Name: basophil activation test for allergy diagnosis
Uploaded: 2021-05-31T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Basophil Activation Test for Allergy Diagnosis at JoVE.com

אנו מודים לקלאודיה קוראצה על תמיכתה בשפה האנגלית שלא תסולא בפז. עבודה זו נתמכה על ידי המכון לבריאות ''קרלוס השלישי'' (ISCIII) של MINECO (מענק במימון משותף של ERDF: "Una manera de hacer Europa"; מענקים מס' PI20/01715; PI18/00095; PI17/01410; PI17/01318; PI17/01237 ו- RETIC ARADYAL RD16/0006/0001; משרד הבריאות האזורי של אנדלוסיה (מענק מס' PI-0127-2020, PIO-0176-2018; PE-0172-2018; PE-0039-2018; PC-0098-2017; PI-0075-2017; PI-0241-2016). ID הוא חוקר קליני (B-0001-2017) ו-AA מחזיק בחוזה פוסט-דוקטורט בכיר (RH-0099-2020), שניהם נתמכים על ידי משרד הבריאות האזורי של אנדלוסיה (במימון משותף של ESF: "Andalucía se mueve con Europa").

ביצוע הפרוטוקול נערך על פי עקרונות הצהרת הלסינקי ואושר על ידי ועדת האתיקה המקומית (Comité de Ética para la Investigación Provincial de Málaga, ספרד). כל הנבדקים קיבלו מידע בעל פה על המחקר והם חתמו על טופס ההסכמה מדעת המתאים.
הערה: הפרוטוקול הנוכחי מפרט את הליך ה-BAT שבו משתמשים המחברים מדי יום. עם ...

BAT הוא מבחן אבחון משלים במבחנה להערכת תגובות אלרגיות בתיווך IgE שהוכח כיעיל באבחון תגובות המושרות על ידי טריגרים שונים כגון תרופות, מזון או ממסים נדיפים, כמו גם בצורות מסוימות של אורטיקריה כרונית. באופן כללי, יש לשקול ביצועי BAT אם i) האלרגן/התרופה מייצרים תוצאות חיוביות שגויות ב-ST; ii) האלר...

