-Syndrom 21,87,88, Allergie gegen rotes Fleisch 89 oder lebensmittelabhängiger belastungsinduzierter Anaphylaxie66.
Interessanterweise kann die BVT Aufschluss über den Schweregrad und die Schwelle allergischer Reaktionen geben, da Patienten mit schwereren Reaktionen einen größeren Anteil an aktivierten Basophilen aufweisen, wie in Studien mit Erdnuss- und Kuhmilchallergikern beobachtetwurde 84,90,91; und Patienten, die auf Spuren des Allergens reagieren, zeigen eine größere basophile Empfindlichkeit 84,90,92. Diese Daten deuten darauf hin, dass BAT nützlich sein kann, um allergische Hochrisikopatienten zu identifizieren, die eine engere Nachsorge und eine intensivere Aufklärung benötigen93. Darüber hinaus wurde berichtet, dass BVT die Reaktionen auf Lebensmittelherausforderungen 70,91,92,94 und die Reaktivitätsschwellen 90,95 vorhersagen kann, um festzustellen, wann Lebensmittel sicher (wieder) eingeführt werden können 84. Diese Ergebnisse sind jedoch in einigen Studien umstritten63,96 und weitere Forschung sind erforderlich.
Andererseits wurde BVT verwendet, um das Abklingen von Nahrungsmittelallergien, entweder auf natürliche Weise oder unter immunmodulatorischen Behandlungen, im Laufe der Zeit zu überwachen, was bisher nur durch orale Nahrungsmittelprovokation mit den damit verbundenen Risiken und Kosten bewertet wurde. 84,97,98,99,100,101,102,103,104,105,106 ,107,108. Darüber hinaus wurde es auch verwendet, um die Wirkung von Omalizumab bei Nahrungsmittelallergien zu überwachen, da die basophile Aktivierung während der Behandlung mit Omalizumab abnimmt, aber nach Beendigung der Behandlung zunimmt109.
Inhalationsallergie BAT ist selten vorteilhaft bei Inhalationsallergien, da die Diagnose routinemäßig durch sIgE-Quantifizierung und ST gestellt werden kann. In Fällen von lokaler allergischer Rhinitis (nicht nachweisbare sIgE-Werte und negative STs mit positiven nasalen Provokationstests) hat die BVT jedoch in 50% der Fälle eine Diagnose ermöglicht110. Es wurde ferner über eine Korrelation zwischen der basophilen Empfindlichkeit und dem Ansprechen auf nasale/bronchiale Provokationstests sowie zwischen dem Schweregrad des Asthmas und der Wirksamkeit der Behandlung mit Omalizumab111,112 berichtet.
BAT wurde auch verwendet, um die Allergenimmuntherapie für Hausstaubmilben und Pollen zu überwachen, da die basophile Empfindlichkeit während der Immuntherapie abnimmt, wahrscheinlich aufgrund der Interferenz der blockierenden IgG-Antikörper 113,114,115,116,117.
Hymenoptera-Giftallergie Die Diagnose einer Hymenoptera-Giftallergie basiert routinemäßig auf ST und Serum-sIgE. BAT hat eine hohe Sensitivität (85-100%) und Spezifität (83-100%) gezeigt und es wurde berichtet, dass es in Fällen nützlich ist, die zu mehrdeutigen Ergebnissen führen, oder bei Patienten mit einer suggestiven klinischen Vorgeschichte einer Giftallergie, aber nicht nachweisbarem sIgE und negativem ST118,119. Die BVT scheint jedoch keinen Schweregrad für diese Reaktionen vorherzusagen120,121.
Bis zu 60% der Patienten zeigen sIgE sowohl für Wespen- als auch für Bienengift, und die Identifizierung eines dominanten Allergens ist entscheidend für eine adäquate Immuntherapie. In diesen Fällen hat sich die BVT als nützlich bei der Identifizierung des dominanten Allergens 119,122,123,124 erwiesen. Obwohl sIgE zu den Hauptallergenen von Bienen- und Wespengiften den Nutzen von BAT bei Patienten mit doppelter Positivität für beide Gifte verringern kann, liefert es nützliche Informationen, hauptsächlich bei Probanden mit negativen Ergebnissen bei sIgE-Bestimmungen123.
Einige Studien deuten darauf hin, dass BAT als prädiktiver Biomarker für Nebenwirkungen während der Aufbauphase der Giftimmuntherapie nützlich sein kann, da diese Behandlungsoption die basophile Empfindlichkeit verringert. Die Reaktivität nimmt jedoch nicht ab und dieses BAT-Dienstprogramm ist heutzutage umstritten 13,120,125,126,127,128,129,130.
Urtikaria und Angioödem Eine Untergruppe von Patienten mit chronischer Urtikaria hat eine autoinmune Pathophysiologie aufgrund von IgE-Autoantikörpern gegen Autoallergene und IgG-Autoantikörpern, die auf FcεRI- oder IgE-FcεRI-Komplexe abzielen, die auf der Mastzelloberfläche131,132 vorhanden sind. In der klinischen Praxis stützt sich die Diagnose dieser Art von chronischer Urtikaria auf positive autologe Serum-ST, die das Risiko einer versehentlichen Infektion birgt. BAT wurde als In-vitro-Test zur Diagnose und Überwachung von Patienten mit Verdacht auf chronische Urtikaria vorgeschlagen. Es wurde berichtet, dass sowohl die CD63- als auch die CD203c-Expression auf der Oberfläche von Basophilen nach Stimulation mit Seren von Patienten mit chronischer Urtikaria erhöht war, was den Nachweis der aktiven Autoantikörper 133,134,135,136,137 zeigt. Kürzlich wurde berichtet, dass Patienten mit positiver BAT häufig den aktivsten Krankheitszustand aufweisen, der anhand des Urtikaria-Aktivitätsscores beurteilt wird, und höhere Dosen von Antihistaminika zusammen mit Drittlinienbehandlungen (Ciclosporin A oder Omalizumab) benötigen als Patienten mit negativem BAT138.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, without Cap, Nonsterile</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC anti-human CD193 (CCR3) Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>310708</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSCalibur Flow Cytometer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC anti-human CD63 Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>353006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES (1 M)</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>15630106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysing Solution 10x concentrated</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>349202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Formyl-Met-Leu-Phe</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F3506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE anti-human CD203c (E-NPP3) Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>324606</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purified Mouse Anti-Human IgE</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555857</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human IL-3</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>203-IL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sheath Fluid</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>342003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S3014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TUBE 9 mL LH Lithium Heparin</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>455084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1379</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