אבחון אלרגיה בתיווך IgE מבוסס על היסטוריה קלינית, בדיקות עור (STs), כימות של IgE ספציפי לסרום (sIgE), ואם הוא נדרש ומצוין, בדיקות אתגר מבוקרות (CCTs)1,2,3,4,5,6. עם זאת, ההיסטוריה הקלינית יכולה להיות לא אמינה מכיוון שייתכן שיש מחסור במידע מדויק, ו- STs ו- CCTs אינם הליכים נטולי סיכון שיכולים להיות התווית בנבדקים החווים תגובות מסכנות חיים חמורות 1,2,3,4,5,6 . סוגיות אלה, יחד עם העובדה שקביעת sIgE על ידי אימונו-אנזים פלואורו-אנזים מאומת ומסחרי זמינה רק עבור אלרגנים ותרופות מעטים, הדגישו את התפקיד החשוב של מבחנים פונקציונליים אחרים במבחנה כגון בדיקת הפעלה בזופילית (BAT).
בזופילים הם תאי מפתח המעורבים בתגובות אלרגיות בתיווך IgE המופעלות על קישור צולב של sIgE סמוך הקשור לקולטני זיקה גבוהה (FcεRI) על פני התא לאחר חשיפה לאלרגן/תרופה. הפעלת בזופיל גורמת לפירוק תאים ולשחרור של מתווכי דלקת מסונתזים מראש וחדשים הכלולים בגרגירי הפרשה תוך-ציטופלסמטיים 7,8,9. BAT היא שיטת in vitro המנסה לחקות את הפעלת הבזופיל בנוכחות גירוי (אלרגן או תרופה) וקובעת שינויים בביטוי של סמני הפעלה בזופיליים על ידי ציטומטריה של זרימה 7,10. ישנן אסטרטגיות שונות לזיהוי בזופילים (IgE+, CCR3+, CRTH2+, CD203c+) ולמדידת הפעלת תאים (בעיקר ויסות של CD63 ו-CD203c) באמצעות שילובים של נוגדנים בעלי תווית פלואורוכרום 7,10. CD63, סמן ההפעלה המאומת ביותר קלינית 11,12,13,14, הוא חלבון ממברנה המעוגן בגרגירי ההפרשה המכילים היסטמין, שלאחר הפעלת התא ואיחוי הגרגירים עם הממברנה, מתבטא על משטח בזופיל 15,16,17,18,19,20,21 . CD203c הוא סמן פני השטח המתבטא באופן מכונן על בזופילים ומווסת לאחר גירוי FcεRI, אשר הראה גם תוצאות אמינות ב- BAT 15,22,23,24,25. חוץ מזה, נראה שהוא מבטא במשותף עם CD6326.
בעשורים האחרונים, BAT הוכיח להיות שימושי באבחון של תגובות אלרגיות בתיווך IgE המושרה על ידי גורמים שונים כמו סמים, מזון, או ממסים נדיפים, כמו גם בצורות מסוימות של אורטיקריה כרונית, כפי שמתואר להלן. עם זאת, המיקום של טכניקה זו באלגוריתמים אבחון הוא משתנה מאוד ולא נקבע היטב.
רגישות יתר לסמים BAT הוכחה כיעילה כבדיקה משלימה עבור תרופות וחולים נבחרים, במיוחד עבור אלה שחווים תגובות חמורות בשל העובדה כי הערך האבחנתי של ST אינו מבוסס היטב עבור רוב התרופות, שכן הם מאומתים ומתוקננים עבור מספר מוגבל של תרופות27,28,29,30. בנוסף, כימות של sIgE זמין רק עבור מספר מוגבל של תרופות, עם רגישות נמוכה יותר מאשר ST 27,28,29,30,31,32. לכן, האבחנה של רגישות יתר לסמים מסתמכת בדרך כלל על בדיקת פרובוקציה של סמים, אשר יכולה להיות התווית אצל נבדקים החווים תגובות מסכנות חיים חמורות33.
תוצאות מבטיחות דווחו לשימוש ב- BAT בחולים נבחרים המדווחים על תגובות רגישות יתר מיידיות לתרופות שונות כמו בטאלקטמים (BLs)20,34,35,36,37,38,39, חומרים חוסמים עצביים-שריריים (NMBAs)19,22,40,41,42, 43,44,45, פלואורוקווינולונים (FQs)46,47,48,49, פיראזולונים50,51,52, מדיה רדיוקונטרנטית (RCM)53,54,55,56 ותרכובות פלטינה57,58,59 . דווח כי ל-BAT יש רגישות וספציפיות בין 51.7-66.9% ל-89.2-97.8%, בהתאמה; וערכי ניבוי חיוביים ושליליים מתוארים בטווח שבין 93.4% ל-66.3%,בהתאמה 27,31. יתר על כן, BAT הוצע כסמן ביולוגי מנבא לתגובות פורצות דרך במהלך דה-סנסיטיזציה עם תרכובות פלטינה, שכן ביטוי CD203c מוגבר בהשוואה ל- CD63 בחולים עם סיכון גבוה לתגובות שליליות במהלך רגישות לתרופות57.
יש לציין כי BAT שימושי רק רגישות יתר לסמים כאשר התגובה כרוכה degranulation basophil; לכן, הוא אינו שימושי בתגובות הנובעות מעיכוב אנזימטי של ציקלואוקסיגנאז 142.
אלרגיה למזון BAT התגלה ככלי אבחון פוטנציאלי לאלרגיה למזון מכיוון שקביעת sIgE בסרום לכל תמצית האלרגנים או לאלרגנים בודדים היא לעתים קרובות מעורפלת, ודורשת אתגר מזון אוראלי כדי לאשר את האבחנה, אשר, בדומה לרגישות יתר לתרופות, היא הליך יקר ולא נטול סיכון60. מספר מחקרים הראו תוצאות רלוונטיות עם חלב פרה 61,62, ביצה61,63, חיטה 64,65,66,67,68, בוטנים 63,69,70,71,72, אגוזי לוז 73,74,75,76 ,77, רכיכות78, אפרסק 79,80,81, תפוח21, סלרי וגזר 82,83.
הערך המוסף העיקרי של BAT באבחון אלרגיה למזון בהשוואה ל- STs ו- sIgE בסרום הוא שהוא מראה ספציפיות גבוהה יותר ורגישות דומה. לפיכך, BAT הוא כלי שימושי כדי להבדיל בין מטופלים אלרגיים קלינית לבין נבדקים רגישים, אך סובלניים, שיש להם גם ספציפיות גבוהה (75-100%) וגם רגישות (77-98%)63,69,84. ערכי הרגישות והספציפיות תלויים באלרגן ובגורמים אחרים כפנוטיפים (למשל, תסמונת אלרגיה אוראלית לעומת אנפילקסיס), גיל ודפוסי רגישות הקשורים לגיאוגרפיה63,85.
BAT באמצעות רכיבי אלרגן בודדים יכול לשפר את דיוק האבחון עבור אלרגנים מסוימים במזון 61,80. ישנם מחקרים המשתמשים בחלבוני אחסון זרעים (למשל, Ara h 1, Ara h 2, Ara h 3 ו-Ara h 6 מבוטנים)86; חלבוני העברת שומנים (למשל, Pru p 3 מאפרסק ו- Ara h 9 מבוטנים)80,86; ו-Bet v 1 הומולוגים (למשל, Ara h 8 מתוך בוטנים)87. שירותים פוטנציאליים אחרים קשורים לזיהוי האלרגן האשם במקרים של תסמונת אלרגיה למזון 21,87,88, אלרגיה לבשר אדום 89, או אנפילקסיס הנגרם על ידי פעילות גופנית תלוית מזון66.
מעניין, BAT יכול לספק מידע על חומרת וסף של תגובות אלרגיות מאז חולים עם תגובות חמורות יותר להראות שיעור גדול יותר של בזופילים מופעלים, כפי שנצפה במחקרים של בוטנים וחלב פרה אלרגיים חולים 84,90,91; וחולים המגיבים לכמויות זעירות של האלרגן מראים רגישות בזופילית גדולה יותר 84,90,92. נתונים אלה מצביעים על כך ש- BAT עשוי להיות שימושי לזיהוי חולים אלרגיים בסיכון גבוה הזקוקים למעקב צמוד יותר ולחינוך מוגבריותר 93. יתר על כן, דווח כי BAT יכול לחזות תגובות לאתגר מזון 70,91,92,94 וסף של תגובתיות90,95 כדי לעזור לקבוע מתי ניתן להכניס מזון בבטחה (מחדש) 84. עם זאת, ממצאים אלה שנויים במחלוקת בחלק מהמחקרים63,96 ונדרשים מחקרים נוספים.
מאידך גיסא, BAT שימש לניטור רזולוציה של אלרגיה למזון, באופן טבעי או תחת טיפולים אימונומודולטוריים, לאורך זמן, אשר עד כה הוערך רק על ידי אתגר מזון אוראלי, עם הסיכונים הקשורים ועלויות 84,97,98,99,100,101,102,103,104,105,106 ,107,108. יתר על כן, הוא שימש גם כדי לפקח על ההשפעה של omalizumab באלרגיה למזון כמו ההפעלה basophil פוחתת במהלך הטיפול עם omalizumab, אבל זה עולה לאחר הפסקת הטיפול109.
אלרגיה ממסים נדיפים BAT מועיל רק לעתים רחוקות באלרגיה ממסים נדיפים, שכן ניתן לקבוע אבחנה באופן שגרתי על ידי כימות sIgE ו-ST. עם זאת, במקרים של נזלת אלרגית מקומית (רמות בלתי ניתנות לגילוי של sIgE ו- STs שליליים עם בדיקות פרובוקציה חיוביות באף), BAT אפשרה אבחון ב -50% מהמקרים110. עוד דווח על קשר בין רגישות לבזופיל ותגובה לבדיקות פרובוקציה באף/בסימפונות, וכן בין חומרת אסתמה ליעילות הטיפול באומליזומאב111,112.
BAT שימש גם לניטור אימונותרפיה של אלרגנים עבור קרדית אבק הבית ואבקנים, שכן הרגישות לבזופילים פוחתת במהלך אימונותרפיה, ככל הנראה עקב הפרעה של חסימת נוגדני IgG 113,114,115,116,117.
אלרגיה לארס קרום הבתולים אבחנה של אלרגיה לארס קרום הבתולים מבוססת באופן שגרתי על ST וסרום sIgE. BAT הראה רגישות גבוהה (85-100%) וספציפיות גבוהה (83-100%) ודווח כי הוא שימושי במקרים המניבים תוצאות חד משמעיות או בחולים עם היסטוריה קלינית מרומזת של אלרגיה לארס אך sIgE בלתי ניתן לגילוי ו- ST118,119 שלילי. עם זאת, נראה כי BAT אינו מנבא את חומרת התגובות הללו120,121.
עד 60% מהחולים מפגינים sIgE הן לארס הצרעות והן לארס הדבורים, וזיהוי האלרגן הדומיננטי חיוני לטיפול אימונותרפי הולם. במקרים אלה, דווח כי BAT שימושי בזיהוי האלרגן הדומיננטי 119,122,123,124. למרות ש- sIgE לאלרגנים העיקריים של ארס דבורים וצרעות עשוי להפחית את התועלת של BAT בחולים עם חיוביות כפולה לשני הארסים, הוא מספק מידע שימושי בעיקר בנושאים עם תוצאות שליליות בקביעות sIgE123.
מחקרים מסוימים מצביעים על כך ש-BAT עשוי להיות שימושי כסמן ביולוגי מנבא לתופעות לוואי במהלך שלב ההצטברות של אימונותרפיה של ארס, שכן דווח כי אפשרות טיפול זו מפחיתה את הרגישות לבזופיל. עם זאת, תגובתיות אינה פוחתת וזה BAT השירות שנוי במחלוקת כיום 13,120,125,126,127,128,129,130.
אורטיקריה ואנגיואדמה לתת-קבוצה של חולי אורטיקריה כרונית יש פתופיזיולוגיה אוטואינמונית, עקב נוגדנים עצמיים של IgE לאוטואלרגנים ונוגדנים עצמיים של IgG המכוונים לקומפלקסים FcεRI או IgE-FcεRI הנמצאים על פני התא הפיטום131,132. בתרגול הקליני, אבחון של סוג זה של אורטיקריה כרונית הסתמך על סרום אוטולוגי חיובי ST, אשר יש סיכון של זיהום בשוגג. BAT הוצע כבדיקת מבחנה לאבחון ומעקב אחר חולים עם חשד לאורטיקריה כרונית. הן CD63 והן CD203c ביטוי על פני השטח של בזופילים דווח כי הוא מוגבר בעקבות גירוי עם sera מחולי אורטיקריה כרונית, מראה זיהוי של נוגדנים עצמיים פעילים 133,134,135,136,137. לאחרונה דווח כי חולים עם BAT חיובי חווים לעתים קרובות את מצב המחלה הפעיל ביותר, המוערך על ידי ציון פעילות אורטיקריה, וזקוקים למינונים גבוהים יותר של אנטיהיסטמינים יחד עם טיפולי קו שלישי (ציקלוספורין A או omalizumab), בהשוואה לאלה עם BAT138 שלילי.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, without Cap, Nonsterile</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC anti-human CD193 (CCR3) Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>310708</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSCalibur Flow Cytometer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC anti-human CD63 Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>353006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES (1 M)</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>15630106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysing Solution 10x concentrated</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>349202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Formyl-Met-Leu-Phe</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F3506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE anti-human CD203c (E-NPP3) Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>324606</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purified Mouse Anti-Human IgE</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555857</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human IL-3</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>203-IL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sheath Fluid</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>342003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S3014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TUBE 9 mL LH Lithium Heparin</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>455084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1379</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