basophil activation test for allergy diagnosis

Der Basophilenaktivierungstest (BAT) ist ein ergänzender In-vitro-Diagnosetest , der zusätzlich zur klinischen Anamnese, zum Hauttest (ST) und zur spezifischen IgE-Bestimmung (sIgE) bei der Beurteilung von IgE-vermittelten allergischen Reaktionen auf Lebensmittel, Insektengift, Medikamente sowie einige Formen chronischer Urtikaria verwendet werden kann. Die Rolle dieser Technik in den Diagnosealgorithmen ist jedoch sehr variabel und nicht gut bestimmt.
Die BVT basiert auf der Bestimmung der basophilen Reaktion auf die IgE-Aktivierung durch Allergen-/Wirkstoffvernetzung durch die Messung von Aktivierungsmarkern (wie CD63, CD203c) mittels Durchflusszytometrie. Dieser Test kann ein nützliches und ergänzendes Werkzeug sein, um kontrollierte Provokationstests zur Bestätigung der Allergiediagnose zu vermeiden, insbesondere bei Probanden mit schweren lebensbedrohlichen Reaktionen. Im Allgemeinen sollte die Leistung der BVT in Betracht gezogen werden, wenn i) das Allergen/Arzneimittel falsch positive Ergebnisse bei ST liefert; ii) es gibt keine Allergen-/Arzneimittelquelle, die für die ST- oder sIgE-Bestimmung verwendet werden kann; iii) es besteht Diskrepanz zwischen der Anamnese und der ST- oder sIgE-Bestimmung; iv) Symptome deuten darauf hin, dass ST zu einer systemischen Reaktion führen kann; v) bevor ein CCT in Betracht gezogen wird, um das schuldige Allergen / Medikament zu bestätigen. Die Haupteinschränkungen des Tests beziehen sich auf die nicht optimale Empfindlichkeit, insbesondere bei Arzneimittelallergien, die Notwendigkeit, den Test nicht länger als 24 Stunden nach der Probenextraktion durchzuführen, und die fehlende Standardisierung zwischen Laboratorien in Bezug auf Verfahren, Konzentrationen und Zellmarker.

BVT, die mit Allergenen oder Arzneimitteln durchgeführt wird, ermöglicht die Untersuchung von IgE-abhängigen Überempfindlichkeitsreaktionen. Die basophile Reaktivität sollte in mindestens zwei optimalen Konzentrationen gemessen werden, um die besten Ergebnisse zu erzielen34 und die Aktivierung wird durch die Hochregulierung von CD63 auf der Zelloberfläche visualisiert. Im Falle von Allergenen sollte darüber hinaus zur Bestätigung der basophilen Reaktivität die basophile Empfindlichkeit an...