basophil activation test for allergy diagnosis

בדיקת ההפעלה הבזופילית (BAT) היא בדיקת אבחון משלימה במבחנה שניתן להשתמש בה בנוסף להיסטוריה קלינית, בדיקת עור (ST) וקביעת IgE (sIgE) ספציפית בהערכת תגובות אלרגיות בתיווך IgE למזון, ארס חרקים, תרופות, כמו גם צורות מסוימות של אורטיקריה כרונית. עם זאת, תפקידה של טכניקה זו באלגוריתמי האבחון משתנה מאוד ולא נקבע היטב.
BAT מבוסס על קביעת התגובה הבזופילית להפעלת IgE צולבת של אלרגן/תרופה באמצעות מדידת סמני הפעלה (כגון CD63, CD203c) על ידי ציטומטריה של זרימה. בדיקה זו יכולה להיות כלי שימושי ומשלים כדי למנוע בדיקות אתגר מבוקרות כדי לאשר אבחון אלרגיה, במיוחד בנבדקים החווים תגובות מסכנות חיים חמורות. באופן כללי, יש לשקול את הביצועים של BAT אם i) האלרגן/התרופה מייצר תוצאות חיוביות שגויות ב-ST; ii) אין מקור אלרגן/תרופה לשימוש לצורך קביעת ST או sIgE; 3) קיימת מחלוקת בין היסטוריית המטופלים לבין קביעת ST או sIgE; 4) הסימפטומים מצביעים על כך ש-ST עלול לגרום לתגובה מערכתית; v) לפני ששוקלים CCT כדי לאשר את האלרגן/התרופה האשם. המגבלות העיקריות של הבדיקה קשורות לרגישות לא אופטימלית, במיוחד באלרגיה לתרופות, הצורך לבצע את הבדיקה לא יותר מ-24 שעות לאחר מיצוי הדגימה, והיעדר סטנדרטיזציה בין המעבדות מבחינת נהלים, ריכוזים וסמנים תאיים.

BAT המבוצע עם אלרגנים או תרופות מאפשר חקירה של תגובות רגישות יתר תלויות IgE. תגובתיות בזופילית צריכה להימדד בשני ריכוזים אופטימליים לפחות על מנת להשיג את התוצאות הטובות ביותר34 וההפעלה מומחשת על ידי ויסות של CD63 על פני התא. במקרה של אלרגנים, יתר על כן, כדי לאשר את תגובתיות הבזופיל, ?...

Watch this Scientific Journal Video about Basophil Activation Test for Allergy Diagnosis at JoVE.com

Basophil Activation Test for Allergy Diagnosis

מבחן ההפעלה הבזופילי הוא מבחן אבחון משלים במבחנה להערכת תגובות אלרגיות בתיווך IgE המבוסס על זיהוי הפעלת בזופיל בנוכחות גירוי מסוים באמצעות מדידת סמני הפעלה על ידי ציטומטריה של זרימה.

בדיקת הפעלת בזופיל לאבחון אלרגיה

The basophil activation test (BAT) is a complementary in vitro diagnostic test that can be used in addition to clinical history, skin test (ST), and ...

בדיקת ההפעלה הבזופילית היא בדיקת אבחון חוץ-גופית משלימה להערכת תגובות אלרגיות בתיווך IgE שהוכחו כמועילות לתגובות המושרות על ידי תרופות, מזון או ממסים נדיפים, כמו גם בצורות מסוימות של אורטיקריה כרונית. בדיקה זו מבוססת על קביעת תגובה בזופילית לאלרגן או להפעלת IgE צולבת של תרופה באמצעות מדידת סמני הפעלה על ידי ציטומטריה של זרימה. בדיקת ההפעלה הבזופילית יכולה להיות כלי שימושי ומחמיא כדי להימנע מבדיקות אתגר מבוקרות כדי לאשר אבחנה של אלרגיה, במיוחד בנבדקים שחווים תגובות מסכנות חיים חמורות.יתר על כן, בדיקה זו יש את היתרון של היכולת לנתח את התגובה נגד כל תרופה או אלרגן לעומת שיטות אחרות in vitro כי הם זמינים רק עבור כמה תרופות ואלרגנים. המגבלות העיקריות של הבדיקה קשורות לרגישות לא אופטימלית, במיוחד באלרגיה לסמים. הצורך לבצע את הבדיקה לא יותר מ 24 שעות לאחר מיצוי הדגימה וחוסר סטנדרטיזציה בין מעבדות ואלגוריתמים אבחון.התחל על ידי איסוף דם היקפי בצינורות הפרינים של תשעה מיליליטר, והנח את הדגימות ברוטור כדי לשמור עליהן בטמפרטורת החדר עד שהן נדרשות לפרוטוקול הניסוי. תייג שני צינורות ציטומטר חמישה מיליליטר כל אחד לשליטה שלילית ושליטה חיובית. כמו כן, יש לסמן שפופרת אחת כל אחת עבור ריכוזי האלרגנים או התרופות השונים הנבדקים.לאחר מכן מניחים את הצינורות במדף כך שהצינורות יתאימו בצורה מושלמת מבלי להחליק. לקבלת הבקרה החיובית הראשונה, הכינו תמיסת ארבעה מיקרומולרים של N-פורמיל-מתיוניל לאוציל-פנילאלנין או fMLP ב-0.05% PBS-T כדי לאשר את איכות הבזופילים. לקבלת הבקרה החיובית השנייה, הכן תמיסת אנטי-IgE של 0.05 מיליגרם למיליליטר באמצעות PBS-T.הכינו את תערובת הצביעה על ידי הוספת מיקרוליטר אחד לכל אחד מנוגדני CCR3-APC, CD203c-PE ו-CD63-FITC לכל 20 מיקרוליטרים של מאגר הגירוי. לאחר מכן הוסף 23 מיקרוליטר של תערובת מכתים זו לכל צינור. הוסף 100 מיקרוליטרים של PBS-T לצינורות הבקרה השלילית.הוסף 100 מיקרוליטרים של fMLP לאחד מצינורות הבקרה החיוביים והוסף 100 מיקרוליטרים של אנטי-IgE E לשני לשאר הצינורות. מוסיפים 100 מיקרוליטרים של ריכוזי האלרגנים או התרופות השונים ודוגרים ב 37 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות. לאחר הדגירה, להוסיף 100 microliters של דם לכל צינור בעדינות כדי למנוע המוליזה.ואז בעדינות מערבל את הצינורות לדגור אותם במשך 25 דקות ב 37 מעלות צלזיוס באמבט תרמוסטטי עם תסיסה בינונית. שמור את הצינורות על ארבע מעלות צלזיוס לפחות חמש דקות כדי לעצור את degranulation. לכל צינור, להוסיף שני מיליליטר של חיץ lysing כדי lyse את אריתרוציטים.מערבלים כל צינור ולאחר מכן דגירה של הצינורות במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. צנטריפוגה את הצינורות ב 300 גרם בארבע מעלות צלזיוס במשך חמש דקות. לאחר מכן הפכו את המדף לתוך הכיור כדי לרוקן את הסופר-נטנט בזמן שהתאים נשארים בתחתית הצינורות.הוסף שלושה מיליליטר של PBS-T לכל צינור כדי לשטוף את התאים ולמערבל את הצינורות. בצע סיבוב שני של צנטריפוגה באמצעות אותה קבוצה של פרמטרים, ונטרל את הסופרנטנט על ידי הפיכת המדף לכיור. לאחר מכן שמור את הדגימות בארבע מעלות צלזיוס מוגנות מפני אור עד ציטומטריית זרימה.חבר את ציטומטר הזרימה לתוכנת המחשב והמתן עד שהציטומטר יהיה מוכן. טען את הגדרות התבנית והמכשיר כמתואר בכתב היד של הטקסט. התחל את תהליך רכישת המדגם.כדי לבחור בזופילים פעילים, ראשית, שער את הלימפוציטים מן העלילה פיזור צד קדימה. לאחר מכן שער את הבזופילים מאוכלוסיית הלימפוציטים כתאי CCR3+CD203c+ורכוש לפחות 500 בזופילים לכל צינור. הגדר את סף CD63 לכ-2.5% באמצעות צינורות הבקרה השלילית ונתח את הדגימות.תגובות רגישות יתר תלויות IgE נחקרו על ידי ביצוע בדיקת הפעלה בזופילית, או BAT, באמצעות אלרגנים ותרופות. רגישות בזופיל נותחה על ידי מדידת התגובה בריכוזי אלרגנים יורדים מרובים המסייעים לקבוע את הריכוז האלרגי שגורם לתגובה של 50% בזופילים או EC50. ראשית, לימפוציטים היו מגודרים מן הצד פיזור קדימה העלילה לפזור.לאחר מכן בזופילים היו מגודרים מאוכלוסיית הלימפוציטים כתאי CCR3+CD203c+. לאחר מכן נעשה שימוש בעלילת CCR3-CD63 לניתוח הפעלת בזופיל באמצעות CD63 כסמן הפעלה לשתי תרופות וריכוזים שונים של אלרגן. הבדיקה מבוצעת עם דם שלם טרי ויש לבצע אותה לא יותר מ 24 שעות לאחר מיצוי הדם.הגירוי המשמש בבדיקה לא צריך לכלול כל excipients ואת המאפיינים הכימיים של התרופות צריך להיחשב. שיטות נוספות אחרות במבחנה לאבחון תגובות אלרגיות בתיווך IgE, או קביעת sIgE, או בדיקת שחרור היסטמין.

basophil-activation-test-for-allergy-diagnosis

Research

JoVE Journal

Medicine

FISH for Pre-implantation Genetic Diagnosis

Pre-implantation genetic diagnosis (PGD) is an established alternative to pre-natal diagnosis, and involves selecting pre-implantation embryos from a cohort generated by assisted reproduction technology (ART). This selection may be required because of familial monogenic disease (e.g. cystic fibrosis), or because one partner carries a chromosome rearrangement (e.g. a two-way reciprocal translocation). PGD is available for couples who have had previous affected children, and/or in the case of chromosome rearrangements, recurrent miscarriages, or infertility. Oocytes aspirated following ovarian stimulation are fertilized by in vitro immersion in semen (IVF) or by intracytoplasmic injection of an individual spermatozoon (ICSI). Pre-implantation cleavage-stage embryos are biopsied, usually by the removal of a single cell on day 3 post-fertilization, and the biopsied cell is tested to establish the genetic status of the embryo. Fluorescence in situ hybridization (FISH) on the fixed nuclei of biopsied cells with target-specific DNA probes is the technique of choice to detect chromosome imbalance associated with chromosome rearrangements, and to select female embryos in families with X-linked disease for which there is no mutation-specific test. FISH has also been used to screen embryos for spontaneous chromosome aneuploidy (also known as PGS or PGD-AS) in order to try and improve the efficiency of assisted reproduction; however, the predictive value of this test using the spreading and FISH technique described here is likely to be unacceptably low in most people's hands and it is not recommended for routine clinical use. We describe the selection of suitable probes for single-cell FISH, spreading techniques for blastomere nuclei, and in situ hybridization and signal scoring, applied to PGD in a clinical setting.

This article describes the selection of suitable probes for single-cell FISH, spreading techniques for blastomere nuclei, and in situ hybridization and signal scoring, applied to pre-implantation genetic diagnosis (PGD) in a clinical setting.

FISH לאבחון גנטי טרום השרשה

Pre-implantation genetic diagnosis (PGD) is an established alternative to pre-natal diagnosis, and involves selecting pre-implantation embryos from a ...