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Basophil Activation Test for Allergy Diagnosis

Der basophile Aktivierungstest ist ein ergänzender in-vitro-diagnostischer Test zur Bewertung von IgE-vermittelten allergischen Reaktionen basierend auf dem Nachweis einer basophilen Aktivierung in Gegenwart eines spezifischen Stimulus durch die Messung von Aktivierungsmarkern durch Durchflusszytometrie.

Basophiler Aktivierungstest zur Allergiediagnostik

The basophil activation test (BAT) is a complementary in vitro diagnostic test that can be used in addition to clinical history, skin test (ST), and ...

Der basophile Aktivierungstest ist ein ergänzender In-vitro-diagnostischer Test zur Beurteilung von IgE-vermittelten allergischen Reaktionen, die sich als nützlich für Reaktionen erwiesen haben, die durch Medikamente, Lebensmittel oder Inhalationsmittel sowie bei einigen Formen der chronischen Urtikaria induziert werden. Dieser Test basiert auf der Bestimmung der basophilen Reaktion auf eine Allergen- oder Arzneimittelvernetzungs-IgE-Aktivierung durch die Messung von Aktivierungsmarkern durch Durchflusszytometrie. Der basophile Aktivierungstest kann ein nützliches und ergänzendes Werkzeug sein, um kontrollierte Provokationstests zur Bestätigung der Allergiediagnose zu vermeiden, insbesondere bei Probanden mit schweren lebensbedrohlichen Reaktionen.Darüber hinaus hat dieser Test den Vorteil, dass er die Reaktion gegen jedes Medikament oder Allergen im Vergleich zu anderen In-vitro-Methoden, die nur für wenige Medikamente und Allergene verfügbar sind, analysieren kann. Die Haupteinschränkungen des Tests beziehen sich auf eine nicht optimale Empfindlichkeit, insbesondere bei Arzneimittelallergien. Die Notwendigkeit, den Test nicht länger als 24 Stunden nach der Probenentnahme durchzuführen, und die fehlende Standardisierung zwischen Laboratorien und Diagnosealgorithmen.Beginnen Sie mit der Sammlung von peripherem Blut in neun Milliliter-heparinisierten Röhrchen und legen Sie die Proben in einen Rotor, um sie bei Raumtemperatur zu halten, bis sie für das experimentelle Protokoll benötigt werden. Kennzeichnen Sie jeweils zwei Fünf-Milliliter-Zytometerröhrchen für die Negativkontrolle und die Positivkontrolle. Kennzeichnen Sie auch jeweils ein Röhrchen für die verschiedenen getesteten Allergen- oder Arzneimittelkonzentrationen.Legen Sie dann die Schläuche in ein Gestell, damit die Schläuche perfekt passen, ohne zu verrutschen. Für die erste Positivkontrolle wird eine viermikromolare Lösung von N-Formylmethionyl-leucyl-phenylalanin oder fMLP in 0,05% PBS-T hergestellt, um die Qualität der Basophilen zu bestätigen. Für die zweite Positivkontrolle wird eine 0,05 Milligramm pro Milliliter Anti-IgE-Lösung mit PBS-T hergestellt.Bereiten Sie die Färbemischung vor, indem Sie je einen Mikroliter CCR3-APC-, CD203c-PE- und CD63-FITC-Antikörper pro 20 Mikroliter des Stimulationspuffers hinzufügen. Dann fügen Sie 23 Mikroliter dieser Färbemischung zu jeder Tube hinzu. Geben Sie 100 Mikroliter PBS-T in die Negativkontrollröhrchen.Fügen Sie 100 Mikroliter fMLP zu einem der positiven Kontrollröhrchen hinzu und fügen Sie 100 Mikroliter Anti-IgE in das andere zu den restlichen Röhrchen hinzu. Fügen Sie 100 Mikroliter der verschiedenen Allergen- oder Arzneimittelkonzentrationen hinzu und inkubieren Sie bei 37 Grad Celsius für 10 Minuten. Fügen Sie nach der Inkubation 100 Mikroliter Blut vorsichtig in jedes Röhrchen hinzu, um eine Hämolyse zu vermeiden.Anschließend werden die Röhrchen vorsichtig vorgewirbelt und 25 Minuten bei 37 Grad Celsius im Thermostatbad mit mittlerem Rühren inkubiert. Halten Sie die Röhrchen mindestens fünf Minuten lang bei vier Grad Celsius, um die Degranulation zu stoppen. Fügen Sie zu jedem Röhrchen zwei Milliliter Lysing-Puffer hinzu, um die Erythrozyten zu lysieren.Wirbeln Sie jedes Röhrchen und inkubieren Sie die Röhrchen dann fünf Minuten lang bei Raumtemperatur. Zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 300 g bei vier Grad Celsius für fünf Minuten. Kippen Sie dann das Gestell in die Spüle, um den Überstand zu dekantieren, während die Zellen am Boden der Röhrchen verbleiben.Fügen Sie drei Milliliter PBS-T zu jedem Röhrchen hinzu, um die Zellen zu waschen und die Röhrchen zu wirbeln. Führen Sie eine zweite Zentrifugationsrunde mit demselben Parametersatz durch und dekantieren Sie den Überstand, indem Sie das Rack in die Spüle umdrehen. Dann halten Sie die Proben bis zur Durchflusszytometrie bei vier Grad Celsius vor Licht geschützt.Verbinden Sie das Durchflusszytometer mit der Computersoftware und warten Sie, bis das Zytometer bereit ist. Laden Sie die Vorlagen- und Instrumenteneinstellungen wie im Textmanuskript beschrieben. Starten Sie den Prozess der Probenerfassung.Um aktivierte Basophile auszuwählen, gate Sie zunächst die Lymphozyten aus dem Side Scatter-Forward Scatter-Diagramm. Dann gate die Basophilen aus der Lymphozytenpopulation als CCR3+CD203c+Zellen und erwirbt mindestens 500 Basophile pro Röhre. Stellen Sie den CD63-Schwellenwert mit den Negativkontrollröhrchen auf ca. 2,5% ein und analysieren Sie die Proben.IgE-abhängige Überempfindlichkeitsreaktionen wurden durch einen basophilen Aktivierungstest (BAT) mit Allergenen und Medikamenten untersucht. Die Basophilensensitivität wurde analysiert, indem die Reaktivität bei mehreren abnehmenden Allergenkonzentrationen gemessen wurde, die dazu beitragen, die allergische Konzentration zu bestimmen, die die Reaktion von 50% Basophilen oder EC50 induziert. Zuerst wurden die Lymphozyten aus dem seitlichen Streu-Vorwärts-Streudiagramm gesteuert.Dann wurden Basophile aus der Lymphozytenpopulation als CCR3 + CD203c + Zellen entfernt. Dann wurde ein CCR3-CD63-Diagramm verwendet, um die basophile Aktivierung unter Verwendung von CD63 als Aktivierungsmarker für zwei Medikamente und unterschiedliche Konzentrationen eines Allergens zu analysieren. Der Test wird mit frischem Vollblut durchgeführt und darf nicht länger als 24 Stunden nach der Blutentnahme durchgeführt werden.Der im Test verwendete Stimulus sollte keine Hilfsstoffe enthalten und die chemischen Eigenschaften der Medikamente müssen berücksichtigt werden. Weitere zusätzliche in vitro Methoden zur Diagnose von IgE-vermittelten allergischen Reaktionen oder zur Bestimmung von sIgE oder zum Histaminfreisetzungstest.

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Research

JoVE Journal

Medicine

FISH for Pre-implantation Genetic Diagnosis

Pre-implantation genetic diagnosis (PGD) is an established alternative to pre-natal diagnosis, and involves selecting pre-implantation embryos from a cohort generated by assisted reproduction technology (ART). This selection may be required because of familial monogenic disease (e.g. cystic fibrosis), or because one partner carries a chromosome rearrangement (e.g. a two-way reciprocal translocation). PGD is available for couples who have had previous affected children, and/or in the case of chromosome rearrangements, recurrent miscarriages, or infertility. Oocytes aspirated following ovarian stimulation are fertilized by in vitro immersion in semen (IVF) or by intracytoplasmic injection of an individual spermatozoon (ICSI). Pre-implantation cleavage-stage embryos are biopsied, usually by the removal of a single cell on day 3 post-fertilization, and the biopsied cell is tested to establish the genetic status of the embryo. Fluorescence in situ hybridization (FISH) on the fixed nuclei of biopsied cells with target-specific DNA probes is the technique of choice to detect chromosome imbalance associated with chromosome rearrangements, and to select female embryos in families with X-linked disease for which there is no mutation-specific test. FISH has also been used to screen embryos for spontaneous chromosome aneuploidy (also known as PGS or PGD-AS) in order to try and improve the efficiency of assisted reproduction; however, the predictive value of this test using the spreading and FISH technique described here is likely to be unacceptably low in most people's hands and it is not recommended for routine clinical use. We describe the selection of suitable probes for single-cell FISH, spreading techniques for blastomere nuclei, and in situ hybridization and signal scoring, applied to PGD in a clinical setting.