The Trier Social Stress Test Protocol for Inducing Psychological Stress

This article demonstrates a psychological stress protocol for use in a laboratory setting. Protocols that allow researchers to study the biological pathways of the stress response in health and disease are fundamental to the progress of research in stress and anxiety.1 Although numerous protocols exist for inducing stress response in the laboratory, many neglect to provide a naturalistic context or to incorporate aspects of social and psychological stress. Of psychological stress protocols, meta-analysis suggests that the Trier Social Stress Test (TSST) is the most useful and appropriate standardized protocol for studies of stress hormone reactivity.2 In the original description of the TSST, researchers sought to design and evaluate a procedure capable of inducing a reliable stress response in the majority of healthy volunteers.3 These researchers found elevations in heart rate, blood pressure and several endocrine stress markers in response to the TSST (a psychological stressor) compared to a saline injection (a physical stressor).3 Although the TSST has been modified to meet the needs of various research groups, it generally consists of a waiting period upon arrival, anticipatory speech preparation, speech performance, and verbal arithmetic performance periods, followed by one or more recovery periods. The TSST requires participants to prepare and deliver a speech, and verbally respond to a challenging arithmetic problem in the presence of a socially evaluative audience.3 Social evaluation and uncontrollability have been identified as key components of stress induction by the TSST.4 In use for over a decade, the goal of the TSST is to systematically induce a stress response in order to measure differences in reactivity, anxiety and activation of the hypothalamic-pituitary-adrenal (HPA) or sympathetic-adrenal-medullary (SAM) axis during the task.1 Researchers generally assess changes in self-reported anxiety, physiological measures (e.g. heart rate), and/or neuroendocrine indices (e.g. the stress hormone cortisol) in response to the TSST. Many investigators have adopted salivary sampling for stress markers such as cortisol and alpha-amylase (a marker of autonomic nervous system activation) as an alternative to blood sampling to reduce the confounding stress of blood-collection techniques. In addition to changes experienced by an individual completing the TSST, researchers can compare changes between different treatment groups (e.g. clinical versus healthy control samples) or the effectiveness of stress-reducing interventions.1

This article describes a protocol for inducing psychological stress in participants, which enables researchers to measure psychological, physiological and neuroendocrine responses to stress within single participants or between groups.

מבחן הלחץ החברתי טרייר פרוטוקול גרימת לחץ פסיכולוגי

This article demonstrates a psychological stress protocol for use in a laboratory setting.  Protocols that allow researchers to study the biological ...

Transabdominal Ultrasound for Pregnancy Diagnosis in Reeves' Muntjac Deer

Reeves' muntjac deer (Muntiacus reevesi) are a small cervid species native to southeast Asia, and are currently being investigated as a potential model of prion disease transmission and pathogenesis. Vertical transmission is an area of interest among researchers studying infectious diseases, including prion disease, and these investigations require efficient methods for evaluating the effects of maternal infection on reproductive performance. Ultrasonographic examination is a well-established tool for diagnosing pregnancy and assessing fetal health in many animal species1-7, including several species of farmed cervids8-19, however this technique has not been described in Reeves' muntjac deer. Here we describe the application of transabdominal ultrasound to detect pregnancy in muntjac does and to evaluate fetal growth and development throughout the gestational period. Using this procedure, pregnant animals were identified as early as 35 days following doe-buck pairing and this was an effective means to safely monitor the pregnancy at regular intervals. Future goals of this work will include establishing normal fetal measurement references for estimation of gestational age, determining sensitivity and specificity of the technique for diagnosing pregnancy at various stages of gestation, and identifying variations in fetal growth and development under different experimental conditions.

Transabdominal Ultrasound for Pregnancy Diagnosis in Reeves&#039; Muntjac Deer

Transabdominal ultrasound is described as an effective, noninvasive means for assessing reproductive status in Reeves' muntjac deer. These methods can be used to achieve early pregnancy diagnosis and to evaluate fetal viability. Future applications of this technique include estimation of gestational age and effects of maternal disease on fetal development.

אולטרסאונד Transabdominal לאבחון הריון באייל Muntjac של ריבס

Reeves' muntjac deer (Muntiacus reevesi) are a small cervid species native to southeast Asia, and are currently being investigated as a potential model of ...

Diagnosis of Musculus Gastrocnemius Tightness - Key Factors for the Clinical Examination

Common foot and ankle pathologies have been linked to isolated Musculus gastrocnemius tightness (MGT). Various examination techniques have been described to assess MGT. Still, a standardized examination procedure is missing. Literature argues for weightbearing examination but the degree of knee flexion needed to eliminate the restraining effect of the M. gastrocnemius on ankle dorsiflexion (ADF) is unknown. This manuscript investigates the effect of knee flexion on ankle dorsiflexion and provides a detailed description of a standardized examination protocol. Examination on 20 healthy individuals revealed, that 20&#176; of knee flexion is sufficient to fully eliminate the influence of the M. gastrocnemius on ADF. This builds the prerequisite for a standardized examination for MGT. Non-weightbearing and weightbearing examination of ADF has to be conducted with the knee fully extended and at least 20&#176; flexed. Two investigators should conduct non-weightbearing testing with the subject in supine position. In order to obtain reliable results, the axis of the fibula should be marked. One examiner can conduct weightbearing examination with the subject in lunge stance. Isolated MGT is present if ADF is impaired with the knee fully extended and knee flexion results in a significant ADF increase. The herein presented standardized examination is the prerequisite for future studies aiming at establishing norm values.

Diagnosis of Musculus Gastrocnemius Tightness - Key Factors for the Clinical Examination

Isolated Musculus gastrocnemius tightness is a common cause for foot and ankle pathologies. Currently no standardized examination procedure exists. This manuscript demonstrates that 20 degree of knee flexion eliminates the restraining effect of the M. gastrocnemius on ankle dorsiflexion and presents a video description of a standardized examination protocol.