This article describes the selection of suitable probes for single-cell FISH, spreading techniques for blastomere nuclei, and in situ hybridization and signal scoring, applied to pre-implantation genetic diagnosis (PGD) in a clinical setting.

FISH für Präimplantations-Diagnostik

Pre-implantation genetic diagnosis (PGD) is an established alternative to pre-natal diagnosis, and involves selecting pre-implantation embryos from a ...

Forschung

Medizin

The Trier Social Stress Test Protocol for Inducing Psychological Stress

This article demonstrates a psychological stress protocol for use in a laboratory setting. Protocols that allow researchers to study the biological pathways of the stress response in health and disease are fundamental to the progress of research in stress and anxiety.1 Although numerous protocols exist for inducing stress response in the laboratory, many neglect to provide a naturalistic context or to incorporate aspects of social and psychological stress. Of psychological stress protocols, meta-analysis suggests that the Trier Social Stress Test (TSST) is the most useful and appropriate standardized protocol for studies of stress hormone reactivity.2 In the original description of the TSST, researchers sought to design and evaluate a procedure capable of inducing a reliable stress response in the majority of healthy volunteers.3 These researchers found elevations in heart rate, blood pressure and several endocrine stress markers in response to the TSST (a psychological stressor) compared to a saline injection (a physical stressor).3 Although the TSST has been modified to meet the needs of various research groups, it generally consists of a waiting period upon arrival, anticipatory speech preparation, speech performance, and verbal arithmetic performance periods, followed by one or more recovery periods. The TSST requires participants to prepare and deliver a speech, and verbally respond to a challenging arithmetic problem in the presence of a socially evaluative audience.3 Social evaluation and uncontrollability have been identified as key components of stress induction by the TSST.4 In use for over a decade, the goal of the TSST is to systematically induce a stress response in order to measure differences in reactivity, anxiety and activation of the hypothalamic-pituitary-adrenal (HPA) or sympathetic-adrenal-medullary (SAM) axis during the task.1 Researchers generally assess changes in self-reported anxiety, physiological measures (e.g. heart rate), and/or neuroendocrine indices (e.g. the stress hormone cortisol) in response to the TSST. Many investigators have adopted salivary sampling for stress markers such as cortisol and alpha-amylase (a marker of autonomic nervous system activation) as an alternative to blood sampling to reduce the confounding stress of blood-collection techniques. In addition to changes experienced by an individual completing the TSST, researchers can compare changes between different treatment groups (e.g. clinical versus healthy control samples) or the effectiveness of stress-reducing interventions.1

This article describes a protocol for inducing psychological stress in participants, which enables researchers to measure psychological, physiological and neuroendocrine responses to stress within single participants or between groups.

Die Trier Social Stress Test-Protokoll zur Induktion psychischer Stress

This article demonstrates a psychological stress protocol for use in a laboratory setting.  Protocols that allow researchers to study the biological ...

Transabdominal Ultrasound for Pregnancy Diagnosis in Reeves' Muntjac Deer

Reeves' muntjac deer (Muntiacus reevesi) are a small cervid species native to southeast Asia, and are currently being investigated as a potential model of prion disease transmission and pathogenesis. Vertical transmission is an area of interest among researchers studying infectious diseases, including prion disease, and these investigations require efficient methods for evaluating the effects of maternal infection on reproductive performance. Ultrasonographic examination is a well-established tool for diagnosing pregnancy and assessing fetal health in many animal species1-7, including several species of farmed cervids8-19, however this technique has not been described in Reeves' muntjac deer. Here we describe the application of transabdominal ultrasound to detect pregnancy in muntjac does and to evaluate fetal growth and development throughout the gestational period. Using this procedure, pregnant animals were identified as early as 35 days following doe-buck pairing and this was an effective means to safely monitor the pregnancy at regular intervals. Future goals of this work will include establishing normal fetal measurement references for estimation of gestational age, determining sensitivity and specificity of the technique for diagnosing pregnancy at various stages of gestation, and identifying variations in fetal growth and development under different experimental conditions.

Transabdominal Ultrasound for Pregnancy Diagnosis in Reeves&#039; Muntjac Deer

Transabdominal ultrasound is described as an effective, noninvasive means for assessing reproductive status in Reeves' muntjac deer. These methods can be used to achieve early pregnancy diagnosis and to evaluate fetal viability. Future applications of this technique include estimation of gestational age and effects of maternal disease on fetal development.

Transabdominaler Ultraschall für die Schwangerschaftsdiagnose in Reeves' Muntjac-Hirsch

Reeves' muntjac deer (Muntiacus reevesi) are a small cervid species native to southeast Asia, and are currently being investigated as a potential model of ...

Diagnosis of Musculus Gastrocnemius Tightness - Key Factors for the Clinical Examination

Common foot and ankle pathologies have been linked to isolated Musculus gastrocnemius tightness (MGT). Various examination techniques have been described to assess MGT. Still, a standardized examination procedure is missing. Literature argues for weightbearing examination but the degree of knee flexion needed to eliminate the restraining effect of the M. gastrocnemius on ankle dorsiflexion (ADF) is unknown. This manuscript investigates the effect of knee flexion on ankle dorsiflexion and provides a detailed description of a standardized examination protocol. Examination on 20 healthy individuals revealed, that 20&#176; of knee flexion is sufficient to fully eliminate the influence of the M. gastrocnemius on ADF. This builds the prerequisite for a standardized examination for MGT. Non-weightbearing and weightbearing examination of ADF has to be conducted with the knee fully extended and at least 20&#176; flexed. Two investigators should conduct non-weightbearing testing with the subject in supine position. In order to obtain reliable results, the axis of the fibula should be marked. One examiner can conduct weightbearing examination with the subject in lunge stance. Isolated MGT is present if ADF is impaired with the knee fully extended and knee flexion results in a significant ADF increase. The herein presented standardized examination is the prerequisite for future studies aiming at establishing norm values.

Diagnosis of Musculus Gastrocnemius Tightness - Key Factors for the Clinical Examination

Isolated Musculus gastrocnemius tightness is a common cause for foot and ankle pathologies. Currently no standardized examination procedure exists. This manuscript demonstrates that 20 degree of knee flexion eliminates the restraining effect of the M. gastrocnemius on ankle dorsiflexion and presents a video description of a standardized examination protocol.

Die Diagnose der<em&gt; Musculus Gastrocnemius</em&gt; Dichtigkeits - Schlüsselfaktoren für die klinische Untersuchung

Common foot and ankle pathologies have been linked to isolated Musculus gastrocnemius tightness (MGT). Various examination techniques have been described ...

Hydra, a Computer-Based Platform for Aiding Clinicians in Cardiovascular Analysis and Diagnosis

Cardiovascular diseases (CVDs) are the leading cause of death throughout the world. The total risk of developing CVD is determined by the combined effect of different cardiovascular risk factors (e.g., diabetes, raised blood pressure, unhealthy diet, tobacco use, stress, etc.) that commonly coexist and act multiplicatively. Most CVDs can be prevented by an early identification of the highest risk factors and an appropriate treatment. The stratification of cardiovascular risk factors involves a wide range of parameters and tests that specialists use in their clinical practice. In addition to cardiovascular (CV) risk stratification, ambulatory blood pressure monitoring (ABPM) also provides relevant information for diagnostic and treatment purposes. This work presents a list of protocols based on the Hydra platform, a web-based system for clinical decision support which incorporates a set of functionalities and services that are required for complete cardiovascular analysis, risk assessment, early diagnosis, treatment and monitoring of patients over time. The program includes tools for inputting and managing comprehensive patient data, organized into different checkups to track the evolution over time. It also has a risk stratification tool to compute a CV risk factor based upon several risk stratification tables of reference. Additionally, the program includes a tool that incorporates ABPM analysis and allows the extraction of valuable information by monitoring blood pressure over a specific period of time. Finally, the reporting service summarizes the most relevant information in a set of reports that aid clinicians in their clinical decision-making process.

This article presents a protocol based on Hydra &#8212; a web-based system for clinical decision support that integrates a full and detailed set of functionalities and services required by physicians for complete cardiovascular analysis, risk assessment, early diagnosis, treatment, and monitoring over time.

Hydra, eine Computer-basierte Plattform für die Unterstützung der Kliniker in der Herz-Kreislauf-Analyse und Diagnose

Cardiovascular diseases (CVDs) are the leading cause of death throughout the world. The total risk of developing CVD is determined by the combined effect ...