אבחון<em&gt; Musculus הגסטרוקנמיוס</em&gt; אטים - גורמי מפתח עבור הבדיקה הקלינית

Common foot and ankle pathologies have been linked to isolated Musculus gastrocnemius tightness (MGT). Various examination techniques have been described ...

Hydra, a Computer-Based Platform for Aiding Clinicians in Cardiovascular Analysis and Diagnosis

Cardiovascular diseases (CVDs) are the leading cause of death throughout the world. The total risk of developing CVD is determined by the combined effect of different cardiovascular risk factors (e.g., diabetes, raised blood pressure, unhealthy diet, tobacco use, stress, etc.) that commonly coexist and act multiplicatively. Most CVDs can be prevented by an early identification of the highest risk factors and an appropriate treatment. The stratification of cardiovascular risk factors involves a wide range of parameters and tests that specialists use in their clinical practice. In addition to cardiovascular (CV) risk stratification, ambulatory blood pressure monitoring (ABPM) also provides relevant information for diagnostic and treatment purposes. This work presents a list of protocols based on the Hydra platform, a web-based system for clinical decision support which incorporates a set of functionalities and services that are required for complete cardiovascular analysis, risk assessment, early diagnosis, treatment and monitoring of patients over time. The program includes tools for inputting and managing comprehensive patient data, organized into different checkups to track the evolution over time. It also has a risk stratification tool to compute a CV risk factor based upon several risk stratification tables of reference. Additionally, the program includes a tool that incorporates ABPM analysis and allows the extraction of valuable information by monitoring blood pressure over a specific period of time. Finally, the reporting service summarizes the most relevant information in a set of reports that aid clinicians in their clinical decision-making process.

This article presents a protocol based on Hydra &#8212; a web-based system for clinical decision support that integrates a full and detailed set of functionalities and services required by physicians for complete cardiovascular analysis, risk assessment, early diagnosis, treatment, and monitoring over time.

הידרה, פלטפורמה מבוססת מחשב לסיוע קלינאים ניתוח לב וכלי דם, אבחון

Cardiovascular diseases (CVDs) are the leading cause of death throughout the world. The total risk of developing CVD is determined by the combined effect ...

International Expert Consensus and Recommendations for Neonatal Pneumothorax Ultrasound Diagnosis and Ultrasound-guided Thoracentesis Procedure

Pneumothorax (PTX) represents accumulation of the air in the pleural space. A large or tension pneumothorax can collapse the lung and cause hemodynamic compromise, a life-threatening disorder. Traditionally, neonatal pneumothorax diagnosis has been based on clinical images, auscultation, transillumination, and chest X-ray findings. This approach may potentially lead to a delay in both diagnosis and treatment. The use of lung US in diagnosis of PTX together with US-guided thoracentesis results in earlier and more precise management. The recommendations presented in this publication are aimed at improving the application of lung US in guiding neonatal PTX diagnosis and management.

Pneumothorax is a common emergency and critical disease in newborn infants that needs rapid, clear diagnosis and timely treatment. Diagnosis and treatment based on chest X-rays are associated with delayed management and radiation damage. Lung ultrasound (US) provides useful guidance for rapid, accurate diagnosis and the precise thoracentesis of pneumothorax.

הסכמה בינלאומית מומחה והמלצות לאבחון ואולטרסאונד של בעלי חזה אוויר ואולטרא סאונד-נוזלי נוהל מודרך

Pneumothorax (PTX) represents accumulation of the air in the pleural space. A large or tension pneumothorax can collapse the lung and cause hemodynamic ...

Diagnosis and Surgical Treatment of Human Brucellar Spondylodiscitis

Brucellar spondylodiscitis (BS) is the most prevalent and significant osteoarticular presentation of human Brucellosis, which is commonly manifested in pastoral communities. It is difficult to differentially diagnose and usually leads to irreversible neurologic deficits and spinal deformities. The initial diagnosis of BS is based on clinical findings and radiographic assessments, and the confirmed diagnosis should be established by the isolation of Brucella species from the blood and/or the standard tube agglutination test. Differential diagnosis of multifocal BS from either degenerative disc diseases or tuberculosis is especially highlighted. The surgical approach, either endoscopic or open, is demonstrated in detail, accompanied by radiographic evidence of structural compression or severe instability. Further, the crucial surgical steps, including single-stage transforaminal decompression, debridement, interbody fusion, and internal fixation, are explained. Moreover, perioperative care and postoperative rehabilitation are also addressed. Taken together, this clinical algorithm presents a practical guide that has yielded substantially satisfactory outcomes in the past decades, which can also be introduced for large-scale application to manage human BS, especially in endemic regions.

We describe a clinical algorithm, based on decades of front-line experience of diagnosis and surgical treatment of human Brucellar spondylodiscitis in the largest medical center of the China's Xinjiang Pastoral Area.

אבחון וטיפול כירורגי של דלקת ברוסלאר Spondylodiscitis אנושי

Brucellar spondylodiscitis (BS) is the most prevalent and significant osteoarticular presentation of human Brucellosis, which is commonly manifested in ...