International Expert Consensus and Recommendations for Neonatal Pneumothorax Ultrasound Diagnosis and Ultrasound-guided Thoracentesis Procedure

Pneumothorax (PTX) represents accumulation of the air in the pleural space. A large or tension pneumothorax can collapse the lung and cause hemodynamic compromise, a life-threatening disorder. Traditionally, neonatal pneumothorax diagnosis has been based on clinical images, auscultation, transillumination, and chest X-ray findings. This approach may potentially lead to a delay in both diagnosis and treatment. The use of lung US in diagnosis of PTX together with US-guided thoracentesis results in earlier and more precise management. The recommendations presented in this publication are aimed at improving the application of lung US in guiding neonatal PTX diagnosis and management.

Pneumothorax is a common emergency and critical disease in newborn infants that needs rapid, clear diagnosis and timely treatment. Diagnosis and treatment based on chest X-rays are associated with delayed management and radiation damage. Lung ultrasound (US) provides useful guidance for rapid, accurate diagnosis and the precise thoracentesis of pneumothorax.

Internationaler Expertenkonsens und Empfehlungen für neonatale Pneumothorax-Ultraschalldiagnostik und Ultraschall-geführte Thorazenese-Verfahren

Pneumothorax (PTX) represents accumulation of the air in the pleural space. A large or tension pneumothorax can collapse the lung and cause hemodynamic ...

Diagnosis and Surgical Treatment of Human Brucellar Spondylodiscitis

Brucellar spondylodiscitis (BS) is the most prevalent and significant osteoarticular presentation of human Brucellosis, which is commonly manifested in pastoral communities. It is difficult to differentially diagnose and usually leads to irreversible neurologic deficits and spinal deformities. The initial diagnosis of BS is based on clinical findings and radiographic assessments, and the confirmed diagnosis should be established by the isolation of Brucella species from the blood and/or the standard tube agglutination test. Differential diagnosis of multifocal BS from either degenerative disc diseases or tuberculosis is especially highlighted. The surgical approach, either endoscopic or open, is demonstrated in detail, accompanied by radiographic evidence of structural compression or severe instability. Further, the crucial surgical steps, including single-stage transforaminal decompression, debridement, interbody fusion, and internal fixation, are explained. Moreover, perioperative care and postoperative rehabilitation are also addressed. Taken together, this clinical algorithm presents a practical guide that has yielded substantially satisfactory outcomes in the past decades, which can also be introduced for large-scale application to manage human BS, especially in endemic regions.

We describe a clinical algorithm, based on decades of front-line experience of diagnosis and surgical treatment of human Brucellar spondylodiscitis in the largest medical center of the China's Xinjiang Pastoral Area.

Diagnose und chirurgische Behandlung von Human Brucellar Spondylodiscitis

Brucellar spondylodiscitis (BS) is the most prevalent and significant osteoarticular presentation of human Brucellosis, which is commonly manifested in ...

Testing Acetylcholine Followed by Adenosine for Invasive Diagnosis of Coronary Vasomotor Disorders

More than 50% of patients with signs and symptoms of myocardial ischemia undergoing coronary angiography have unobstructed coronary arteries. Coronary vasomotor disorders (impaired vasodilatation and/or enhanced vasoconstriction/spasm) represent important functional causes for such a clinical presentation. Although impaired vasodilatation may be assessed with non-invasive techniques such as positron emission tomography or cardiac magnetic resonance imaging, there is currently no reliable non-invasive technique for the diagnosis of coronary spasm available. Thus, invasive diagnostic procedures (IDP) have been developed for the diagnosis of coronary vasomotor disorders including spasm testing as well as assessment of coronary vasodilatation. The identification of the underlying type of disorder (so called endotype) allows the initiation of targeted pharmacological treatments. Despite the fact that such an approach is recommended by the current European Society of Cardiology guidelines for the management of chronic coronary syndromes based on the CorMicA study, comparability of results as well as multicenter trials are currently hampered by major differences in institutional protocols for coronary functional testing. This article describes a comprehensive IDP protocol including intracoronary acetylcholine provocation testing for diagnosis of epicardial/microvascular spasm, followed by Doppler wire-based assessment of coronary flow reserve (CFR) and hyperemic microvascular resistance (HMR) in search of coronary vasodilatory impairment.

Coronary vasomotion disorders represent frequent functional causes of angina in patients with unobstructed coronaries. The underlying mechanism of angina (endotype) in these patients can be determined by a comprehensive invasive diagnostic procedure based on acetylcholine provocation testing followed by Doppler-derived assessment of the coronary flow reserve and microvascular resistance.