Testing Acetylcholine Followed by Adenosine for Invasive Diagnosis of Coronary Vasomotor Disorders

More than 50% of patients with signs and symptoms of myocardial ischemia undergoing coronary angiography have unobstructed coronary arteries. Coronary vasomotor disorders (impaired vasodilatation and/or enhanced vasoconstriction/spasm) represent important functional causes for such a clinical presentation. Although impaired vasodilatation may be assessed with non-invasive techniques such as positron emission tomography or cardiac magnetic resonance imaging, there is currently no reliable non-invasive technique for the diagnosis of coronary spasm available. Thus, invasive diagnostic procedures (IDP) have been developed for the diagnosis of coronary vasomotor disorders including spasm testing as well as assessment of coronary vasodilatation. The identification of the underlying type of disorder (so called endotype) allows the initiation of targeted pharmacological treatments. Despite the fact that such an approach is recommended by the current European Society of Cardiology guidelines for the management of chronic coronary syndromes based on the CorMicA study, comparability of results as well as multicenter trials are currently hampered by major differences in institutional protocols for coronary functional testing. This article describes a comprehensive IDP protocol including intracoronary acetylcholine provocation testing for diagnosis of epicardial/microvascular spasm, followed by Doppler wire-based assessment of coronary flow reserve (CFR) and hyperemic microvascular resistance (HMR) in search of coronary vasodilatory impairment.

Coronary vasomotion disorders represent frequent functional causes of angina in patients with unobstructed coronaries. The underlying mechanism of angina (endotype) in these patients can be determined by a comprehensive invasive diagnostic procedure based on acetylcholine provocation testing followed by Doppler-derived assessment of the coronary flow reserve and microvascular resistance.

בדיקת אצטילכולין ואחריו אדנוזין לאבחון פולשני של הפרעות וזומוטוריות כליליות

More than 50% of patients with signs and symptoms of myocardial ischemia undergoing coronary angiography have unobstructed coronary arteries. Coronary ...

Measurement of Myocardial Lactate Production for Diagnosis of Coronary Microvascular Spasm

In about a quarter of patients with angina and non-obstructive coronary arteries, no epicardial spasm is noted on coronary arteriography during an angina attack. Since the pressure-rate product is almost identical at rest and the onset of attack in those patients, the decrease in coronary blood flow rather than increased myocardial oxygen consumption is likely to explain myocardial ischemia, indicating a substantial involvement with coronary microvascular spasm (MVS). Myocardial lactate production, which could be defined as a negative myocardial lactate extraction ratio (ratio of the coronary arterial-venous difference in lactate concentration to arterial concentration), is considered indicative of objective evidence to support the emerging myocardial ischemia. Thus, monitoring of the myocardial lactate production and the emergence of chest pain and ischemic electrocardiographic changes during acetylcholine (ACh) provocation testing is of significant value for detecting the entity of MVS. Practically, 1 min after incremental doses of ACh (20, 50, and 100 &#956;g) are administered into the left coronary artery (LCA), paired samples of 1 mL of blood are collected from the LCA ostium and coronary sinus for measurement of lactate concentration by a calibrated automatic lactate analyzer. Then, the development of MVS could be confirmed by negative myocardial lactate extraction ratio despite the absence of angiographically demonstrable epicardial coronary spasm or before its occurrence throughout ACh provocation testing. In conclusion, assessment of myocardial lactate production is essential and valuable for the diagnosis of MVS.

Myocardial lactate production (coronary arterial-venous difference in serum lactate level) during coronary spasm provocation testing is considered as a highly sensitive marker that reflects acetylcholine-induced myocardial ischemia due to microvascular spasm. This article presents the procedures to assess myocardial lactate production for the diagnosis of coronary microvascular spasm.

מדידת ייצור לקטט שריר הלב לאבחון עווית כלי דם כלילית

In about a quarter of patients with angina and non-obstructive coronary arteries, no epicardial spasm is noted on coronary arteriography during an angina ...

High-speed Video Microscopy Analysis for First-line Diagnosis of Primary Ciliary Dyskinesia

Primary ciliary dyskinesia (PCD) is a congenital disorder predominantly inherited in an autosomal recessive trait. The disorder causes disturbance in the motion of cilia, leading to severe impairment of mucociliary clearance (MCC). If undiagnosed or diagnosed too late, the condition leads to the development of bronchiectasis and serious damage to the lungs in later life. Most of the methods for diagnosing PCD are time-consuming and demand extensive economic resources to establish them. High-speed video microscopy analysis (HSVMA) is the only diagnostic tool to visualize and analyze living respiratory cells with beating cilia in vitro. It is fast, cost-effective, and, in experienced hands, very reliable as a diagnostic tool for PCD. In addition, classical diagnostic measures such as transmission electron microscopy (TEM) are not applicable for some mutations as morphological changes are absent. 
This paper describes the process of collecting respiratory epithelial cells, the further preparation of the specimen, and the process of HSVMA. We also describe how brushed cells can be successfully kept unharmed and beating by keeping them in a nourishing medium for storage and transport to the investigation site in cases where a clinic does not possess the equipment to perform HSVMA. Also shown are videos with pathologic beating patterns from patients with a mutation in the dynein arm heavy chain 11 gene (DNAH11), which cannot be diagnosed with TEM; the result of an inconclusive HSVMA due to infection of the upper airways, as well as an unsuccessful brushing with superimposition of red blood cells. With this article, we would like to encourage every unit dealing with pulmonology patients and rare lung diseases to perform HSVMA as part of their daily routine diagnostics for PCD or send the specimens over to a center specializing in performing HSVMA.

High-speed video microscopy analysis is a relatively easy-to-perform, fast, cost-effective, and, in experienced hands, a considerably reliable tool for first-line diagnostics of primary ciliary dyskinesia, which should be available in every center involved in diagnostics and the treatment of severe lung diseases.

ניתוח מיקרוסקופיית וידאו במהירות גבוהה לאבחון קו ראשון של דיסקינזיה סילארית ראשונית

Primary ciliary dyskinesia (PCD) is a congenital disorder predominantly inherited in an autosomal recessive trait. The disorder causes disturbance in the ...