Testen von Acetylcholin gefolgt von Adenosin zur invasiven Diagnose von koronaren vasomotorischen Störungen

More than 50% of patients with signs and symptoms of myocardial ischemia undergoing coronary angiography have unobstructed coronary arteries. Coronary ...

Measurement of Myocardial Lactate Production for Diagnosis of Coronary Microvascular Spasm

In about a quarter of patients with angina and non-obstructive coronary arteries, no epicardial spasm is noted on coronary arteriography during an angina attack. Since the pressure-rate product is almost identical at rest and the onset of attack in those patients, the decrease in coronary blood flow rather than increased myocardial oxygen consumption is likely to explain myocardial ischemia, indicating a substantial involvement with coronary microvascular spasm (MVS). Myocardial lactate production, which could be defined as a negative myocardial lactate extraction ratio (ratio of the coronary arterial-venous difference in lactate concentration to arterial concentration), is considered indicative of objective evidence to support the emerging myocardial ischemia. Thus, monitoring of the myocardial lactate production and the emergence of chest pain and ischemic electrocardiographic changes during acetylcholine (ACh) provocation testing is of significant value for detecting the entity of MVS. Practically, 1 min after incremental doses of ACh (20, 50, and 100 &#956;g) are administered into the left coronary artery (LCA), paired samples of 1 mL of blood are collected from the LCA ostium and coronary sinus for measurement of lactate concentration by a calibrated automatic lactate analyzer. Then, the development of MVS could be confirmed by negative myocardial lactate extraction ratio despite the absence of angiographically demonstrable epicardial coronary spasm or before its occurrence throughout ACh provocation testing. In conclusion, assessment of myocardial lactate production is essential and valuable for the diagnosis of MVS.

Myocardial lactate production (coronary arterial-venous difference in serum lactate level) during coronary spasm provocation testing is considered as a highly sensitive marker that reflects acetylcholine-induced myocardial ischemia due to microvascular spasm. This article presents the procedures to assess myocardial lactate production for the diagnosis of coronary microvascular spasm.

Messung der myokardialen Laktatproduktion zur Diagnose des koronaren mikrovaskulären Spasmus

In about a quarter of patients with angina and non-obstructive coronary arteries, no epicardial spasm is noted on coronary arteriography during an angina ...

High-speed Video Microscopy Analysis for First-line Diagnosis of Primary Ciliary Dyskinesia

Primary ciliary dyskinesia (PCD) is a congenital disorder predominantly inherited in an autosomal recessive trait. The disorder causes disturbance in the motion of cilia, leading to severe impairment of mucociliary clearance (MCC). If undiagnosed or diagnosed too late, the condition leads to the development of bronchiectasis and serious damage to the lungs in later life. Most of the methods for diagnosing PCD are time-consuming and demand extensive economic resources to establish them. High-speed video microscopy analysis (HSVMA) is the only diagnostic tool to visualize and analyze living respiratory cells with beating cilia in vitro. It is fast, cost-effective, and, in experienced hands, very reliable as a diagnostic tool for PCD. In addition, classical diagnostic measures such as transmission electron microscopy (TEM) are not applicable for some mutations as morphological changes are absent. 
This paper describes the process of collecting respiratory epithelial cells, the further preparation of the specimen, and the process of HSVMA. We also describe how brushed cells can be successfully kept unharmed and beating by keeping them in a nourishing medium for storage and transport to the investigation site in cases where a clinic does not possess the equipment to perform HSVMA. Also shown are videos with pathologic beating patterns from patients with a mutation in the dynein arm heavy chain 11 gene (DNAH11), which cannot be diagnosed with TEM; the result of an inconclusive HSVMA due to infection of the upper airways, as well as an unsuccessful brushing with superimposition of red blood cells. With this article, we would like to encourage every unit dealing with pulmonology patients and rare lung diseases to perform HSVMA as part of their daily routine diagnostics for PCD or send the specimens over to a center specializing in performing HSVMA.

High-speed video microscopy analysis is a relatively easy-to-perform, fast, cost-effective, and, in experienced hands, a considerably reliable tool for first-line diagnostics of primary ciliary dyskinesia, which should be available in every center involved in diagnostics and the treatment of severe lung diseases.

Hochgeschwindigkeits-Videomikroskopie-Analyse für die Erstliniendiagnose der primären ziliären Dyskinesie

Primary ciliary dyskinesia (PCD) is a congenital disorder predominantly inherited in an autosomal recessive trait. The disorder causes disturbance in the ...